Meta分析精子DNA完整性對輔助生殖結局的預測價值

譚艷，范立青

(1. 湖南省株洲市婦幼保健院生殖科，株洲 412000；2. 中南大學生殖與干細胞工程研究所，長沙 410078)

Meta分析精子DNA完整性對輔助生殖結局的預測價值

譚艷1，范立青2*

(1. 湖南省株洲市婦幼保健院生殖科，株洲 412000；2. 中南大學生殖與干細胞工程研究所，長沙 410078)

目的 系統評價精子DNA完整性對于宮腔內人工授精(IUI)、體外受精-胚胎移植(IVF-ET)以及卵胞漿內單精子注射(ICSI)等不同助孕方式妊娠結局的預測價值。 方法 采用電子檢索和手工檢索相結合的方式進行文獻初檢，檢索Medline(via. OvidSP)、PubMed、Embase、CNKI、VIP等數據庫，檢索時限為建庫至2016年3月，并手工檢索相關會議資料。由2名評價者依據納入與排除標準獨立篩選研究文獻、提取數據資料和評價方法學質量，然后采用RevMan 5.3軟件進行Meta分析。 結果 最終納入27篇隊列研究，合計7 302個周期。Meta分析結果顯示：DNA碎片指數(DFI)的增加會降低IUI臨床妊娠率(RR=0.22，95%CI：0.12-0.41)、IVF受精率(RR=0.90，95%CI：0.86-0.95)、IVF優質胚胎率(RR=0.86，95%CI：0.82-0.91)、IVF臨床妊娠率(RR=0.86，95%CI：0.76-0.98)，并增加IVF流產率(RR=1.65，95%CI：1.05-2.57)和ICSI流產率(RR=1.57，95%CI：1.03-2.39)(P均<0.05)；且DFI的檢測方法中只有TUNEL法能預測IVF的臨床妊娠率(RR=0.74，95%CI：0.55-0.99，P<0.05)，DFI對ICSI受精率、優質胚胎率、臨床妊娠率的影響無統計學意義(P>0.05)。 結論 DFI水平高低對輔助生殖治療的結局有一定的預測價值，DFI較高時選擇ICSI的治療方式可能更優于常規的IVF。但因納入研究數量和質量的限制，上述結論還需開展更大規模流行病學研究和臨床研究進一步驗證。

精子； DNA完整性； 輔助生殖技術； Meta分析

(JReprodMed2017，26(1)：39-47)

精子DNA作為男性遺傳物質的載體，其主要任務即完整地將遺傳物質傳遞給子代。由于精子自身沒有修復機制，因此DNA損傷幾乎存在于所有精子中，精子DNA損傷程度對于生殖結局是否存在不利影響是臨床關注的重點問題。有研究報道，在輔助生殖技術(ART)開展過程中，DNA損傷的精子會導致受精失敗、胚胎發育障礙、活產率降低、出生缺陷以及后代的高發病率[1]，選擇DNA完整的精子可以改善ART的治療結果。評價精子DNA完整性的主要指標即精子DNA碎片指數(DFI)，其能否預測ART結局，一直存在很大爭議。因此本研究采用Meta分析的方法評價DFI與ART主要結局的相關性，希望為臨床上ART方式的選擇提供更可靠的循證醫學證據。

資料與方法

一、文獻納入與排除標準

納入標準：研究類型為隊列研究(cohort)，限中、英文；研究對象為確診需通過ART助孕的正常卵巢儲備功能者；以DFI為參數，研究高低水平DFI與受精率、優質胚胎率、臨床妊娠率及流產率的相關性。

排除標準：納入研究的類型不符、資料不全或無法提取原始數據的研究；失訪人數>20%的研究。

二、檢索策略

采用電子檢索和手工檢索的方式進行文獻初篩，檢索Medline(via. OvidSP)、PubMed、Embase、The Cochrane Library、CENTRAL，以及中國知網(CNKI)、萬方數據庫(WanFang Data)、維普信息資源系統(VIP)、讀秀、中國生物文獻醫學數據庫(CBM)，檢索時限為建庫至2016年3月，并手工檢索相關會議資料，同時追溯納入文獻的參考文獻。

中文檢索詞包括：精子DNA碎片、精子DNA完整性、輔助生殖技術、宮腔內人工授精、體外受精-胚胎移植、卵胞漿內單精子顯微注射技術等。英文檢索詞包括：sperm DNA fragmentation、sperm DNA damage、DNA fragmentation index、DFI、in-vitro fertilization、IVF、Intracytoplasmic sperm injection、ICSI、IVF-ET、ART、AIH、IUI等，以及這些檢索詞的自由組合檢索。該檢索限中文和英文。

三、文獻篩選、資料提取與質量評價

由兩位研究員獨立進行文獻檢索，排除不符合納入標準的文獻，當雙方意見不一致時，參考第三方評價意見。

自制信息提取表，其中包括3個方面內容：(1)基本信息：包括題目、發表日期、作者姓名等；(2)納入文獻的資料：包括研究類型、研究人群、干預措施、結局指標等；(3)納入文獻的特征：包括研究方法、對象特征、數據結果。如文章相關資料缺失，則與作者聯系尋求完整的臨床數據。質量評價利用紐卡斯爾-渥太華量表(NOS)做為隊列研究的偏倚風險評估工具[2]，NOS滿分為9顆星(1顆星代表1分)，分數越高，文獻質量越好。

四、統計分析

釆用Cochrane協作網的RevMan 5.3軟件進行Meta分析，對提取的數據進行定量統計，合并后繪制森林圖。采用χ2檢驗分析各文獻結果間的異質性，檢驗水準設為α=1，結合I2判斷異質性大小。若P>0.05且I2<50%，提示各研究結果間同質性較好，采用固定效應模型進行Meta分析；若P≤0.05和/或I2≥50%，提示各研究結果間存在統計學差異，根據DFI檢測方式的不同采用隨機效應模型進行Meta亞組分析。偏倚情況繪制漏斗圖進行評估。

結 果

一、文獻檢索結果

通過數據庫檢索初檢獲得相關文獻6 815篇，其中PubMed(n=569)、Medline(n=2 686)、Embase(n=1 190)、CENTRAL(n=465)、The Cochrane Library(n=10)、CNKI(n=405)、VIP(n=264)、萬方數據庫(n=793)、讀秀(n=268)、CBM(n=165)，經評估、篩選后最終納入文獻27篇(共7 302個周期)，具體篩選流程和結果見圖1，所納入文獻的基本信息見表1。納入文獻的質量評價得分在6～9分之間，文獻質量較高。

(3)因此當生物炭添加量為2%時，pH值和容重最小，電導、飽和含水量和田間持水量均為最大，這對降低南疆沙化土壤鹽堿性，提高土壤保水能力提供了理論數據。

圖1 文獻篩選流程和結果

作者研究類型ART方法周期數DFI檢測方法?DFI參考閾值結局指標aNOS評分DuranEH[3]前瞻性IUI154TUNEL12%③7ZiniA[4]前瞻性ICSI60AOT30%①③④8HuangCC[5]回顧性IVF/ICSI217/86TUNEL10%②③7Boe?HansenGB[6]前瞻性IVF/ICSI139/47SCSA27%③7BoriniA[7]前瞻性IVF/ICSI82/50TUNEL10%③④8BenchaibM[8]前瞻性IVF/ICSI88/234TUNEL10%③7BungumM[9]回顧性IUI/IVF/ICSI387/388/223SCSA30%③④9LinMH[10]前瞻性IVF/ICSI137/86SCSA27%③④7FrydmanN[11]前瞻性IVF117TUNEL35%②③④8MicińskiP[12]前瞻性ICSI60SCSA15%③7SpeyerBE[13]回顧性IVF/ICSI192/155SCSA30%③④9蔣歡歡[14]前瞻性IVF/ICSI137/50SCSA30%①②③8JiangH[15]前瞻性IVF/ICSI116/63AOT30%①③7丁玉芹[16]前瞻性ICSI63AOT27%①②③7楊曉玉[17]前瞻性IUI482SCSA25%①7

續表1

注：*DFI檢測方法：TUNEL：末端脫氧核苷酸轉移酶介導的脫氧尿苷三磷酸標記實驗；AOT：丫啶橙實驗；SCSA：精子染色質結構分析實驗；SCD：精子染色質擴散實驗。a結局指標：①受精率；②優質胚胎率；③臨床妊娠率；④流產率

二、Meta分析結果

1. IUI臨床妊娠率：固定效應模型Meta分析結果顯示，高DFI組的臨床妊娠率低于低DFI組，差異有統計學意義(RR=0.22，95%CI：0.12-0.41，P<0.05)(圖2)。

2. DFI與IVF受精率的相關性：隨機效應模型Meta分析結果顯示，高DFI組的受精率低于低DFI組，差異具有統計學意義(RR=0.90，95%CI：0.86-0.95，P<0.05)(圖3)。

3. DFI與IVF優質胚胎率的相關性：固定效應模型Meta分析結果顯示，高DFI組的優質胚胎率低于低DFI組，差異具有統計學意義(RR=0.86，95%CI：0.82-0.91，P<0.05)(圖4)。

4. DFI與IVF臨床妊娠率的相關性：隨機效應模型分析結果顯示，DFI的增加會導致IVF臨床妊娠率降低，差異有統計學意義(RR=0.86，95%CI：0.76-0.98，P<0.05)。由森林圖可見，只有TUNEL檢測方式能預測IVF臨床妊娠率(RR=0.74，95%CI：0.55-0.99，P<0.05)(圖5)。

5. DFI與IVF流產率的相關性：固定效應模型Meta分析結果顯示，高DFI組的流產率高于低DFI組，差異具有統計學意義(RR=1.65，95%CI：1.05-2.57，P<0.05)(圖6)。

6. DFI與ICSI受精率的相關性：隨機效應模型Meta分析結果顯示，ICSI受精率不受DFI高低的影響(RR=1.01，95%CI：0.98-1.04，P>0.05)(圖7)。

7. DFI與ICSI優質胚胎率的相關性：隨機效應模型Meta分析結果表示，ICSI優質胚胎率不受DFI高低的影響(RR=1.09，95%CI：1.00-1.18，P>0.05)(圖8)。

圖2 DFI與IUI臨床妊娠率相關性森林圖

圖3 DFI與IVF受精率相關性森林圖

圖4 DFI與IVF優質胚胎率相關性森林圖

8. DFI與ICSI臨床妊娠率的相關性：隨機效應模型結果顯示，無論采用哪種方式檢測，ICSI臨床妊娠率均不受DFI高低的影響(RR=0.96，95%CI：0.77-1.19，P>0.05)(圖9)。

9. DFI與ICSI流產率的相關性：固定效應模型Meta分析結果顯示，高DFI組的流產率高于低DFI組，差異具有統計學意義(RR=1.57，95%CI：1.03-2.39，P<0.05)(圖10)。

10. 發表性偏倚分析：參照之前文獻方法[30]，對納入文獻≥5篇且有統計學差異的研究組繪制漏斗圖，結果顯示納入文獻均以合并效應量RR值為中心左右對稱散開分布，提示無明顯發表偏倚。

討 論

本次Meta分析共納入了27篇隊列研究文獻，文獻整體質量良好，選擇性偏倚風險小。雖然納入的文獻在方法學和DFI閾值的選擇標準、檢測方式上存在一定差異，但異質性檢驗結果可以接受時，不影響數據的合并。對于I2≥50%研究組，根據DFI檢測方式的不同采用隨機效應模型進行了Meta亞組的分析。

由IUI組納入的4個研究的合并結果來看，DFI的增加會降低IUI的臨床妊娠率(RR=0.22，95%CI：0.12-0.41)(P<0.05)。提示檢測精子DNA完整性能很好地預測IUI的妊娠結局，尤其以男方因素為主的不孕不育患者。查錢江等[23]認為，使用密度梯度離心加上游法可顯著降低DFI，提示IUI的精液可常規使用密度梯度離心加上游法處理，以提高臨床妊娠率。

有研究認為高水平的DFI會對胚胎質量產生不利影響，如減少受精率，降低胚胎質量，減少囊胚形成數量，導致胚胎停育增加等[31-32]。精子DNA損傷可能是導致IVF受精失敗的重要原因，因為精子的DNA受到破壞后可能會影響相應蛋白質的轉錄或合成，進而影響頂體酶原的生成，無法激活頂體酶，頂體酶的活性降低，影響受精。目前評價優質胚胎僅依靠顯微鏡下對卵裂球分裂程度、細胞數目、細胞均勻程度、碎片多少等進行評價，結果判斷主觀性較強，而精子DNA完整性可能是從分子水平預測胚胎預后的有效指標之一。卵母細胞雖然可以對輕微損傷的精子DNA進行修復，但是這種修復機制只有在精子DNA損傷<8%時才有效，高于這個水平仍可導致卵母細胞激活障礙，胚胎發育受到限制[33]。本Meta分析也發現，IVF受精率、優質胚胎率、臨床妊娠率和流產率均會受到DFI的影響(P<0.05)。

圖5 DFI與IVF臨床妊娠率相關性森林圖

圖6 DFI與IVF流產率相關性森林圖

圖7 DFI與ICSI受精率相關性森林圖

圖8 DFI與ICSI優質胚胎率相關性森林圖

圖9 DFI與ICSI臨床妊娠率相關性森林圖

圖10 DFI與ICSI流產率相關性森林圖

但在ICSI組中，DFI只與流產率相關(RR=1.57，95%CI：1.03-2.39，P<0.05)。蔡成云等[34]也發現DFI高低對ICSI臨床妊娠率造成的差異無統計學意義(P>0.05)。分析其原因，可能與以下因素有關：一是卵母細胞具有一定的修復功能；二是ICSI受精方式中精子沒有受到實驗室誘發的損傷；三是與IVF比較，ICSI避免了精子釋放活性氧對卵母細胞造成的功能損傷，包括修復精子DNA碎片后的受精能力等；四是本次Meta分析所納入研究的數量和質量有限可能造成一定程度的偏倚。Bungum等[9]的研究數據也顯示，當DFI>30%時，ICSI對DFI不敏感。本Meta分析結果顯示，當卵巢儲備功能正常時，DFI只影響ICSI流產率，因此建議DFI較高時首選ICSI助孕技術，這與費前進等[35]的研究結論相一致。

由于精子DNA檢測方式不同，其闡明的DNA損傷也可能不同，因此這些檢測的結果或許并不是等價的。SCSA主要檢測螺線管連接子位點，SCD測量松懈的完整DNA和外圍組蛋白。TUNEL法則通過加入熒光染色核苷酸，可特定分析磷酸二酯鍵的斷裂，能夠檢測精子單鏈和雙鏈DNA斷裂的碎片，被稱為“實際”DNA損傷。本Meta分析中，由IVF臨床妊娠率亞組森林圖可見，只有TUNEL檢測方式能夠預測IVF臨床妊娠率(RR=0.74，95%CI：0.55-0.99)(P<0.05)。因此，為了更準確地預測ART妊娠結局，使用何種檢測方式檢測DFI顯得尤為重要。

綜上所述，以DFI作為評價精子DNA完整性的常規指標，其水平高低對輔助生殖治療的結局有一定的預測價值，DFI較高時選擇ICSI的治療方式可能更優于常規的IVF。但由于受到納入研究數量和質量的限制，上述結論還需要開展更大規模的流行病學研究和臨床研究來進一步驗證。

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[編輯：肖曉輝]

Meta-analysis of predictive value of sperm DNA integrity on assisted reproductive outcome

TAN Yan1， FAN Li-qing2*

1.ChildHealthCareDepartment，ZhuzhouMaternal&ChildHealthHospital，HunanProvice，Zhuzhou412000 2.InstituteofReproductive&StemCellEngineering，CentralSouthUniversity，Changsha410078

Objective： To evaluate systematically the predictive value of sperm DNA integrity on the outcome of intrauterine insemination (IUI)， IVF-ET and ICSI.Methods： The literatures were searched electronically and manually from the databases in both English and Chinese including Medline， Pub Med， Embase， CNKI， VIP and conference information till March 2016. The data were selected and extracted according to inclusion and exclusion criteria， and the quality of research methodology was evaluated by two independent reviewers. Then RevMan 5.3 software was used for Meta analysis.Results： Thirty study including 10 124 cycles were included. Meta analysis showed that elevation of DNA fragmentation index (DFI) reduced clinical pregnancy rate of IUI[RR=0.22， 95%CI(0.12， 0.41)]， IVF-ET fertilization rate [RR=0.90， 95%CI(0.86， 0.95)]， high-quality embryo rate of IVF-ET [RR=0.86， 95%CI(0.82， 0.91)]， clinical pregnancy rate of IVF-ET [RR=0.86， 95%CI(0.76， 0.98)](allP<0.05). Elevation of DFI increased the abortion rates of IVF-ET [RR=1.65，95%CI(1.05， 2.57)] and ICSI [RR=1.57，95%CI(1.03， 2.39)](allP<0.05). Only the TUNEL method was able to predict the clinical pregnancy rate of IVF [RR=0.74， 95%CI(0.55， 0.99)，P<0.05]. There was no significant effect of DFI on fertilization rate， high-quality embryo rate， clinical pregnancy rate in ICSI (P>0.05).Conclusions： Existing evidence suggests that sperm DNA integrity can predict the outcome of the assisted reproduction. When DFI is higher， the outcome of ICSI treatment is better than that of IVF treatment. However， due to the limitations of the number and quality of studies included， the conclusions need to carry out larger epidemiological studies and clinical studies to further validate.

Sperm； DNA integrity； ART； Meta analysis

10.3969/j.issn.1004-3845.2017.01.008

2016-03-15；

2016-08-21

譚艷，女，漢族，湖南株洲人，碩士，副主任技師，生殖工程專業.(*