非編碼RNA對哺乳動物精子發生過程的調控

陳瑞，于帥，陳曉旭，杜健，朱振東，潘傳英，曾文先

（1西北農林科技大學創新實驗學院，陜西楊凌 712100；2西北農林科技大學動物科技學院，陜西楊凌 712100）

非編碼RNA對哺乳動物精子發生過程的調控

陳瑞1,2，于帥2，陳曉旭2，杜健2，朱振東2，潘傳英2，曾文先2

（1西北農林科技大學創新實驗學院，陜西楊凌 712100；2西北農林科技大學動物科技學院，陜西楊凌 712100）

精子發生始于精原干細胞（spermatogonial stem cells, SSCs），SSCs一部分自我更新，另一部分首先分裂形成Asingle（As）型精原細胞，進而形成Aparied（Apr）型精原細胞和Aaligned（Aal）型精原細胞；隨后，Aal型精原細胞再發育為A1-A4型精原細胞、中間型精原細胞以及B型精原細胞；B型精原細胞有絲分裂可形成初級精母細胞，經歷前細線期、細線期、偶線期、粗線期，再經減數分裂形成次級精母細胞；當圓形精子細胞形成之后，則經細胞核濃縮等過程形成晚期的細長型成熟精子，隨之最終變形成為精子。這一復雜的生理過程需要相關基因的適時表達，并受到轉錄和轉錄后水平的調控。研究表明，多種類型的非編碼RNA (ncRNAs)在精子發生過程中發揮著重要作用。ncRNAs包括微小RNAs (miRNAs)、與Piwi蛋白相互作用的RNAs (piRNAs)、長鏈非編碼RNAs (lncRNAs)、環狀RNAs（circRNAs）以及內源性小干擾RNAs (endo-siRNAs)等。這些ncRNAs的表達具有細胞組織特異性和發育階段特異性，可從時間和空間上精確調控精子發生的整個過程。miRNAs是一類長約 21—25 nt的內源性非編碼單鏈RNA分子，廣泛存在于各種生物中，其形成至少需要Drosha和Dicer等兩種RNA酶的參與，可降解靶mRNA或抑制靶mRNA翻譯，對SSCs干性的維持、自我更新和分化的調控以及生殖細胞減數分裂和精子發生過程具有重要的調控作用。此外，精子發生過程中，在生殖細胞不同階段所表達的基因也可調控miRNAs的生成加工過程。piRNAs是2006年發現的一種新的小RNA，長度約24—32nt，其作用與Dicer酶無關，能夠與生殖細胞特異性蛋白Piwi蛋白家族成員結合，進而行使生物學功能，其主要表現為：在表觀遺傳水平和轉錄后水平沉默轉座子、反轉座子等基因組移動遺傳元件，維持生殖細胞自身基因組穩定性和完整性，調控生殖細胞增殖、減數分裂及精子發生過程。LncRNAs是一類長度大于200 nt的ncRNAs，其生成加工過程與mRNA類似，并且與mRNA有著相似的結構。不同來源的lncRNAs可通過轉錄前與轉錄后多種機制進而調控SSCs的干性及分化，并且調控生殖細胞凋亡。有些lncRNAs還可調控miRNAs的表達，進而調控精子發生過程。circRNAs是區別于傳統線性RNA的一類新型 RNA，在不同物種中具有保守性，在組織及不同發育階段呈特異性表達。其生成加工方式與其序列相關，同一基因位點可通過選擇性環化產生多種circRNAs進而發揮功能。研究表明，circRNAs可結合miRNAs從而調控生精過程。相對于其他ncRNAs，endo-siRNAs的生成加工方式更為簡單，并有著與miRNAs相同的作用方式，在精子發生和雄性生殖中扮演著重要角色。文中結合最新的研究進展，綜述了幾種ncRNAs的生成及其在精子發生過程中的調控作用，旨在為精子發生過程中ncRNAs的進一步研究提供參考。

精子發生；非編碼RNA (ncRNAs)；調控作用

精子發生是一個復雜的生理過程，包括有絲分裂、減數分裂、精子的形成與成熟[1]。該過程需要相關基因的適時表達，并受到轉錄和轉錄后水平的調控[2]。研究發現，超過1 000種編碼蛋白的基因在精子發生中發揮作用[3-7]。然而，這些基因轉錄和翻譯調控的分子機制尚不清楚。研究表明，多種類型的非編碼RNA（ncRNAs）在睪丸發育和精子發生過程中發揮著重要作用。這些ncRNAs的表達具有細胞組織特異性和發育階段特異性，可參與精子發生過程中生殖細胞分化的調控。ncRNAs包括微小RNAs（miRNAs），與Piwi蛋白相互作用的RNAs（piRNAs），長鏈非編碼RNAs（lncRNAs），環狀RNAs（circRNAs）和內源性小干擾RNAs (endo-siRNAs)等。目前，關于ncRNAs 在精子發生過程中的研究主要集中在miRNAs和piRNAs，新近有文獻報道lncRNAs，circRNAs和endo-siRNAs也參與精子發生的調控。本文結合最新的研究進展，對 miRNAs、piRNAs、lncRNAs、circRNAs、endo-siRNAs的生成及其對精子發生的調控作用進行綜述，以期為ncRNAs對大家畜精子發生的調控研究積累科學資料。

1 精子發生

精子發生是繁衍后代的基礎，不同物種的精子發生周期不盡相同，豬的精子發生周期一般為40 d，綿羊為50 d，山羊為60 d，牛為54—60 d，小鼠為35 d，而人則需要72 d[8]。精子的發生位于成年雄性動物睪丸的曲細精管中，是一個精確、復雜、高效的過程，主要包括3個階段[1]：第一階段為精原細胞的增殖階段，該階段中精原干細胞（spermatogonial stem cells，SSCs）經多次有絲分裂形成大量的精原細胞。小鼠SSCs 約 經 歷 A-single(As)， A-paired(Apr)，A-aligned(Aal)，A1型，A2型，A3型，A4型，中間型及B型精原細胞這8次有絲分裂，最終形成前細線期的精母細胞。隨后，初級精母細胞開始DNA合成過程。第二階段為精母細胞的減數分裂階段，在該階段，前細線期精母細胞穿過血睪屏障并向近腔室方向移動，同時起始減數分裂，產生單倍體生精細胞（又稱精子細胞）。第三階段為精子細胞的變形階段，圓形精子細胞經過復雜的變化轉變為具有細長尾巴及運動能力的精子。

精子發生的每一個階段都受到多種因素的精密調控，在這些調控因素中，表觀遺傳修飾發揮著至關重要的作用。精子中的表觀遺傳修飾包括 ncRNAs，組蛋白修飾，DNA甲基化，基因組印記，X染色體失活，表觀隔代遺傳與其他涉及染色質重塑的調節機制。在雄性動物精子發生過程中存在著大量的表觀調控因子，其中一部分調控因子的功能及機制已被闡明。例如，精子DNA的異常組裝會導致雄性小鼠不育，這可能是由于參與DNA重構的相關蛋白調控異常所導致的[9]。YAN等研究發現，H1LS（spermatid-specific linker histone H1-like protein）是精子細胞中特異存在的組蛋白H1的相似蛋白，其參與精子發生過程中染色質的重塑[10]。MARTIANOV 等在圓形精子細胞中發現了H1T2（histone H1 variant）的存在，其在染色質濃縮過程中發揮作用[11]。研究表明，魚精蛋白的不正常表達會降低雄性動物的精液質量，從而引發生殖能力的減弱[12]。基因組印記則保證了父本和母本一方的基因在印跡位點的正確表達，這個過程主要是由DNA甲基化修飾調節的。除此之外，ncRNAs對精子發生也起著關鍵作用。

2 ncRNAs與精子發生

ncRNAs在雄性生殖發育過程中發揮著重要作用，從時間和空間上精確調控著精子發生的整個過程。研究表明，其在性別分化、雄性性行為以及生殖細胞發育過程中不可或缺，此外，ncRNAs對生殖干細胞干性維持、精原細胞分化及精母細胞減數分裂過程發揮著重要的調控作用。

2.1 miRNAs與精子發生

2.1.1 miRNAs的形成和作用機制 miRNAs是一類長約 21—25 nt的內源性非編碼單鏈RNA分子，具有高度保守性、時序性和組織特異性，對轉錄和轉錄后的基因表達調控起關鍵作用。miRNAs的形成至少需要Drosha和Dicer等兩種RNA酶的參與。絕大多數miRNA可在RNA聚合酶Ⅱ的作用下形成長的莖環結構，即初級miRNA（primary miRNA，pri-miRNA），隨后被定位于細胞核中的Drosha-DGCR8復合體所剪切，釋放出長度約 70 nt的發夾狀 RNA，成為前體miRNA（precursor miRNA，pre-miRNA）[13-15]。 pre-miRNA在輸出蛋白 Exportin-5（Exp5）的作用下從細胞核轉運至細胞質中[16-17]，并在胞質中被 Dicer剪切產生約為22 nt的miRNA雙鏈，最終miRNA的雙鏈解鏈形成成熟的miRNA[18]。成熟的miRNA與沉默復合體（RNA-induced silencing comlex，RISC）結合，形成miRNP識別靶基因從而發揮作用。

大量研究證明, miRNA可降解靶mRNA或抑制靶mRNA翻譯。進入RISC復合體的miRNA，如果miRNA與靶mRNA匹配完全，RISC則降解mRNA；若miRNA與靶基因mRNA 的3’UTR序列不完全配對, 則抑制靶基因mRNA的翻譯來沉默特定基因[19-20]。

2.1.2 miRNAs在真核模式動物精子發生中的作用1993年，LEE等在線蟲中發現了第一個 miRNA—Lin-4基因[21]。2000年，REINHART等在果蠅中發現了另一個miRNA—Let7基因及其靶基因lin-4[22]。此后，人們便廣泛關注這一 RNA分子。在果蠅中，miR-124作用可產生異常激素，并導致miR-124缺失突變體的雄性果蠅減少與雌性果蠅的交配率，甚至出現了雄-雄求偶的現象。與此同時，雌性果蠅與野生型雄果蠅交配表現出的渴望遠遠超過與miR-124缺失突變體的交配[23]。盡管miR-124突變體表現出更少的交配，但當只有miR-124突變體存在時仍可成功交配，表明其在自然競爭環境中處于劣勢地位。最新研究表明，如果在成年果蠅體內去除miRNA，則會導致不育，同時，這些果蠅開始產生雄性和雌性兩種性別決定因子。從某種意義上說，一旦它們失去了這種miR-124，果蠅就變成了雌雄雙性體，提示，即使在動物長大成熟以后，miRNAs對于性別決定也必不可少，它們可以發送信號讓卵子和精子發育，從而保證動物的生育能力[24]。這些研究表明，miRNAs對雄性的性分化和性行為具有重要的調控作用。

2.1.3 miRNAs在哺乳動物精子發生中的作用miRNAs對SSCs干性的維持發揮著重要作用。已有文獻報道，哺乳動物 SSCs可表達 miR-20，miR-21，miR-34c，miR-135a，miR-182，miR-183，miR-146a，miR-204和miR-544[25-28]。在小鼠中，miR-20，miR-21和 miR-106a可參與 SSCs動態平衡的調控[25，29]。miR-34在山羊SSCs中表達并促進p53依賴性的細胞凋亡[27]。miR-544可通過調節早幼粒細胞白血病鋅指基因（promyelocytic leukemia zinc finger，PLZF）進而調節山羊SSCs的自我更新[30]。此外，有些miRNAs參與精原細胞分化的調節。在維甲酸（retinoic acid，RA）誘導精原細胞分化時發現 miR-146[31]，let 7miRNAs家族[32]，miR-17-92和 miR-106b-25[33]表達的下調。在細胞水平上，研究人員比對了小鼠干細胞和已分化細胞的 miRNA的差異表達，發現了一些干細胞特有的miRNA，推測它們參與細胞分化過程，同時也是維持細胞干性所必需的。有些miRNAs的表達具有組織細胞特異性，表明它們可能參與了分化細胞的維持[4]。

miRNAs在生殖細胞減數分裂和精子發生過程中發揮著重要作用。YAN等[34]利用芯片技術比較了未成熟與成熟小鼠睪丸中miRNAs的表達情況，發現有19種miRNAs在這兩種睪丸中存在顯著的差異表達，表明這些miRNAs可能對睪丸的發育產生影響。研究表明，miRNA-122a主要在雄性生殖細胞晚期階段表達，可抑制圓形精子標志物的轉換蛋白 2（Transition protein 2, TP2）的轉錄[35]。miRNA微陣列、RT-PCR或小RNA序列研究證實，miRNAs高度、廣泛、優先的在睪丸和雄性生殖細胞分化的各階段表達。YADAV等研究發現，SSCs、精原細胞、精母細胞和精子中會表達幾種相同的miRNAs，如miR-34c既存在于 SSCs中，調控其狀態，又在精母細胞和圓形精子細胞中表達，在精子發生后期發揮重要作用[36]；但有一些 miRNAs只在特定的細胞類型中表達。miR-17-92簇通過下調E2f1防止生殖細胞在減數分裂期發生凋亡[37]。miR-18在精母細胞中高表達，并作用于雄性小鼠生殖細胞發育的調控因子Hsf2，從而調控精子的發生過程[38]。最新研究表明，miR-449在睪丸發育和成年小鼠精子發生減數分裂起始時期高表達，其表達模式與miR-34b/c在精子發生過程中類似。WU等發現miR-449或miR-34位點的突變不會引起雄性小鼠生殖表型的改變，然而miR-449和miR-34的失活會導致不育[39]。此外，miR-34c還高表達于小鼠粗線期精母細胞和精子細胞中，并通過Atf1調節生殖細胞的活力[40]。Tp和Prm的適時表達是精子發生過程中染色質凝縮的先決條件。miR-469可以靶向抑制粗線期精母細胞和圓形精子細胞中Tp和Prm的mRNAs的翻譯[41]，而miR-122a則可介導Tp2的mRNA的降解[35]。

綜上所述，miRNAs在精子發生中呈差異性表達，與 SSCs干性的維持、精子生成及生殖細胞減數分裂中基因轉錄后的調控關系密切，在生殖系統中起到重要的調節作用。

2.2 piRNAs與精子發生

2.2.1 piRNAs的形成和作用機制 piRNAs是指與生殖細胞特異性 Piwi蛋白家族成員相結合才能發揮作用的RNA[42]，具有調控基因沉默和維持基因組穩定的功能。piRNAs在抑制轉座子活性和維持基因組穩定性方面起重要作用，但其發生和調控的分子機制仍不清楚。果蠅生殖細胞為研究這一機制提供了良好的模型。果蠅生殖細胞中piRNAs的發生包括兩種途徑：初級加工途徑（primary processing pathway）和“乒乓循環”擴增途徑（Ping-Pong amplification loop）。大多數piRNA序列都對應于范圍較小的基因組區域，這些區域被稱為piRNA簇。這些piRNA 簇經轉錄可得到長單鏈piRNA前體，隨后經過不依賴于Dicer酶的加工機制，生成初級piRNA。在成熟之后，piRNAs與Piwi蛋白相互作用形成piRNA沉默誘導復合物（piRISCs），介導piRISCs通過RNA-RNA堿基互補配對靶向結合轉錄本。已有的假說表明，在乒乓循環的過程中，Piwi家族成員Aub和Ago3通過piRNAs識別的靶RNA進行靶向剪切，使得piRNAs得到次級循環擴增[43]。

2.2.2 piRNAs在真核模式動物精子發生中的作用Piwi蛋白是Argonautue（Ago）蛋白家族的一個分支，首次在果蠅中發現，對生殖干細胞干性的維持起著重要作用[44]。果蠅中，已經鑒定出5種Ago蛋白：Ago1，Ago2，Ago3，Piwi和Aubergine（Aub）[45]。Ago3，Piwi和Aub與非編碼小RNA的另一個成員：重復相關小RNA（repeat associated small interfering RNAs，rasiRNAs）也存在相互作用關系[46]。rasiRNA最初發現于胚胎期的果蠅和斑馬魚中[47-48]，之后，又在果蠅的生殖細胞中檢測到了rasiRNA的存在。rasiRNA與Piwi蛋白相結合可能在生殖細胞中沉默逆轉錄轉座子和重復元件來調節果蠅生殖系的發育，它的沉默機制可能與piRNA的調節方式存在一定的關系[49]。

Piwi亞家族主要有3個成員：Miwi，Mili和Miwi2。果蠅Piwi在生殖細胞和支持細胞的細胞核中表達，而Miwi和Mili卻存在于胞質中。此外，果蠅Piwi突變不但導致精子發生障礙，同時也對生殖細胞的維持產生影響。Piwi突變的果蠅在小RNA依賴性的轉基因和逆轉座子沉默上存在缺陷，同時喪失了異染色質蛋白[50]。表明，piRNA能夠沉默轉座子，并能防止DNA受損。隨后，研究人員通過功能缺失突變試驗發現，Piwi的缺失也會導致線蟲生殖細胞發育受阻[51]。果蠅的Aub可能與Miwi和Mili更具同源性，因為Aub存在于精原細胞和精母細胞的細胞質中，Aub功能的缺失會導致精母細胞和圓形精子細胞的不正常發育。最新研究表明，piRNA可調控性別決定基因Bmdsx的表達，在家蠶性別決定過程中發揮關鍵作用[52]。斑馬魚中兩個已知的Piwi蛋白是Ziwi和Zili，其中Ziwi在雄性和雌性個體中都有表達。Ziwi在斑馬魚中作為一個胞內蛋白，可能兼有Ago3和Aub的功能。Ziwi水平的降低會導致生殖細胞發生凋亡[53]。有趣的是，Ziwi在斑馬魚中也可決定性別發展方向，這表明piRNA可能是性別決定調控的重要因素。

2.2.3 piRNAs在哺乳動物精子發生中的作用piRNA 與 Piwi亞家族蛋白結合可形成 piRISCs, piRISCs通過抑制基因轉錄后的調節及基因在精子發生過程中的異常表達, 從而調控精子發生。Piwi亞家族蛋白Miwi、Mili和Miwi2等在哺乳動物干細胞自我更新及雄性生殖細胞發育過程中發揮重要作用[54-55]。哺乳動物Miwi、Miwi2、Mili蛋白表達于生殖細胞中后期，是小鼠精子發生所必需的。敲除Miwi、Mili或 Miwi2基因，都會使精子產生明顯缺陷，導致雄性不育。Mili蛋白存在于精母細胞胞質、圓形精子細胞擬染色質小體和胞質中，在翻譯和維持mRNA的穩定性方面發揮作用。在敲除Mili的小鼠中，精子發生會停止在粗線期精母細胞階段[56]。Miwi表達于粗線期至圓形精子時期，敲除 Miwi時，會使精子發生停止在圓形精子階段，不能形成長形精子。Miwi蛋白的失活會導致精子細胞時期 L1轉座子的調節異常和生精功能障礙[57]。Miwi與piRISCs結合可形成有脫腺苷作用的復合體，也稱染色質組裝因子1（Caf1），它可以促進脫腺苷化和長形精子中mRNAs的衰退[58]。敲除Miwi2的小鼠在減數分裂早期產生缺陷，并且生殖細胞會隨著年齡的增長而產生缺失。Miwi2突變體中生殖細胞表型的損失，證明了小鼠中的Miwi2和果蠅中的 Piwi在維持生殖系和干細胞時起著相似的作用[55]。

小鼠基因組中的 Piwi蛋白在雄性生殖細胞的分化過程中受時間和空間上的調控，可調控精子發生。在小鼠雄性生殖細胞發育過程中，在兩個不同階段表達的 piRNAs被分別命名為粗線期前期 piRNAs（pre-pachytene piRNAs）和粗線期piRNAs（pachytene piRNAs）[58]。粗線期前期piRNAs富含轉座子序列，在精子發生早期與Miwi2或Mili共表達，主要參與胎兒及圍產期雄性生殖細胞DNA的從頭甲基化。而粗線期piRNAs主要由粗線期精母細胞和減數分裂后精細胞的非轉座子基因間區誘導生成，同Miwi結合，但其在精子分化過程中逐漸消失，提示，其可能對減數分裂時相順序的精確進行具有調控作用，進而確保具有正常功能的精子生成[59]。最新的研究表明，E3泛素化連接酶和后期促進復合物（APC）能使 Miwi蛋白在精子發生過程中發生泛素化修飾，并通過泛素蛋白酶體途徑降解。此外，這些能夠激活Miwi蛋白降解的 piRNA也能使自身降解，這表明 Miwi與piRNAs在精子發生中完成了相應作用以后，二者之間也存在著一個正反饋調控[60]。

由此可見，piRNAs主要參與雄性生殖細胞基因組穩定性的維持，調節生殖細胞自我更新以及減數分裂過程，在精子發生中起沉默轉錄元件的作用。

2.3 lncRNAs與精子發生

2.3.1 lncRNAs的形成和作用機制 lncRNAs是一組內源性、長度超過200 nt、缺乏蛋白質編碼能力的RNA分子，包括增強子RNA、基因間轉錄本以及與其他轉錄本同向或反向重疊的轉錄本。與mRNA類似，大多數lncRNAs由RNA聚合酶Ⅱ轉錄，經可變剪切形成，并通常被多聚腺苷酸化[61]。近年來的研究發現lncRNAs可能具有以下幾方面功能：（1）通過在蛋白編碼基因上游啟動子區發生轉錄，干擾下游基因的表達。（2）通過抑制RNA聚合酶II或者介導染色質重構以及組蛋白修飾，影響下游基因表達。（3）通過與蛋白編碼基因的轉錄本形成互補雙鏈，進而干擾mRNA的剪切，從而產生不同的剪切形式。（4）通過與蛋白編碼基因的轉錄本形成互補雙鏈，進一步在Dicer酶作用下產生內源性的 siRNA，調控基因的表達。（5）通過結合到特定蛋白質上，調節相應蛋白的活性。（6）作為結構組分與蛋白質形成核酸蛋白質復合體。（7）通過結合到特定蛋白上，改變該蛋白的胞質定位。（8）作為小分子RNA，如miRNA，piRNA的前體分子轉錄[62]。

2.3.2 lncRNAs在精子發生中的作用 lncRNAs在睪丸發育過程中發揮著重要作用。SUN等利用基因芯片技術分析小鼠出生后睪丸組織的發育情況，共檢測到8 265種lncRNAs，其中3 025種lncRNAs存在差異表達[63]。2013年，LAIHO等在研究7，14，17，21和28 d小鼠睪丸基因表達量時發現，精子發生階段共有947種lncRNAs的表達上調，這些lncRNAs特定的出現在生殖細胞發育的不同階段[64]。同年，BAO等利用基因芯片技術比較了雄性生殖細胞發育關鍵時期（12.5 dpc 、15.5 dpc、7 dpp、14 dpp、21 dpp、成年）lncRNAs的表達情況，結果表明，有數千種lncRNAs的表達被上調或下調。此外，大多數lncRNAs與編碼蛋白的基因有關，這些編碼蛋白的基因表達水平與lncRNAs相關聯，其在基因組中的位置通常靠近lncRNAs[65]。另有一些研究人員發現小鼠中含有3 639種在 A型精原細胞特定表達的 lncRNAs，其中，98種表達于粗線期精母細胞，166種表達于圓形精子細胞[66]。2014年，CHALMEL等發現lncRNAs會在鼠類減數分裂和精子發生時期富集[67]。

盡管在睪丸組織和雄性生殖細胞中鑒定出了數千種lncRNAs，但只有少數的幾種知曉功能。筆者將已知功能的 lncRNAs分為位于常染色體上的 lncRNAs和位于性染色體上的lncRNAs兩類：

（1）位于常染色體上的lncRNAs Mrhl（減數分裂重組熱點位點）RNA是一個核富集的lncRNAs，位于小鼠第8號染色體上，長度為2.4kb。在小鼠精原細胞的GC-1 Spg細胞系中沉默Mrhl RNA，會導致與細胞粘附、細胞信號轉導和細胞發育及分化相關基因的表達發生紊亂，這些基因大多在Wnt信號通路中發揮重要作用。Mrhl RNA通過與p68的互作在Wnt信號通路中發揮負調控作用[68]。

HongrES2是位于小鼠5號和19號染色體上，長度為1.6kb的轉錄嵌合物，在附睪尾部的特定區域表達。它是類似于miRNA的lncRNA，也是mil-HongrES2的前體。mil-HongrES2能夠抑制嚙齒動物Ces7的表達和固醇酯酶的活性。當mil-HongrES2過表達時，會導致精子獲能遲緩。提示，lncRNAs在小鼠的附睪中發揮著重要作用[69]。

NLC1-C也稱為基因間RNA162（LINC00162），位于人類21號染色體上。與正常人相比，在不育男性睪丸組織中，精原細胞和精母細胞胞質中的 NLC1-C含量較低，而細胞核中含量較高。NLC1-C在細胞核中抑制miR-320a和miR-383的轉錄。同時，通過與核仁蛋白的結合促進體外培養的睪丸胚胎癌細胞增殖。這些結論表明NLC1-C通過與RNA結合蛋白結合，進而在轉錄水平上調節 miRNA的表達，從而調節人類精子發生過程[70]。

spga-lncRNAs是精子發生過程中特定表達的lncRNA，包括spga-lncRNA1和spga-lncRNA2。它們是從一組lncRNAs（109個，都只含一個外顯子）中被鑒定出來的，這些lncRNAs在A型精原細胞、粗線期精母細胞和圓形精子細胞中表達[71]。這兩種 spgalncRNAs被認為是A型精原細胞分化的抑制因子，暗示了它們在SSCs干性維持方面發揮著重要作用。

（2）位于性染色體上的lncRNAs Tsx（核苷特異通道形成蛋白）曾被認為是蛋白編碼基因，直至2011年，Anguera等人證實其為lncRNAs的一種。Tsx在粗線期精母細胞中特異性表達，在精原細胞和圓形精子細胞中不表達。在小鼠中敲除Tsx基因，會促進更多的粗線期精母細胞發生凋亡，這證實了其在減數分裂過程中發揮著重要功能[72]。

Dmrt1（doublesex and mab-3 related transcription factor 1）蛋白作為一種重要的轉錄因子，可促進精子和卵子發生過程中特異堿性螺旋-環-螺旋蛋白 1（Sohlh1）的表達，同時抑制Stra8（retinoic acid gene 8）的表達，進而促進精子發生。Dmr（Dmrt1-related gene）的轉錄產物是lncRNA的一種，它可破壞Dmrt1的編碼區，并置換Dmrt1的3′UTR區域，導致Dmrt1蛋白表達量的降低，進而影響精子發生[73-74]。

lncRNAs雖然很久以前就被發現，但直到近年才逐漸被關注。與生殖相關的lncRNAs主要參與SSCs干性及分化、生殖細胞減數分裂的調控；有些lncRNAs還可調節miRNAs的表達，從而調控精子發生過程。

2.4 circRNAs與精子發生

2.4.1 circRNAs的形成和作用機制 環狀 RNA（circular RNAs，circRNAs），是區別于傳統線性RNA的一類新型RNA，它不具有5′末端帽子和3′末端poly（A）尾巴，但以共價鍵形成閉合環狀結構。circRNAs在不同物種中具有保守性，在組織及不同發育階段呈特異性表達。研究表明，circRNAs在多種生物細胞中廣泛表達，同一基因位點或許可通過選擇性環化產生多種circRNAs，其在轉錄或轉錄后水平對基因表達調控具有重要作用。假設產生 circRNAs的基因含有 4個外顯子，分別命名為exon1、exon2、exon3和exon4，則circRNAs可能產生的4種模型為：（1）內含子配對（intron pairing）驅動的環化：位于外顯子側翼的內含子之間存在互補序列，其可直接通過堿基配對來誘導環化，最終產生Exonic circRNA 或ElciRNA。（2）RNA結合蛋白（RBP）配對（RBP pairing）驅動的環化：結合到外顯子側翼內含子上的 RBP之間相互作用，最終驅動exon2 與exon3首尾連接進而環化。（3）外顯子跳躍（exon skipping）與套索（intra-lariat）驅動的環化：前體 RNA部分折疊而發生外顯子跳躍，使exon1的3′端剪接配體與exon4的5′端剪接受體共價結合，形成一個包含exon2及exon3的套索結構，進一步環化產生circRNA。（4）ciRNA的環化：內含子自身環化，形成ciRNA[75-78]。

2.4.2 circRNAs在精子發生中的作用 自circRNAs被發現來，一些來源于真核生物基因組的 circRNAs被鑒定出來。例如，Y染色體性別決定基因（SRY基因），由一個外顯子組成，在小鼠睪丸組織中高表達。在發育早期，其轉錄物可作為蛋白質合成的模板，并以線性 RNA的形式存在。但在成年睪丸中，它的RNA主要以環狀的形式存在于細胞質中，且不具翻譯功能。進一步研究發現，基因組序列兩側的SRY基因外顯子的反向重復序列可直接轉錄成circRNA。HANSEN等研究發現，SRY基因的環狀轉錄物含有16個miR-138的結合位點，其可抑制 miR-138的活性，從而調控miR-138靶基因的表達水平[79]。提示，circRNAs可以調控miRNA進而對精子發生產生作用。但目前關于circRNAs的研究還不深入，有待進一步研究。

2.5 Endo-siRNAs與精子發生

Endo-siRNAs首次報道于模式生物中，例如果蠅[80]和小鼠[81]。與miRNAs不同，endo-siRNAs的生成不需要Drosha-DGCR8復合物，它們可以由前體細胞中正義或反義RNA，或者長發夾結構的長雙鏈RNA（dsRNA）加工而成[82]。

2009年，HAN等在秀麗隱桿線蟲中發現了長為26 nt的endo-siRNAs，稱為26G endo-siRNAs。26 G RNA基因可以調節精子發生和合子發育過程。值得關注的是，試驗中發現了兩個26G RNAs 亞類，其中，第一類26G RNAs的靶基因在精子發生過程中表達，第二類26G RNAs來源于母系遺傳，其可在合子發育過程中沉默相關基因的表達[83]。

2015年，WU等在小鼠細胞系中條件性敲除Drosha或Dicer，發現睪丸中endo-siRNAs的合成需要 Dicer的參與，但與 Drosha無關[84]。在果蠅中，hpRNAs（hairpin RNA）被認為是endo-siRNAs的一種，其在睪丸中高表達[85]。在小鼠中，endo-siRNAs在胚胎干細胞中豐富表達，其次是SSCs，在成熟生殖細胞中表達最低[86]。對原始生殖細胞、卵母細胞和受精卵中的短鏈非編碼 RNA（sncRNAs）的功能分析指出，小RNA和小核仁RNA（snoRNAs）都可在原始生殖細胞中廣泛表達，但僅持續片刻便會被精子中的干擾RNA和卵母細胞與受精卵中的endo-siRNAs所替代[87]。在小鼠和其他哺乳動物中，生殖細胞特異性蛋白 Dicer可以影響減數分裂進而導致雄性不育、精母細胞凋亡的增加和缺陷精子的產生。Drosha敲除小鼠會產生有缺陷的miRNA途徑，但存在完整的 endo-siRNAs途徑。雖然這些研究揭示了 endosiRNAs在哺乳動物精子發生和雄性生殖中的扮演著重要角色[88]，但其在SSCs干性維持、精子變形等過程是如何發揮調控作用的還有待進一步研究。

3 展望

睪丸的發育決定著種群繁殖的質量和優良種公畜的利用價值，對睪丸發育的研究也從最初的睪丸形態組織學觀察，到編碼基因功能的調控，再到新近的表觀遺傳調控因子。隨著基因組計劃的完成，人們對非編碼RNA認識的不斷深入，這些非編碼RNA可作為重要的表觀遺傳調控因子，調控精子發生過程，對精原干細胞干性維持、生殖細胞減數分裂、精原細胞分化及精母細胞減數分裂等過程發揮著重要的調控作用。然而，其研究多數集中在微小RNAs、與Piwi蛋白相互作用的RNAs和長鏈非編碼RNAs上，在環狀RNAs和內源性小干擾RNAs上的研究還處于初級階段。非編碼RNA在精子發生中的作用多集中在線蟲、果蠅、小鼠和人上，在大家畜上的研究較少。相信，隨著組學時代的到來，對非編碼RNA研究的不斷深入，將有助于大家畜精子發生的研究，會為大家畜生精障礙和精子發生異常治療方法的選擇提供理論依據。

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（責任編輯 林鑒非）

Regulatory Role of Noncoding RNAs During Spermatogenesis

CHEN Rui1,2, YU Shuai2, CHEN XiaoXu2, DU Jian2, ZHU ZhenDong2, PAN ChuanYing2, ZENG WenXian2
(1Innovation Experimental College, Northwest A&F University, Yangling 712100, Shaanxi;2College of Animal Science and Technology, Northwest A&F University, Yangling 712100, Shaanxi)

Spermatogenesis starts with spermatogonial stem cells (SSCs), which possess the ability of self-renewal anddifferentiation. SSCs are capable of differentiation to form Asingle (As) spermatogonia, Apaired (Apr) spermatogonia, Aaligned (Aal) spermatogonia, A1-A4 spermatogonia, intermediate spermatogonia, and B spermatogonia. Type B spermatogonia divide forming the primary spermatocytes, which undergo a long meiosis time to form secondary spermatocytes. Then secondary spermatocytes go through meiosis II to produce round spermatids, which will undergo a series of processes called spermiogenesis containing morphological changes, replacement histone by protamine, nuclear condensation and formation of flagellum. Finally, the mature spermatozoa are released into the lumen. This process requires precise and highly ordered regulation of gene expression at both the transcriptional and posttranscriptional levels. Recent advances in research have revealed that several types of noncoding RNAs (ncRNAs), including microRNAs (miRNAs), Piwi-interacting RNAs (piRNAs), long noncoding RNAs (lncRNAs), circular RNAs (circRNAs) and endogenous small-interfering RNAs (endo-siRNAs), are essential for spermatogenesis. These ncRNAs are expressed in a cell-specific and step-specific manner to participate in the control of spermatogenesis. MiRNAs are a class of endogenous non coding single stranded RNA molecules of about 21-25 nt that widely exist in various kinds of organisms, its formation needs at least two RNA enzymes such as Drosha and Dicer, which can also degrade target mRNA or inhibit target mRNA translation, have an important regulatory role in maintaining the stemness, self-renewal of SSCs, regulating differentiation, and involved germ cell meiosis and spermatogenesis. piRNAs are a large class of small RNAs that are 24-32 nt in length found in 2006, which could execute the biological function through interactions with Piwi proteins without Dicer enzyme, also silence transposons and retroposons at the epigenetic and posttranscriptional levels, maintain the genomic stability and integrity of germ cell, regulate cell proliferation, meiosis and spermatogenesis. LncRNAs are one of ncRNAs longer than 200 nt, their production process and structure are similar to the mRNA. Different sources of lncRNAs could regulate the stemness, differentiation of SSCs, and modulate germ cell apoptosis in a transcriptional and posttranscriptional manner. Some lncRNAs could also regulate the expression of miRNAs thus regulate the process of spermatogenesis. CircRNAs, differs from the traditional linear RNA, is a new type of RNA, which is conserved in different species, and specifically expressed in different tissues and developmental stages. Its formation processing mode is related to its sequence, the same gene locus could produce a variety of circRNAs through selective cyclization. Studies indicated that circRNAs can be combined with miRNAs to regulate spermatogenesis. Compared with other ncRNAs, the biogenesis of endo-siRNAs is simple, and has the same effect as miRNAs, which plays an important role in spermatogenesis and male reproduction. Therefore, this review summarized the regulatory role of ncRNAs during spermatogenesis, which provided insight into the further research on ncRNAs during spermatogenesis.

spermatogenesis; noncoding RNAs; regulatory role

2016-05-25；接受日期：2016-11-23

國家自然科學基金（31572401, 31272439）、中國博士后科學基金第56批面上資助項目（2014M560809）和陜西省博士后科研項目

聯系方式：陳瑞，E-mail：chenrui950122@126.com。通信作者潘傳英，E-mail：chuanyingpan@126.com，panyu1980@126.com