瀕危植物杜仲內生真菌及次生代謝產物活性研究進展

何 強， 陳文強，2， 彭 浩，2， 鄧百萬，2， 解修超，2， 王 穎

(1.陜西理工大學生物科學與工程學院，陜西漢中 723001； 2.陜西省食藥用菌工程技術研究中心，陜西漢中 723001)

瀕危植物杜仲內生真菌及次生代謝產物活性研究進展

何 強1， 陳文強1，2， 彭 浩1，2， 鄧百萬1，2， 解修超1，2， 王 穎1

(1.陜西理工大學生物科學與工程學院，陜西漢中 723001； 2.陜西省食藥用菌工程技術研究中心，陜西漢中 723001)

杜仲是我國特有的瀕危藥材，研究表明內生真菌可以產生與宿主相同或相似的活性物質，利用杜仲內生真菌解決杜仲資源缺乏的問題具有較深遠的應用前景。本研究較系統地闡述了近年來杜仲內生真菌的多樣性、次生代謝產物和提高內生真菌活性代謝產物產量的技術和方法，提出了研究中亟待解決的問題，以便為瀕危植物杜仲資源的保護、開發和利用提供理論依據。

瀕危植物；杜仲；內生真菌；次生代謝產物；活性

杜仲(Eucommiaulmoides)是杜仲科杜仲屬植物，為落葉喬木，是我國特有的珍貴樹種，別稱思仙、思仲、木棉，是僅存于我國的第三紀孑遺植物，屬于國家二類保護植物，主要分布于貴州、陜西、四川等省(區)[1]。杜仲作為藥材使用在我國已有兩千多年的歷史，其樹皮經過干燥可入藥，《神農本草經》《本草綱目》均把杜仲列為中上品，并明確記載其功效：“主治腰脊疼，補中、益精氣、堅筋骨、強志、除陰下癢濕、小便余瀝、安胎，久服輕身不老。”近代醫學研究發現，杜仲除傳統的醫療功效外，還具有雙向調節血壓、抗癌、抗病毒、愈傷和增強機體免疫功能等多種作用[2]，已引起國內外醫藥界廣泛關注。杜仲不僅是珍貴藥材，而且含有天然高分子材料杜仲膠。

植物內生真菌是指那些生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物各種組織和器官內部或細胞間隙而沒有引起宿主明顯病害癥狀的真菌[3]。研究表明，植物內生菌具有促進植物生長發育[4]、增強宿主抗逆性等功能[5]；而在與宿主相互作用的過程中，部分植物內生菌不僅具有促進宿主活性物質的生成和積累的能力，而且還能產生與宿主相同或相似的活性物質[6]。植物內生真菌產生的次生代謝產物具有生物學功能多樣性和化學結構多樣性，這些次生代謝產物從功能作用上可分為抑菌物質類、殺蟲物質類、植物生長調節劑類、抗腫瘤活性物質類及其他活性產物類型[7]。利用植物內生菌進行工業化發酵生產某些緊缺和新型藥物，為解決某些藥用植物生長緩慢、資源短缺等因素帶來的藥源緊張和生態破壞問題提供了新思路。

目前，對杜仲內生真菌的研究主要集中在內生真菌的分離方法、生物多樣性和生物活性等方面。本研究對瀕危植物杜仲內生真菌的多樣性、次生代謝產物以及提高內生真菌活性代謝產物的技術和方法進行探討，并對杜仲內生真菌研究中亟待解決的問題和前景進行展望，以期為瀕危植物杜仲資源的有效保護、合理開發和綜合利用提供依據。

1 杜仲內生真菌的多樣性

近年來，人們開始關注并進行內生真菌的研究。目前從植物組織中已分離出大量的內生真菌類群，但是通過對內生真菌與宿主專一性分析可知，平均每種宿主有4～5種專一性內生真菌，按地球目前已知25萬種植物計算，內生真菌總數可能超過100萬種[8]，可見植物組織和器官中存在大量的內生真菌資源亟待研究。

1.1 杜仲內生菌的種類和優勢菌群

杜仲內生真菌具有普遍性和多樣性的特點。目前，從杜仲中分離到的內生菌共有十余屬，且因地域、采集部位的差異而造成了菌株的多樣性。王麗麗等綜合運用形態特征和分子生物學技術從杜仲莖組織中分離到41株內生真菌，均為半知菌，屬于6個屬，分別是脈孢菌霉(Neurospora)、曲霉屬(Aspergillus)、白僵菌屬(Beauveria)、小菌核屬(Sclerotium)、 盾殼霉

屬(Coniothyrium)、離蠕孢屬(Bipolaris)[9]。楊明琰等采用組織分離法從秦嶺藥用植物杜仲莖部共分離到內生真菌38株[10]，經形態學鑒定分屬于9屬，其中青霉屬(Penicillium)為優勢菌群，擬青霉屬(Paecilomycessp.)、鏈格孢屬(Alternariasp.)和無孢群屬為常見屬。孫奎等從杜仲植物根、莖、葉中分離獲得80株內生真菌[11]，經形態顯微觀察，將其分類鑒定為14個屬，以鏈格孢屬、鐮刀菌屬(Fusariumsp.)為優勢種群。馬養民等從杜仲根、莖、葉中共分離出62株內生真菌，鑒定為15屬[12]。其中以鏈格孢屬為優勢種群，占總數的25.81%；其次是青霉屬(Penicillium)，占總數的16.13%。陳峻青等從杜仲的根、莖、葉中分離得到52株內生真菌[13]，經形態學觀察，分屬10個屬，其中鐮刀菌屬、鏈格孢屬、莖點霉屬(Phomasp.)、刺孢殼屬(Chaetomellasp.)為優勢屬。梁雪娟從慈利、略陽和遵義3個杜仲產地的杜仲皮組織塊中共分離出152株內生真菌[14]，經形態和分子手段相結合的方式對分離出的內生真菌進行鑒定，分屬于8屬，其中擬莖點霉屬(Phomopsis)、間座殼屬(Diaporthe)、鏈格孢屬為3個杜仲產地內生真菌共有屬，且為優勢菌群。

1.2 內生真菌在杜仲不同組織的分布

健康杜仲組織中內生真菌分布普遍，不同組織中均能不同程度地分離得到內生真菌，特別是在莖和根部中，內生真菌豐富。內生菌具有較高的生物多樣性水平，對同一植物而言，從中可分離到的內生真菌通常為數種至數十種，有的多達數百種[15]。

孫奎等研究表明，杜仲根部分布的內生真菌無論從數量還是種屬上都占優勢，根部分離33株，占總菌株的41.25%[11]。其中，根部不僅存在優勢種群鏈格孢屬、鐮刀菌屬和莖點霉屬，而且擬青霉屬(Penicilliopsissp.)、卵形孢霉屬(Oosporasp.)、瘤座孢屬(Tuberculariasp.)和尾孢屬(Cercosporasp.)只在根部分布。杜仲各組織內生真菌的分布有所區別，根部組織分離得到的內生真菌最多，這可能是因為根部組織與土壤直接接觸，而土壤中豐富的微生物可能會入侵到根部組織，從而形成內生真菌。同時，植株根部組織內營養豐富，適合內生真菌的生長。這些因素都為內生真菌的生長提供了良好的條件。姜交龍的研究也表明，杜仲根部組織分離出來的內生真菌的數量和種屬數都顯著高于其他組織[16]。

馬養民等研究表明，從杜仲根、莖、葉中分離的內生真菌種類和數量相差無幾，分離率分別為32.26%、33.87%、 33.87%[12]。陳峻青等研究表明，不同部位杜仲內生真菌的分布并不均勻，葉中分離的內生真菌數量大于根，葉中分離出22株內生真菌，占總菌株的42.31%，根中分離出16株內生真菌，占總菌株的30.77%[13]。

1.3 不同季節對杜仲內生真菌種類的影響

梁雪娟采用Simpson優勢度指數、Shannon多樣性指數和Pielou均勻度指數對杜仲皮內生真菌進行計算分析[14]，表明不同季節杜仲皮中內生真菌種群結構存有較大差異，多樣性不一。秋季為杜仲內生真菌分離的最佳時期，在此季節分離杜仲內生真菌得到的種類和數量較多，而夏季分離得到的種類和數量均較少。這種差異由宿主植物的生長和外部環境的變化共同導致，春季宿主植物生長呈蘇醒狀態，生長態勢逐漸增加，內生真菌在宿主植物體內的種群分布受到抑制，處于復蘇階段；秋季宿主植物生長緩慢，逐漸停滯，利于內生真菌種群在宿主植物體內的生長分布，內生真菌種類豐富，在數量和種類上都達到了高峰。楊明琰等研究也表明，秋季杜仲內生真菌分離的種類和數量大于春季[10]。這與陳遠友等對不同季節苦楝內生真菌的研究結果[17]一致，而與相延英等對不同季節三尖杉內生真菌的季節動態研究結果[18]略有差異，經分析是由于不同產地氣候及宿主種類不同，其內生真菌種群結構隨季節的演替變化也存在差異。

2 杜仲內生真菌次生代謝產物

藥用植物內生真菌不僅能夠促進宿主的生長發育，增強抗逆性，使宿主植物具備更優良的生長特性，且部分內生真菌可以增強藥用植物體內次生代謝產物的合成和積累，甚至內生真菌本身就能夠產生與宿主相同或相似的活性物質[19]。近年來，國內外有關專家對杜仲的活性成分進行了大量的研究，結果發現它主要含有黃酮類、苯丙素類、木脂素類、環烯醚萜類、多糖、杜仲膠及其他成分[20]。杜仲活性成分的藥用價值主要有降血壓、維持血壓平衡、抗衰老、抗氧化、增強免疫功能等作用。

2.1 杜仲內生真菌主要的次生代謝產物

植物內生菌具有生物學活性，能夠有效地促進宿主植物生長，增強宿主抗病能力和對環境脅迫的抗性[21-22]，也可產生與宿主植物相同或相似的生物活性物質[23-24]，例如從短葉紅豆杉(Taxusbrevifolia)的韌皮部中分離得到產抗腫瘤活性物質紫杉醇的內生菌Taxomycesandreanae[23]。

杜仲有種類繁多的化學成分和廣泛的藥理藥效，松脂醇二葡萄糖苷(PDG)是其主要的降壓成分[25]，屬于雙環氧木質素類。李愛華等首先從杜仲樹皮中分離得到8株可產生PDG的內生真菌，最高產量可達13.387 mg/L[26]。隨后，王維等采用響應面分析法對其發酵條件進行優化，該菌的PDG產量可以達到30 mg/L[27]，從而為用發酵法生產PDG提供了可能。劉超等從杜仲皮中分離得到3株具有產生松脂醇二葡萄糖苷能力的擬莖點霉屬內生真菌[28]，其中以菌株XP-8的PDG產量最高，達11.65 mg/L。Shi等通過高效液相色譜法(HPLC)檢測到從杜仲樹皮中分離的產PDG的內生真菌[29]。

Chen等研究表明[30]，從杜仲內分離出內生真菌Sordariomycetesp. B5可以產生綠原酸。閆興民通過高效液相色譜法發現，2株菌的初代培養中產生綠原酸，經分子鑒定分別為鏈格孢屬、黑孢屬，7個菌株可產生桃葉珊瑚苷，但在隨后的培養中卻無法檢測到綠原酸和桃葉珊瑚苷的存在[31]。有關杜仲內生真菌產綠原酸的次級代謝產物合成機制尚有待進一步研究。

目前，杜仲藥材主要由杜仲皮炮制而成，其中黃酮類化合物含量的高低是判斷杜仲能否用于制藥及其產品品質的重要指標[32]。由于杜仲生長緩慢，仍不能滿足市場對杜仲藥材的需求，若能篩選出產與杜仲相似活性成分的內生真菌，就有可能利用發酵技術的優勢生產相應的有效成分。霍娟等從杜仲葉片中分離到的1株刺孢殼屬菌株，通過薄層分析(TLC)和高效液相色譜(HPLC)測定得知此菌株與其宿主杜仲一樣能夠產生的抗氧化活性物質為黃酮類化合物[33]。沈書慶從杜仲植株中共分離得到44株內生真菌[34]，其中菌株DZ11能產出與其宿主相同或相似的黃酮類物質槲皮素，并且產量相對穩定，經過10次傳代，其發酵液中槲皮素的含量幾乎不變。通過紫外分光光度法和TLC法測定槲皮素的最高產量，分別為0.418、0.340 mg/L。

2.2 杜仲內生真菌抗菌活性研究進展

蘇印泉等以金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌為靶標菌株，對20株杜仲內生真菌及其次生代謝物進行抗菌活性篩選，發現有3株內生真菌及其次生代謝產物的抑菌作用較強[35]。李雅等研究了49株杜仲內生真菌及其次生代謝物對蘋果腐爛病病菌(Cytosporasp.)、番茄灰霉病病菌(Botrytiscintrea)、西瓜枯萎病病菌(Fusariumoxysporumf. sp.niveum)、黃瓜枯萎病病菌(Fusariumoxysporiumf. sp.cucumerinum)、玉米大斑病病菌(Helminthosporiumturcicum)和白菜黑斑病病菌(Alternariabrassicae)6種植物病原真菌的抑菌活性，其中4株內生菌的次生代謝產物對6種測試菌都有抑制作用[36]。

楊明琰等研究表明，杜仲內生真菌DZ05具有廣譜的抗菌活性，特別對番茄灰霉病病菌、番茄葉霉病病菌和蘋果炭疽病病菌抑菌圈達40mm以上[10]，說明它在這幾種病原菌的生物防治領域具有潛在的應用價值。

孫微微等對杜仲內生真菌抗菌活性篩選做了大量研究，發現1株炭疽菌屬(Colletotrichum)杜仲內生真菌DZGS07對蘋果炭疽菌有較強拮抗作用，具有較強的營養和空間競爭能力，顯微觀察表明它能造成病原菌菌絲畸形等現象[37]。同時，丁婷等以玉米紋枯病菌為指示菌，對杜仲內生真菌梭孢殼屬(Thielavia)的真菌DZGS08進行研究，發現它對玉米紋枯病菌具有較好的拮抗作用，抑菌帶寬度大于10 mm；玉米盆栽試驗結果顯示，防治效果為34.03%[38]。拮抗菌株DZGS08還能造成病原菌菌絲扭曲和畸形等現象。丁婷等還通過濃度梯度法獲得杜仲內生真菌抗性突變株DZJ07-2，發現它可在小麥根際定殖，且能誘導小麥植株根部的多酚氧化酶(PPO)、過氧化物酶(POD)和苯丙氨酸酶(PAL)防御酶活性的提高，在一定程度上增強了小麥對紋枯病的抗性[39]。

以上研究結果表明，杜仲內生真菌具有普遍的抗菌活性，在植物病害的生物防治領域有一定的應用前景。

3 提高杜仲內生真菌活性代謝產物產量的方法

目前，有關提高杜仲內生真菌活性代謝產物產量的研究報道較少，且多數集中在活性代謝產物菌株培養基優化方面。李愛華等以1株PDG高產菌株作為研究對象，應用Plackett-Burman試驗設計，對影響菌株發酵產PDG的諸多因子進行了評價，篩選出了影響發酵產PDG的主要內在因素[26]。通過響應曲面法對主要影響因子進行優化與評價，最終驗證試驗得出，當麥芽糖31.43 g/L、可溶性淀粉46.26 g/L、NH4Cl 2.38 g/L、NaNO32.27 g/L、FeSO40.14 g/L、KH2PO41.47 g/L時，可獲得PDG最大產量為27.628 mg/L，而在原來的查氏培養基上PDG的產量僅為13.387 mg/L，產量顯著提高[26]。另外，研究表明利用葡萄糖作為培養基碳源時不能產生PDG，這可能與PDG代謝途徑有關。劉超等通過分類鑒定確定產PDG菌株XP-8為擬莖點霉屬，優化其生長條件，發現在28 ℃、pH值5.0時生長最快[28]；該菌株對麥芽糖和葡萄糖的利用能力較強，不能利用蘋果酸，對硝酸鈉的利用能力較強，但不能利用天門冬氨酸。沈書慶對杜仲內生真菌產槲皮素菌株DZ11培養基進行篩選優化，發現它在豆芽汁培養基上菌絲不但生長快而且較為濃密[34]。通過單因素分析試驗，確定發酵菌株的最佳碳源、氮源、pH值、溫度分別是蔗糖、脲、7.0、28 ℃。通過正交試驗，得出適合杜仲內生真菌產槲皮素菌株DZ11菌絲生長的培養基：蔗糖25 g/L，脲2 g/L，裝量為120 mL或300 mL；適合杜仲內生真菌槲皮素積累的培養基：蔗糖30 g/L，脲2.5 g/L，裝量為100 mL或300 mL。通過優化產活性代謝產物菌株培養基，有利于提高杜仲內生真菌產活性代謝產物菌株的分離率，篩選新的菌株，獲得穩定高效的次生代謝產物。

4 討論與展望

杜仲內生真菌的多樣性及次生代謝產物活性研究中亟待解決的問題有以下幾點：

(1)與瀕危植物杜仲共生的微生物除了內生真菌以外還有內生細菌和內生放線菌，而杜仲內生細菌和放線菌是否也具有多樣性和普遍性有待進一步研究。內生細菌在杜仲組織也有被分離的報道，并且具有抗菌活性。龔鳳娟等從杜仲根中分離到5株ACC脫氨酶活性較高的內生細菌，其中4株菌對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌均有較好的抑菌活性[40]。

(2)分離部位、分離時間和采集地域的不同也會造成杜仲內生真菌的分離有顯著的差異性。因此，須要對杜仲內生真菌遺傳差異性做系統性研究。

(3)有關杜仲內生真菌研究重點主要集中在初步篩選產活性成分的菌株，例如分離產綠原酸、松脂醇二葡萄糖苷的菌株，但有杜仲關內生真菌產次生代謝產物的機制尚不清楚，合成相關基因是在共生時由宿主轉移至內生真菌，還是內生真菌與宿主同時進化獲得了合成能力有待進一步研究。

(4)現有研究已證明杜仲內生菌具有抗菌活性，但缺乏對抗菌活性成分的分離及抑菌機制的深入研究。并且尚未有將杜仲內生真菌代謝產物應用于藥物生產的實例。

杜仲屬國家瀕危藥材，傳統的采集和消耗珍貴野生植物的做法，勢必會造成資源的日益匱乏和環境的不斷惡化，故在研究杜仲內生真菌多樣性及次生代謝產物活性的同時應加大對杜仲資源的保護與利用，尤其是對野生杜仲資源保護。杜仲內生真菌種類豐富，其應用主要集中在2個方面：一是利用內生真菌進入杜仲組織內，促進杜仲生長，增加其抗逆性，并且刺激誘導杜仲細胞生成具有藥理活性的次生代謝產物，如綠原酸、松脂醇二葡萄糖苷和京尼平苷酸等；另一方面是利用內生真菌在試驗條件下進行發酵，以此來生產具有廣泛藥用價值的物質，如微生物農藥、抗生素和抗癌、抗腫瘤藥物等。

杜仲是我國特有樹種，并且具有種類繁多的化學成分和廣泛的藥理藥效，應用前景極為廣闊，在醫藥領域有較大潛力。利用杜仲內生真菌發酵產活性成分與從植物中提取有獨特的優勢，內生真菌不僅能在簡單的培養基上良好地生長，產生大量的發酵產物，還可在生物反應器中人為控制各種參數，并可通過誘變育種等手段改變菌種性能以提高活性成分產量，便于實現大規模工業化生產，前景廣闊；此外，對于天然藥物新生成途徑的開發及瀕危藥用植物杜仲的保護具有十分重要的經濟及生態效益。利用微生物發酵技術解決杜仲資源缺乏的問題將成為研究熱點，相信隨著研究的深入，杜仲內生真菌在開發利用杜仲資源方面前景光明。

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10.15889/j.issn.1002-1302.2017.02.005

2016-07-24

陜西省“13115”科技創新工程(編號：2008ZDGC-04)。

何 強(1992—)，男，陜西西安人，碩士研究生，從事植物內生菌資源及相關開發利用研究。E-mail：heqiang0715@126.com。

陳文強，教授，碩士生導師，主要從事微生物資源的保護與利用研究。E-mail：wenqiangc@126.com。

S182

A

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何 強，陳文強，彭 浩，等. 瀕危植物杜仲內生真菌及次生代謝產物活性研究進展[J]. 江蘇農業科學，2017，45(2)：20-23.