2011～2014年廣州地區無償獻血者核酸檢測結果分析

梁浩堅+汪傳喜+許結儀+鄭優榮+李仲平+藍嵐茵+林詩雅

[摘要]目的評估核酸檢測技術應用于廣州地區無償獻血者血液篩查的功效。方法采用Grifols公司（原諾華診斷公司）PROCLEIX TIGRIS全自動核酸檢測分析系統和PROCLEIX ULTRIO HIV-1/HCV/HBVAssay核酸檢測試劑，對2011年1月～2014年12月的1 146 740例無償獻血者血液標本進行HIV/HCV/HBV三項單人份核酸檢測，同時采用血清學試劑進行HBsAg，HCVAb，HIVAb/Ag檢測。對核酸檢測單獨反應性標本（血清學陰性，核酸檢測反應性）進行鑒別試驗以確定感染病毒種類。結果1146740例獻血者血液標本，核酸檢測的反應性比率為0.97%（10 645/1146 740），低于血清學HBsAg，HCVAb，HIVAbAg三項總的檢測陽性率1.66%（19024/1146740）。在1114428例經血清學全項檢測合格的標本中，單人份核酸檢測共檢出2457例核酸反應性樣本，核酸單獨反應性比率為0.22%；在2457例核酸單獨反應性標本中，鑒別試驗反應性的樣本為718例，其中，HBV-DNA 711例，HCV-RNA4例，HIV-RNA 3例。核酸鑒別試驗陽性率為29.22%（718/2457）。結論目前在廣州地區輸血傳播疾病的殘余風險主要還是輸血感染HBV。核酸檢測技術應用于血液篩查，將有助于縮短病原體檢測的窗口期，降低輸血殘余風險，血清學和核酸檢測兩種方法互為補充，應同時使用以保障血液安全。

[關鍵詞]核酸檢測；血液篩查；輸血風險；血液安全；轉錄介導擴增技術

輸血相關傳染病的預防和控制是全社會關注的焦點之一。2010年，國家衛生與計劃生育委員會（原衛生部）確定在全國15家采供血機構開展核酸檢測（NAT）試點工作，以進一步保證血液檢測質量，提升我國無償獻血者血液檢測水平。到目前NAT技術已經廣泛運用于全國各地血站的血液篩檢。該技術的檢測靈敏度較ELISA檢測方法高，能顯著縮短病原體檢測的窗口期，從而降低輸血傳播病毒的殘余風險50%以上。但NAT技術從理論上并不能完全消除“窗口期”，國外已有經核酸檢測后仍發生輸血后感染的病例報道，包括HIV和HBV。本中心2010年11月正式將NAT技術應用于血液篩查項目中，對全部無償獻血者血液標本進行HBV DNA、HCV RNA和HIV RNA核酸檢測。本研究通過對無償獻血者血液標本的常規血清學及核酸檢測結果的分析，以評估核酸檢測的檢測功效，以及本地獻血者人群的感染狀況。現將檢測結果報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

2011年1月～2014年12月，廣州血液中心采集的無償獻血者血液標本1146740例。所有無償獻血者均符合現行的衛生部《獻血者健康檢查要求》（GB18467-2011）。血液采集后同時留取核酸檢測標本和酶免檢測標本管各一支。核酸檢測標本采集、保存和處理等均嚴格按照衛生部核酸檢測試點技術要求操作。

1.2主要儀器與試劑

核酸檢測儀器：Grifols公司（原諾華診斷公司）PROCLEIX TIGRIS全自動核酸檢測分析系統，試劑配置恒溫箱（RPI）。試劑為PROCLEIXULTRIO Assay核酸聯檢試劑盒和核酸鑒別試劑盒（Discriminatory Assay）。核酸檢測試劑批號：（593226，614952，624775，116153等）。血清學檢測儀器：STAR全自動加樣儀和全自動酶聯免疫分析儀（FAME24/30）。ELISA檢測主要試劑包括乙肝表面抗原試劑盒（法國梅里埃，批號B11FA，20110704；上海科華：批號201101031，201201011，201302011）、丙型肝炎抗體試劑盒（美國強生ORTHO：批號EXE187，EXE208；上海科華：批號201103011，201202031，201303011）及人類免疫缺陷病毒（HIVl/2）抗原抗體檢測試劑盒（法國伯樂，批號1F0189，280213，3F0259；北京萬泰，批號1201 10204，120121 120，12013 1022）。

1.3檢測策略

血液標本采用血清學和NAT并行檢測操作策略；對核酸檢測單獨反應性標本進行分項鑒別試驗。

1.4檢測方法

采用PROCLEIX TIGRIS 全自動核酸檢測分析系統（TMA方法）對血液核酸標本進行單人份聯合檢測（HIV-1/HCV/HBV）；對核酸檢測單獨反應性標本進行分項鑒別試驗；核酸檢測結果反應性結果由檢測系統軟件自動判定，其判定標準為樣本的S/CO值≥1。采用兩種不同廠家的ELISA試劑對獻血者標本進行血清學HBsAg、HCVAb、HIVAgAb檢測，嚴格執行說明書進行相關操作，通過陰陽性對照及室內質控品來控制試劑盒的質量和檢測的有效性；血清學檢測結果陽性的判定：樣本OD≥cut off值。

1.5檢測原理

Grifols核酸檢測試劑是以轉錄介導的擴增（transcription-mediated amplification，TMA）技術原理來檢測病毒核酸的方法。其檢測基本原理是：利用特異性的目標捕獲試劑和磁微珠分離純化被檢測病毒核酸分子，再通過TMA技術來擴增HBVDNA、HCV RNA和HIV-1 RNA（1型）的核酸片斷，最后通過雜交保護（HPA）方法檢測擴增產物。試劑中含有內標分子，用以監測整個反應過程，避免出現假陰性結果。

1.6統計學方法

采用SPSS17.0統計軟件進行處理和分析，對計數資料進行x²檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

2結果

2.1血清學與核酸檢測結果的比較

對1 146 740例獻血者血液標本，核酸檢測的陽性檢出率為0.97%，低于血清學（HBsAg，HCVAb，H1VAbAg三項之和）的檢測陽性率1.66%，二者之間的差異具有統計學意義（x²=2128.4，P<0.05），見表1。

2.2核酸檢測

4年中Grifols單人份核酸檢測系統的總陽性率為0.97%，并且陽性率呈現逐年緩慢增加的趨勢。在對每年的檢測陽性率進行比較時，各年度間檢測陽性率未見統計學意義（x²=2.442，P<0.05），見表2。

2.3血清學合格標本中核酸檢測情況

在1114428例血清學檢測合格標本中，單人份核酸檢測共檢出2457例核酸反應性樣本，核酸單獨反應性比率為0.22%；在對每年檢測陽性率進行比較時，各年度間血清學檢測合格標本其NAT檢測陽性率之間的差異具有統計學意義（x²=16.506，P<0.05），見表3。

2.4核酸鑒別結果

在2457例核酸單獨反應性標本中，鑒別試驗反應性的樣本為718例，其中，HBV-DNA 711例，HCV-RNA 4例，HIV-RNA 3例，獻血者中核酸單獨陽性的樣本大多屬于HBV感染，HBV DNA鑒別陽性率與另外兩者間的差異具有統計學意義（x²=2091.464，P<0.05）。核酸鑒別試驗總陽性率為29.22%（718/2457）。見表4。

3討論

目前，國內外應用于血液篩查的核酸檢測技術主要有TMA及PCR兩種。我中心使用的是Grills公司基于TMA技術的核酸檢測試劑，對全部獻血者樣本進行單人份核酸檢測。這種檢測方法的靈敏度高，反應條件簡單，擴增效率高，可以防止低拷貝的病毒陽性血液的漏檢。其分析靈敏度為：HBVDNA 10.4IU/mL，HCV RNA 3.0IU/mL和HIV RNA45.0IU/mL。并且該方法的整個反應過程在1個試管中進行，因此也減少了污染發生的可能。本研究顯示，廣州地區無償獻血者血液標本的核酸陽性檢出率明顯低于酶免檢測項目陽性檢出率（P<0.05）。在所有因輸血傳播病毒項目檢測不合格而淘汰的21481份標本中，血清學和NAT一致陽性的僅有8616份（占40.1%），而血清學單獨陽性的有10408份（占48.5%），NAT單獨陽性的有2457份（占11.4%）。對于這部分檢測結果不一致的情況，一方面是由于血清學和核酸檢測都存在檢測的假陽性的可能，另一方面也說明了血清學和核酸檢測二者具有的互補作用。因此在目前的技術條件下，血清學和核酸檢測對獻血者的篩查是缺一不可的。

在獻血者血液篩查中引入核酸檢測技術，其主要目的是檢測出原有血清學檢測可能漏掉的具有感染性的獻血者樣本。在本研究中的1114428份血清學檢測合格標本中，單人份核酸檢測共檢測出反應性樣本2475例，陽性檢出率為0.22%（2457/1114428），結果明顯高于大連和沈陽地區0.07%，這可能與各地區病毒流行率差異、檢測樣本數量、使用試劑差異，以及檢測模式（單人份與多人份混樣檢測）不同有關。在對這些核酸單獨陽性樣本的鑒別檢測中，共檢出718例陽性結果，鑒別陽性檢出率為29.22%。這個鑒別率與汪德海等報道的一致，而低于大連，杭州等地的數據。而出現核酸檢測聯檢反應性，而鑒別試驗全部為非反應性的原因可能有：（1）聯檢結果假陽性。這可能是由于酶免及核酸檢測平行進行，檢測人員若操作不規范，導致陽性標本的小范圍污染，增加聯檢結果假陽性的可能；或由于檢測試劑本身的非特異性反應。（2）鑒別試驗的假陰性。如病毒濃度處于極低的濃度水平，由于病毒顆粒在血漿中的泊松分布，導致取樣時未能吸取到帶有病毒的樣本；或可能是因不合適的儲存條件，不良的運送，干擾物質的存在，導致樣本中病毒的降解，也會造成鑒別試驗假陰性的結果。由于我國乙肝的流行率相對較高，因此獻血者中核酸單獨陽性的樣本大多屬于HBV感染。而HBV感染，特別是隱匿性乙肝感染（OBI）的病毒濃度通常很低，因此出現上述低濃度樣本的可能性很大。已有文章報道，對于不可鑒別的樣本，采用其他核酸檢測方法，或乙肝感染標志物（如乙肝核心抗體）進行檢測時，部分樣本仍然呈現陽性結果。提示這些不可鑒別的樣本中存在一定比例的真陽性。

從結果中可以看出目前廣州地區無償獻血者的HBV感染率較高，輸血傳播HBV殘余風險明顯高于HCV和HIV，從核酸鑒別試驗數據分析，在718例鑒別陽性結果中，HBV DNA陽性711例，占99.03%。文獻報道，HBV輸血殘余風險主要來自于血清轉換前的窗口期、變異病毒株和隱匿性HBV感染3個方面。其中獻血者中的HBV DNA單獨陽性者大部分屬于隱匿性HBV感染，表明輸血殘余風險主要來自于隱匿性HBV感染。本文檢出HCV RNA 4例和HIV RNA 3例，其中HCV RNA及HIV RNA各一例送衛生部臨檢中心驗證為陰性。另外2例HIV RNA因獻血者聯系電話注銷，無法進行隨訪追蹤，3例HCV RNA中2例經確證為陽性。在2015年鑒別試驗中，又發現HIV RNA陽性2例，送惠州市中心血站作定量檢測后確證為HIV陽性。經隨訪追蹤獻血者，一周后再進行檢測，血清學及核酸檢測均為陽性，因此確定該2例標本為HIV“窗口期”感染。

血清學檢測的是抗原或抗體，NAT檢測的是病毒核酸，核酸檢測能從血清學檢測陰性的標本中檢出漏檢的病毒感染者，是血清學檢測的有力補充，我國許多城市自引入核酸檢測后也多有這方面報道。在本研究中的1114428份血清學檢測合格標本中，單人份核酸檢測共檢測出反應性樣本2475例（0.22%），證實核酸檢測的必要性。將NAT技術應用于血液篩查，可以顯著降低因血清學漏檢而導致的輸血傳播疾病的殘余風險，進一步提高血液安全，以保障臨床用血安全。