CEACAM1和VEGF在涎腺黏液表皮樣癌中的表達及在血管生成中的作用

馬 賽，安 峰，胥愛文，王 芹，張 利，李立恒

(河北北方學院附屬第一醫院口腔科，河北 張家口 075000)

CEACAM1和VEGF在涎腺黏液表皮樣癌中的表達及在血管生成中的作用

馬 賽，安 峰*，胥愛文，王 芹，張 利，李立恒

(河北北方學院附屬第一醫院口腔科，河北 張家口 075000)

目的研究癌胚抗原相關細胞黏附分子1(carcinoembryonic antigenrelated cell adhesion molecule 1，CEACAM1)和血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factors，VEGF) 在涎腺黏液表皮樣癌(mucoepidermoid carcinoma，MEC)組織中的表達及對血管生成的影響。方法應用免疫組織化學鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶連接(streptavidin-perosidase,SP)法檢測70例MEC、20例正常涎腺組織中CEACAM1、VEGF的表達情況，在光鏡下計數70例MEC組織中CD105標記的微血管密度(microvessel density，MVD)。結果70例MEC組織中CEACAM1蛋白陽性表達率明顯低于正常涎腺組(34.3%vs70.0%,P<0.05)，VEGF蛋白陽性表達率明顯高于正常涎腺組(71.4%vs10.0%,P<0.05)。在MEC組織中病理分級Ⅲ級者CEACAM1表達陽性率低于病理分級Ⅰ+Ⅱ級者(P<0.05)，TNM分期Ⅲ+Ⅳ期者CEACAM1表達陽性率低于TNM分期Ⅰ+Ⅱ期者(P<0.05)，有淋巴結轉移者CEACAM1表達陽性率低于無淋巴結轉移者(P<0.05)；而病理分級Ⅲ級者VEGF表達陽性率和MVD值高于病理分級Ⅰ+Ⅱ級者(P<0.05)，TNM分期Ⅲ+Ⅳ期者VEGF表達陽性率和MVD值高于TNM分期Ⅰ+Ⅱ期者(P<0.05)，有淋巴結轉移者VEGF表達陽性率和MVD值高于無淋巴結轉移者(P<0.05)。結論MEC組織中CEACAM1表達下調可能促進了VEGF的表達，從而參與MEC組織當中血管的生成，促進其侵襲和轉移。

癌，黏液表皮樣；血管內皮生長因子類；血管生成

黏液表皮樣癌(mucoepidermoid carcinoma，MEC)是涎腺腫瘤中常見的一類惡性腫瘤。隨著MEC的發展，患者的面容會受到嚴重影響，當腫瘤侵及神經時面部功能也會隨之受到損害，造成患者生活質量下降，甚至危及患者的生命。與其他腫瘤相同，MEC組織中新生血管的數量決定了其生長、浸潤、轉移潛能。研究發現，腫瘤的血管生成是一個復雜的過程，受多種血管生成促進因子和抑制因子共同調控。癌胚抗原相關細胞黏附分子1(carcinoembryonic antigenrelated cell adhesion molecule 1，CEACAM1)是一種糖蛋白，它是癌胚抗原家族的成員之一，以往研究顯示CEACAM1與腫瘤血管、淋巴管的生成密切相關[1-2]。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factors，VEGF) 是一種已知的促進血管生成的強效因子，它通過促進相鄰的血管內皮細胞增殖和轉化遷移，促進血管的生成。本研究應用免疫組織化學鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶連接(streptavidin-perosidase,SP)法觀察MEC組織中CEACAM1、VEGF的表達情況，并測定以CD105標記的腫瘤組織微血管密度(microvessel density，MVD)，旨在探討MEC組織中CEACAM1、VEGF表達改變與腫瘤微血管生成的關系。

1 資料與方法

1.1 材料與試劑 收集2007年6月—2016年6月河北北方學院附屬第一醫院口腔科收治的MEC患者70例，均有完整的臨床病理資料。以上病例均經手術切除腫瘤，術前均未接受放療、化療及免疫治療等其他治療，病理標本均由資深病理科醫師按照WHO(1991年)涎腺腫瘤組織病理學標準進行診斷分型。同時選取癌旁正常的涎腺組織20例作為對照組。兔抗人CEACAM1單克隆抗體購自美國Epitomics公司，鼠抗人VEGF單克隆抗體購自美國Labvision公司，鼠抗人CD105單克隆抗體購自NeoMarkers公司，免疫組織化學SP試劑盒購自北京中杉生物技術公司。

1.2 標本處理及檢測方法 所用標本均由4%甲醛浸泡固定24 h，常規石蠟包埋、切片，并貼附于1%多聚賴氨酸處理后的載玻片上，65 ℃烤片1 h。免疫組織化學SP法檢測按試劑盒上說明的步驟進行。兔抗人CEACAM1單克隆抗體效價為1∶200，鼠抗人VEGF單克隆抗體效價為1∶100，以PBS代替一抗作為陰性對照，用已知陽性標本作為陽性對照。

1.3 結果判定

1.3.1 CEACAM1、VEGF表達陽性的判定標準 細胞膜和(或)細胞質被染成棕黃色的細胞被判定為表達陽性細胞。在顯微鏡高倍視野下(×200)隨機選取5個視野，根據每個視野中陽性細胞的百分比和染色程度對標本進行評分。細胞計數：無陽性細胞為0分，<25%為1分，25%～50%為2分，>50%為3分。染色程度：基本不著色為0分，著色淡為1分，著色適中為2分，著色深為3分。細胞計數得分與染色程度得分2項相加，得分>3分被認定為陽性，≤3分認定被為陰性。

1.3.2 CD105表達陽性的判定標準及標本MVD計數方法 血管內皮細胞膜和(或)細胞質被染成棕黃色或棕褐色視為CD105表達陽性。根據Weidner[3]提出的方法計數標本的MVD值：在顯微鏡低倍視野下(×10)選取腫瘤微血管密度較高的區域，再在高倍視野下(×200)計數微血管的數目，每張切片選取5個高倍視野進行計數，取平均值作為該標本的MVD值。

1.4 統計學方法 應用SPSS 17.0統計軟件處理數據。計量資料比較采用t檢驗；計數資料比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 CEACAM1、VEGF在MEC組織中的表達 CEACAM1和VEGF的陽性顆粒均集中在細胞質或細胞膜中(圖1～4)，70例標本當中CEACAM1陽性表達率分為34.3%(24/70)，明顯低于正常涎腺組織中的70.0%(14/20)，VEGF陽性表達率為71.4%(50/70)，明顯高于正常涎腺組織中的10.0%(2/20)。見表1。

2.2 MEC患者不同病理特征的CEACAM1、VEGF和MVD表達 在MEC組織中病理分級Ⅲ級者CEACAM1表達陽性率低于病理分級Ⅰ+Ⅱ級者(P<0.05)，TNM分期Ⅲ+IV期者CEACAM1表達陽性率低于TNM分期Ⅰ+Ⅱ者(P<0.05)，有淋巴結轉移者CEACAM1表達陽性率低于無淋巴結轉移者(P<0.05)，不同性別、年齡和腫瘤部位CEACAM1表達陽性率差異無統計學意義(P>0.05);VEGF與MVD表達相反，病理分級Ⅲ 級者VEGF表達陽性率和MVD值高于病理分級Ⅰ+Ⅱ級者(P<0.05)，TNM分期Ⅲ+Ⅳ期者VEGF表達陽性率和MVD值高于TNM分期Ⅰ+Ⅱ期者(P<0.05)，有淋巴結轉移者VEGF表達陽性率和MVD值高于無淋巴結轉移者(P<0.05)，不同性別、年齡、病變部位VEGF表達陽性率和MVD值差異無統計學意義(P>0.05)。見表2，圖5。

表1 CEACAM1和VEGF在兩組中的表達比較 Table 1 Expression of CEACAM1 and VEGF between the two groups (例數，%)

圖1 MEC組織中CEACAM1的表達情況(SP×200)Figure1 ExpressionofCEACAM1inmucoepidermoidcarcinoma(SP×200)圖2 MEC組織中VEGF的表達情況(SP×200)Figure2 ExpressionofVEGFinmuco?epidermoidcarcinoma(SP×200)

圖1 MEC組織中CEACAMI的表達情況(SP×200)

Figure 1 expression of CEACAMI in mucopidermoid carcinoma(SP×200)

圖2 MEC組織中VECF的表達情況(SP×200)

Figure 2 Expression of VECF in mucoepidermoid carcinoma(SP×200)

圖3 正常涎腺組織中CEACAM1的表達情況(SP ×200)

Figure 3 Expression of CEACAM1 in normal salivary gland(SP ×200)

圖4 正常涎腺組織中VEGF的表達情況(SP ×200)

Figure 4 Expression of VEGF in normal salivary gland(SP ×200)

圖5 MEC組織中CD105的表達情況(SP ×200)

Figure 5 Expression of CD105 in mucoepidermoid carcinoma(SP ×200)

表2 MEC中不同病理特征CEACAM1和VEGF的表達及MVD值Table 2 Expression of CEACAM and VEGF in different pathological features and MVD value in MEC

3 討 論

MEC是口腔頜面部最常見的唾液腺惡性腫瘤之一，占涎腺上皮性惡性腫瘤30%左右?？砂l生于任何年齡段，其中又以40～60歲為發病高峰，女性多于男性。腮腺、頜下腺、腭腺、磨牙后腺等腺體均可發生，因其發病隱匿，早期無明顯癥狀，病史通常較長。黏液表皮樣癌根據其發生部位、分化程度、惡性程度、有無轉移等方面的差異，治療方法及預后也有所不同[4-5]。如果臨床醫師能夠更準確地了解、評估工作中遇到的MEC，那么臨床上對MEC的治療水平必將顯著提高。

CEACAM1是免疫球蛋白超家族之中的一員，它可以參與細胞黏附、細胞信號通路傳導以及各種復雜的生物學進程，并且在血管生成、血運轉移、腫瘤進展中發揮著重要的作用[6]。與正常組織相比，在一些惡性腫瘤中，CEACAM1表達明顯減低，甚至不表達，所以人們普遍認為它是一種腫瘤抑制因子。CEACAM1表達的下調或缺失解除了機體對腫瘤細胞的抑制，可能是惡性腫瘤發生、發展的一個早期事件[2，7-8]。但是又有研究得出相反的結論，在諸如胃癌、肺癌等一部分惡性腫瘤中，CEACAM1的表達隨腫瘤惡性程度的上升而升高，且能夠促進腫瘤的侵襲、轉移，影響患者的預后[9-11]。對于CEACAM1在不同腫瘤當中發揮不同作用的解釋，目前有文獻報道可能與其不同的亞型和在腫瘤細胞當中的表達部位不同有關[10]。隨著研究的深入，人們越來越重視CEACAM1在腫瘤診斷、病情評估和判斷預后方面的重要性。目前，已有學者嘗試通過檢測患者血清當中CEACAM1的表達來預測腫瘤的發生、發展[12]。而CEACAM1在涎腺MEC組織中的表達情況及與腫瘤血管生成的關系如何，國內外均未見報道。本研究結果顯示，CEACAM1在MEC中的陽性表達率明顯低于正常涎腺組織(P<0.05)，且其表達隨涎腺MEC惡性程度的增高而降低，腫瘤侵犯的范圍越廣，其陽性表達率也越低，當出現淋巴結轉移時，其陽性表達率也隨之降低。這說明在涎腺MEC當中，CEACAM1起到腫瘤抑制因子的作用，當患者組織中CEACAM1表達降低時，提示可能腫瘤組織的惡性程度較高，預后不良。

惡性腫瘤發生、發展的過程離不開新生血管的形成，而新生血管形成是一個復雜的、多基因共同參與調控的過程。VEGF是目前公認的促進腫瘤血管生成的關鍵性因子[13]。VEGF在惡性腫瘤細胞中高表達，促進了血管內皮細胞的增殖，從而形成新生的血管，為腫瘤的快速發展提供充足的養分，并且增加了腫瘤血運轉移的機會。本研究結果顯示，VEGF在MEC組織中的表達明顯高于正常涎腺組織(P<0.05)；腫瘤的惡性程度越高、侵襲性越強，VEGF的陽性表達率越高；有淋巴結轉移時，其陽性表達率也隨之升高。與以往的研究結論一致[14]。

CD105是一種同型二聚體的細胞膜糖蛋白，在增殖旺盛的腫瘤組織血管內皮細胞上高表達。由于CD105能夠更顯著地標記腫瘤組織中新生的微小血管，故人們把CD105視為一種更優質、高效的血管內皮細胞增殖標記物，而根據它的染色評估MVD的方法也被認為能更好地量化腫瘤的MVD[15]。本研究通過標記CD105的方法來檢測MEC組織的MVD值，結果顯示CD105在MEC組織中陽性表達為100%，腫瘤的惡性程度越高、侵襲性越強，通過CD105標記的MVD值越大，有淋巴結轉移者較無淋巴結轉移者MVD值高(P<0.05)。說明CD105標記的MVD值高，很可能預示著MEC的惡性程度高，浸潤、轉移能力強。

本研究MEC組織中CEACAM1表達與VEGF表達、CD105標記的MVD值表達相反。說明CEACAM1過表達能夠抑制腫瘤新生血管的生成。以此推斷，在MEC的發生、發展過程當中，CEACAM1表達降低，VEGF表達增高，從而促進了MEC組織新生血管的形成，提高了其侵襲、轉移的能力，影響了MEC的生物學行為。其作用機制可能是：CEACAM1作為VEGF的一個重要效應分子，CEACAM1的表達缺失啟動了一系列促進血管生成相關的因子的高表達，如VEGF-C、VEGF-A、VEGF-D和血管生成素2等因子，從而促進了腫瘤生成新生血管[16]。但也有文獻報道，CEACAM1過表達促進了腫瘤血管、淋巴管的生成，并能夠促進血管內皮細胞轉化成淋巴管內皮細胞[17]。至于為何CEACAM1在不同腫瘤血管生成當中發揮著截然相反的作用，其具體機制仍有待進一步研究。

綜上所述，可以推斷，CEACAM1低表達、VEGF高表達，并伴有較高MVD值的MEC患者，可能預示著其腫瘤惡性程度高、侵襲性強、轉移率高、預后較差。通過檢測CEACAM1、VEGF的表達，并計數CD105標記的MVD值，有助于預測涎腺MEC的惡性程度及預后情況。進一步研究在MEC組織中CEACAM1與VEGF之間如何相互作用，在這一過程中是否還有其他因子參與調控及其調控的方式，有望為涎腺MEC的精準化治療提供科學依據。

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(本文編輯：許卓文)

Expression of CEACAM l and VEGF in mucoepidermoid carcinoma of salivary glands and its effect on angiogenesis

MA Sai, AN Feng*, XU Ai-wen, WANG Qin, ZHANG Li, LI Li-heng

(Department of Stomatology， the First Affiliated Hospital of Hebei North College， ZhangJiakou 075000， China)

Objective To investigate the relationship of carcinoembryonic antigen related cell adhesion molecule 1 (CEACAM1) and vascular endothelial growth factors (VEGF) expression with angiogenesis in mucoepidermoid carcinoma(MEC) of salivary glands. Methods The expression of CEACAM1 and VEGF was detected with immunohistochemcal method streptavidin-perosidase (SP) in 70 cases of MEC tissues，and 20 cases of normal salivary gland，the microvessel density(MVD) was recorded under optical microscope. Results The positive expressions of CEACAM1 protein (34.3%vs70.0%) was lower in MEC group than those in normal salivary gland group(P<0.05)，the positive expressions of VEGF protein (71.4%vs10.0%) was higher in MEC group than those in normal salivary gland group(P<0.05). In MEC group，the positive expressions of CEACAM1 protein in pathological grade levelⅢ patients were lower than those in pathological grade level Ⅰ+Ⅱ patients(P<0.05)，the positive expressions of CEACAM1 protein in TNM stage Ⅲ+Ⅳpatients were lower than those in TNM stageⅠ+Ⅱ patients(P<0.05)，the positive expressions of CEACAM1 protein in patients with lymph node metastasis were lower than that in patients without lymph node metastasis(P<0.05). The positive expressions of VEGF protein and MVD in pathological grade level Ⅲpatients were higher than those in pathological grade level Ⅰ+Ⅱpatients(P<0.05)，the positive expressions of VEGF protein and MVD in TNM stage Ⅲ+Ⅳ patients were higher than those in TNM stage Ⅰ+Ⅱpatients(P<0.05)，the positive expressions of VEGF protein and MVD in patients with lymph node metastasis were higher than that in patients without lymph node metastasis(P<0.05). Conclusion Downregulationg of CEACAM1 in MEC of salivary glands may play a role in angiogenesis through increasing the expression of VEGF，thus promote tumor invasion and metastasis.

carcinoma, mucoepidermoid； vascular endothelial growth factors； angiogenesis

2016-10-11；

2016-11-26

河北省醫學科學研究重點課題(20150059)；河北省政府資助臨床醫學優秀人才培養和基礎課題研究項目(361009)；張家口市科學技術研究與發展指導計劃(1421128D)

馬賽(1984-)，男，河北望都人，河北北方學院附屬第一醫院主治醫師，醫學碩士，從事口腔科疾病診治研究。

R730.26

A

1007-3205(2017)01-0043-05

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.01.010

*通訊作者