自組裝有序納米銀線表面增強拉曼光譜檢測牛奶中三聚氰胺

趙蕊池+王培龍+石雷+蘇曉鷗

摘 要 制備具有表面增強拉曼散射（SERS）增強效果的基底是獲得靈敏SERS檢測的基礎。本研究以多元醇法合成、流體流動法組裝制備的有序納米銀線作為三聚氰胺的SERS增強基底，實現了樣品中痕量三聚氰胺的快速靈敏檢測。通過理論計算及實驗考察得到了三聚氰胺的拉曼特征峰，優化了三聚氰胺在有序納米銀線基底上的SERS檢測條件。在pH=8、水為溶劑、溶劑揮發時間為14 min的最佳條件下，三聚氰胺特征峰強度與濃度在0.05～1.00 mg/L范圍內呈現良好的線性關系，其線性相關系數R=0.997，檢測限為0.05 mg/L。在牛奶中添加不同濃度的三聚氰胺，其回收率為89.7%～109.2%，相對標準偏差低于6.8%。本方法對三聚氰胺檢測具有很好的靈敏度和穩定性，為其它小分子化合物的SERS檢測提供技術支持。

關鍵詞 有序納米銀線； 三聚氰胺； 表面增強拉曼散射

1 引 言

三聚氰胺（Melamine，C3N3（NH2）3），是一種三嗪類含氮雜環有機化合物，由于其氮含量高（66.6%）常被非法添加到牛奶和各種乳制品中[1]。三聚氰胺難以代謝，動物或人食用后會產生不同程度的腎衰竭，嚴重的甚至導致死亡[2]。2011年，我國農業部第10號公告規定，三聚氰胺在嬰兒配方食品中用量不得超過1 mg/kg，在其他食品中亦不得超過2.5 mg/kg[3]。因此，研究開發簡單、快速并且高靈敏檢測食品中三聚氰胺的技術十分必要。

目前，三聚氰胺的檢測手段主要有質譜法（MS）[4]、高效液相色譜法（HPLC）[5]、氣相色譜法（GC）[6]、電化學法[7]和酶聯免疫吸附法（ELISA）[8]等。上述方法雖然有很高的靈敏度和準確性，但大多數存在檢測周期長、技術要求高、儀器造價昂貴和樣品前處理繁瑣等不足[9]，因此很大程度上限制了這些技術的實際應用。

表面增強拉曼光譜（SERS）分析技術是以拉曼散射效應為基礎建立起來的一種分子結構表征技術。當一些分子被吸附到某些粗糙的金屬表面時，拉曼信號的強度會增加104～106倍，這種現象稱為表面增強拉曼散射[10，11]。SERS信號強度與其增強基底材料有關。目前應用比較多的增強基底主要以銀、金、銅3種金屬材料為主，其中銀的增強活性最好[12]。例如，Li等[13]以包裹在SiO2外殼上金粒子為SERS增強基底檢測牛奶中的三聚氰胺，檢測限為1 mg/L； Zhang等[14]以銀膠體為SERS增強基底，其牛奶中三聚氰胺的檢出限低至0.5 mg/L。納米銀線作為一種新興材料，將其作為SERS增強基底已成功地用于藥品中藥物成分的定量分析[15]。常見的納米銀線制備方法有模板法[16]、晶種法[17]、水熱法[18]和多元醇法[19]等。其中，多元醇法操作簡單、原料易得、反應體系環保易控，因此受到了科研工作者的青睞。很多研究表明，納米銀線呈有序排列能夠有效增強SERS的檢測信號，且信號重現性較好[20，21]。

本研究采用多元醇法合成、流體流動法組裝、制備有序納米銀線，并將其應用于三聚氰胺的SERS檢測。其有序納米銀線基底大大增強了牛奶中三聚氰胺的SERS檢測信號，有效克服了常用SERS增強基底（如銀或金納米溶膠）重現性和穩定性較差、分析結果精確度低的不足，使用此基底對三聚氰胺進行定性與定量分析，具有簡單、快速、準確和靈敏度高的特點，可為乳制品的檢測提供技術支持。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

RamTracer@.200.HS型便攜式拉曼光譜儀（美國Opto Trace公司）；S.4800冷場發射掃描電子顯微鏡（日立高新技術株式會社，上海）；XRD粉末衍射儀（Rigaku Dmax.2500）；48孔正壓固相萃取裝置（J2，美國）；TARGINTM VX.Ⅲ型多管渦旋振蕩器；明澈TM.D 24UV型超純水制備器（美國Millipore公司）；3K15型高速離心機（美國Sigma公司）；KQ5200DB型數控超聲波清洗儀；MG.2200型氮吹儀（Eyela，日本）；Vortex Genius 3新型旋渦混勻器（IKA，德國）；SPE離子交換柱（60 mg/3 mL）。實驗中所用玻璃器皿均在王水（HCl.HNO3， 3∶1， V/V）中浸泡8 h以上，使用前用超純水沖洗，烘干后使用。

AgNO3（99%）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP，MW=55000）、乙二醇（99%）及AgCl（99%）均購自Aldrich公司；三聚氰胺（國藥集團化學試劑有限公司）；甲醇、乙腈、濃HNO3、三氯乙酸、乙酸鉛（北京化工廠）。所有試劑均為分析純，所有實驗用水均為超純水。市售某品牌袋裝純牛奶。

2.2 有序納米銀線的制備

通過多元醇法制備納米銀線（AgNWs）[22]。室溫下將0.34 g聚乙烯吡咯烷酮（PVP）加到20 mL乙二醇中，升溫至170℃，再加入25 mg AgCl粉末形成Ag的結晶核[19，23]。3 min后，在10 min內分5次加入110 mg AgNO3粉末，將此混合體系反應30 min。經6000 r/min離心5 min后，用甲醇清洗得到AgNWs。在合成納米銀線過程中，乙二醇既為溶劑又為還原劑。

采用流體流動法組裝有序納米銀線。將0.154 mol/L AgNWs乙醇懸浮液在800 μL/min的流速下流經玻璃毛細管，得到內壁附以有序納米銀線的毛細管拉曼增強基底。

2.3 樣品的制備

2.3.1 標準溶液的配制 準確稱取0.0100 g三聚氰胺粉末標準品于燒杯中，用甲醇溶解并定容至100 mL， 得到100.00 mg/L三聚氰胺儲備液。

2.3.2 牛奶樣品的處理 （1）提取 取5 mL牛奶樣品，加入15 mL三氯乙酸溶液（ρ=10 g/L），搖勻后再加入1 mL乙酸鉛溶液（ρ=22 g/L）（其中三氯乙酸是強酸，鉛是重金屬，兩者均可使蛋白質變性沉淀）。然后超聲30 min，10000 r/min離心5 min，提取上清液備用； （2）凈化 SPE柱分別經3 mL甲醇、3 mL水活化后，移取10 mL上清液分次上柱，對三聚氰胺進行吸附。然后用3 mL水和3 mL甲醇洗滌SPE柱，洗去雜質，抽干。再用3 mL、5%氨水.甲醇溶液洗脫三聚氰胺，收集洗脫液，抽干。洗脫液于50℃氮吹干后加1 mL水，振蕩、溶解、搖勻，待測[24]。