精草潤目液治療大鼠干眼模型的實驗觀察

王詩敏，李點

干眼是由于淚液的量或質或流體動力學異常引起的淚膜不穩定和（或）眼表損害，從而導致眼不適癥狀及視功能障礙的一類疾病。臨床出現的各種名稱（如干眼癥、干眼病及干眼綜合征等）均統一稱為干眼[1]。近年干眼的發病率呈上升趨勢，已嚴重影響患者的生活和工作。本研究的前期臨床觀察證實，精草潤目液治療干眼有良好療效，為進一步探究其作用機制，觀察該滴眼液對干眼模型角膜上皮和淚液分泌量的影響進行了本實驗。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及藥品

選用SPF級健康SD大鼠60只，體質量150～300 g，雌雄各半，由斯萊克景達實驗動物公司提供（合格證編號：43004700016330），在湖南中醫藥大學SPF級動物實驗中心進行普通飼料適應性喂養3 d，并雙眼滴0.25%氯霉素滴眼液0.05 ml/(眼·次)，5次/d。實驗前所有動物經裂隙燈（上海施惠醫療器械有限公司，SLM-2型）行外眼檢查，均無異常，可納入研究。

表1 角膜上皮損傷評分表

試劑：0.4%的鹽酸奧布卡因滴眼液：日本參天制藥株式會社。0.5%鹽酸利多卡因注射液：國藥集團容生制藥有限公司。0.25%氯霉素滴眼液：四川美大康華康藥業有限公司。1%苯扎溴銨溶液：上海運佳黃埔制藥有限公司。0.5%羧甲基纖維素鈉滴眼液：Allergan，InC。0.2%卡波姆滴眼液：Dr.Gerhard Mann，Chen.-pharm.Fabrik GmbH。0.9%NaCl注射液：湖南科倫制藥有限公司。0.5mg/ml阿托品注射液：苪城天通動保藥業有限公司。2%熒光素鈉溶液，由湖南中醫藥大學制劑室配置。Schirmer測定濾紙：天津晶新技術開發公司。

精草潤目液的制備：黃精浸泡后回流提取并濾過，減壓濃縮。濃縮液加活性炭，煮沸，放冷，冷藏靜置后抽濾，濾液在攪拌下加入乙醇使含醇量達到80%，濾過，取沉淀物，烘箱中干燥至恒重，即得黃精多糖。魚腥草蒸餾提取，收集芳香水。取魚腥草芳香水1000 ml及黃精多糖（高、中、低劑量組分別取黃靜多糖2 g、1.5 g、1 g，最終的藥物濃度分別為0.2%、0.15%、0.1%）。混合再加入氯化鈉攪勻，調pH值至7.0，高速離心，滅菌備用。溶劑的制備：將氯化鈉攪勻，加蒸餾水后調pH值至7.0，高速離心，滅菌備用。

裂隙燈顯微鏡、5 ml無菌注射器、5號針頭、鑷子、持針器、眼科剪、秒表、縫合針、1號黑絲線。

1.2 造模及分組

1.2.1 大鼠角膜上皮損傷干眼模型：用摘除淚腺后、滴加苯扎溴銨溶液的方法制備大鼠角膜上皮損傷干眼模型[3-4]。30只大鼠，雙眼周去毛、消毒，0.4%的奧布卡因表面麻醉，0.5%利多卡因1 ml球后麻醉，在大鼠耳前皮膚上剪一小口，剝離并摘除雙側淚腺，雙眼滴1%苯扎溴銨溶液，第2天觀察角膜情況。

分組及給藥：將造模成功的30只大鼠隨機分為5組，每組6只。第1組為空白對照組，用溶劑治療；第2組為陽性藥物對照組，用0.5%羧甲基纖維素鈉滴眼液治療；第3、4、5組分別采用高、中、低劑量精草潤目液治療。 滴眼液的使用：4 次/(眼·d)，0.05ml/次，用藥21 d。記錄用藥第7、14、21天角膜上皮損傷情況。

檢測方法及評分標準：熒光素鈉角膜染色采用5 ml注射器、5號針頭將熒光素鈉1滴滴入結膜囊內，5 min后在裂隙燈顯微鏡藍光下觀察角膜上皮的情況，每周觀察1次。評分標準[5]見表1。

1.2.2 淚液分泌低下大鼠模型：參照Burgalassi淚腺注射阿托品的方法進行淚液分泌低下干眼動物模型的造模[6]。30只大鼠，雙眼滴0.4%鹽酸奧布卡因滴眼液，在淚腺注射阿托品 0.25 ml/眼（0.5 mg/ml），予每日雙眼下淚腺注射阿托品4次，記錄每日注射阿托品0.5 h后大鼠淚液分泌試驗的結果，持續注射至第7天。

分組及給藥：除陽性藥物對照組采用0.2%卡波姆滴眼液治療外，余分組及給藥方法同前。記錄治療的第7、14、21天每只眼的淚液分泌量。

淚液分泌試驗（SchirmerⅡ）：考慮SD大鼠眼球較小，不適合用適用于人類大小的濾紙條測試，故采取將其剪成兩半的方式進行檢測，以5 mm×35 mm濾紙一條，剪成兩個各2.5 mm×35 mm大小的濾紙，在首端處反折，輕巧地置于下瞼中后部1/3交界處，5 min后取出紙條，取出后2 min測濾紙濕長，反復測3次，取平均值。每周觀察1次。

1.3 統計學方法

使用SPSS 17.0進行統計學分析。計量資料以xˉ±s表示。大鼠造模前后淚液分泌量比較采用配對t檢驗；各組大鼠不同時期淚液分泌量和角膜上皮損傷評分值的比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠角膜上皮損傷干眼模型

治療前各組間的角膜上皮損傷評分差異無統計學意義（P＞0.05），治療 7 d 及 14 d，低、中、高劑量組與陽性藥物對照組相比，角膜上皮損傷評分差異均無統計學意義（P＞0.05）；治療21 d，僅有精草潤目液高劑量組的角膜損傷評分與陽性藥物組相比差異有統計學意義（P＜0.05）；其中精草潤目液高劑量組的角膜損傷評分明顯低于中、低劑量組（P中=0.012，P低=0.001），中劑量組與低劑量組之間相比差異無統計學意義（P=0.151）（表 2）。

2.2 大鼠淚液分泌低下干眼模型

造模前，大鼠的淚液分泌量為（9.02±1.29）mm，造模后減少為（3.07±1.23） mm（t=4.326，P＜0.001），提示造模成功；造模前及造模后各組間淚液分泌量差異無統計學意義（P＞0.05），說明各組的淚液分泌量具有可比性；在治療7、14及21 d，低劑量組淚液分泌量始終低于陽性藥物對照組，差異具有統計學意義（P＜0.05）；而在治療 21 d，精草潤目液中、高劑量組的淚液分泌量明顯高于陽性藥物對照組 （P＜0.05），并且高劑量組的淚液分泌量要高于中劑量組（P=0.018）（表 3）。

3 討論

干眼的發病，或由素體肺陰不足，燥熱犯目；或情志不舒，郁火內生，津傷血壅；或久病、年老體衰、過用目力，陰津損耗；或風熱眼或天行赤眼治療不徹底，余熱未清等，致津液虧虛，目失濡潤而生燥。精草潤目液選用黃精和魚腥草兩味藥組方。黃精有補氣滋陰的功效，黃精多糖是黃精生物活性物質的一個非常重要的成分，具有一定的抗氧化、提高免疫力、抗菌抗炎及調節細胞內分泌等作用[7]，用黃精多糖制成的滴眼液有抗炎、抗病毒、抗滲出、抗增生的作用[8]。魚腥草的成分復雜，其中揮發油成分主要為癸酰乙醛（魚腥草素）及月桂醛，而癸酰乙醛對多種細菌有明顯的抑制作用，魚腥草還具有增強免疫功能、增加白細胞吞噬能力和促進組織再生等作用，對增加機體免疫能力、抑制干眼引起的眼表上皮細胞炎癥反應有一定療效[9]，既往有應用魚腥草制劑治療干眼的報道[10]。

表2 各組角膜上皮損傷干眼模型大鼠的角膜上皮損傷評分比較（xˉ±s，n=12）

表3 各組淚液分泌低下干眼模型大鼠的淚液分泌量（Schirmer II試驗）比較（xˉ±s,mm，n=12）

臨床上治療干眼主要應用人工淚液治療。羧甲基纖維素鈉滴眼液是具有代表性的一種人工淚液，它具有較強的黏稠性，是一種較理想的角膜表面潤滑劑，能對角膜、結膜提供良好的濕潤作用，而完整和有效的淚液成分和淚膜分布能加速角膜上皮的愈合，減輕角膜痛覺，利于減輕刺激癥狀。唯地息是由德國生產的含有0.2%卡波姆的親水凝膠,由固相基質和水相分散層組成,類似淚膜的二層結構即黏液層和水層,可在眼球表面形成液體儲庫,每眨眼1次凝膠中的水分即可部分釋放以補充淚液,因此唯地息可適用于淚液分泌減少的替代治療。相比而言，羧甲基纖維素鈉滴眼液對角膜的保護作用更好，而且不含防腐劑，避免了防腐劑對眼表的再次損傷，故用于第一種模型；卡波姆滴眼液補充淚液的作用更強，且為凝膠制劑，作用更持久，是淚液的良好替代品，更適合于第二種動物模型。

干眼的治療目標是重建高質量穩定的淚膜，緩解癥狀，促使角膜上皮愈合，減少淚膜異常相關并發癥的發生。基于此，我們分別觀察了精草潤目液對角膜上皮損傷大鼠和淚液分泌低下大鼠的影響。在角膜上皮損傷模型，用藥干預21 d后，高劑量組角膜損傷評分明顯低于陽性藥物治療組。在淚液分泌低下模型，高、中劑量組的淚液分泌量有隨治療時間延長逐漸增加的趨勢，用藥21 d時，這兩組的淚液分泌量明顯高于陽性藥物對照組，而低劑量組干預后的淚液分泌量始終低于陽性藥物對照組。上述結果提示，足夠濃度的精草潤目液在治療一定時間后，對于修復角膜損傷、促進淚液分泌均有明顯作用，藥物的療效與藥物的濃度及治療時間相關。現代醫學認為炎癥是各種不同類型干眼的共有發病機制[11-14]，即慢性炎癥通過刺激眼表細胞激活局部的免疫反應，引起淚膜穩定性下降，增加淚液滲透壓，繼而導致干眼的發生。我們因此推測，精草潤目液的作用機制可能與對炎癥反應的調節作用有關。

綜上所述，精草潤目液能明顯減輕干眼大鼠模型的角膜上皮損傷，并增加淚液分泌，在適當的濃度及治療時間下，其療效優于陽性藥物（羧甲基纖維素鈉滴眼液及卡波姆滴眼液）。精草潤目液的藥效機制尚需進一步研究。