超聲波輔助的植物轉化方法的研究進展

王建軍，馮莉赟，申虎飛，劉 佼

（山西農業科學院隰縣農業試驗站，山西隰縣041399）

超聲波輔助的植物轉化方法的研究進展

王建軍，馮莉赟，申虎飛，劉 佼

（山西農業科學院隰縣農業試驗站，山西隰縣041399）

為了探索超聲波處理在植物轉化中的功效及潛在發展能力，從超聲波輔助植物轉化的原理入手，歸納了方法的驗證、超聲波處理的受體材料和超聲波處理對外源DNA的影響；總結了前人在超聲波輔助植物轉化方面的研究進展，進而分析了方法自身的優缺點及存在問題。指出超聲波輔助植物轉化方法雖然處于初級發展階段，但超聲波輔助的植物轉化仍然是一個操作簡單、省時省力、適用范圍廣的植物轉化方法，文中還提出了存在的問題且給出了相應的解決對策；通過分析認為超聲波輔助的植物轉化方法具有廣闊的發展前景。

超聲波；輔助；植物；轉化方法

0 引言

植物轉基因研究已有30多年的歷史，自從1983年第一例轉基因煙草植物問世以來[1]，轉基因植物的新品種培育及其產業化的發展非常迅速、趨勢向好。目前，植物轉基因的方法有農桿菌介導法[2]、基因槍法[3]、花粉管通道法[4]、PEG介導法[5]、電激穿孔法[6]、電泳法[7]、激光微束法[8]等，其中全球通用的，也是應用較多的是前3種方法。雖然這些方法各有特點，并在植物轉基因研究中做出了很大貢獻，但這些方法仍然存在不同程度的缺陷，如有些方法過程冗長、操作繁瑣，有些方法受限于植物的基因型，一些化學轉化方法可能產生細胞毒害，特別是一些轉化方法還需要貴重精密的設備等。為了能開發出一種既能克服這些缺陷又能提高轉化效率的植物轉化方法，眾多學者進行了大量的研究工作，超聲波介導的植物遺傳轉化方法就是其中成功的一例。

超聲波是一種頻率高于20000 Hz的聲波，特點是直線傳播、能量大。由于其特有的機械效應、空化效應和生物學效應等，應用范圍十分廣闊。英國學者Rayleigh[9]于1917年發表的論文《液體中球形空穴崩潰時產生的壓力》為今天根據超聲波原理設計各種儀器設備并應用于醫學、工業和分子生物學研究提供了重要的理論依據。也正是基于這種理論，超聲波被用來輔助其他動植物的轉化方法，試圖能以此來解決植物轉化過程中的基因型依賴性、轉化效率低等難題。

周光宇[4]根據遠緣雜交現象，提出了DNA片段雜交理論，使外源DNA導入植物細胞并產生變異后代有了理論依據。1990年許寧等[10]根據超聲波的作用原理，提出“超聲誘導基因轉移”方法，并在小麥幼胚和動物細胞上成功轉化。同年，Joersbo等[11]將氯霉素乙酰轉移酶基因(CAT)導入甜菜和煙草原生質體中，發現轉化子中目的基因的瞬間表達；1991年章力健等[12]將GUS基因、卡那霉素抗性基因和NPT??基因導入到煙草葉片小塊，得到轉化小苗，轉化率達到22.3%；1997年，Trick等[13]將超聲處理技術與農桿菌介導轉化法相結合，建立了超聲波輔助農桿菌遺傳轉化方法(SAAT)，他們用此法將GUS基因導入大豆和豇豆組織中，發現GUS基因的平均短暫表達頻率提高100～140倍；同年王景雪等[14]報道利用超聲波輔助花粉介導法獲得轉基因玉米植株，轉化率高達42.9%，這是關于超聲波輔助花粉介導遺傳轉化玉米并得到可育轉化后代的首例報道；2002年，陳定虎[15]報道將攜帶PAP基因的植物轉化載體導入玉米材料中，獲得1個轉化事件；解志紅[16]將幾丁質酶基因轉化棉花遠緣雜交高代材料，轉化率達到32%；隨后采用超聲波輔助植物轉化方法在谷子[17]、油菜[18]、花生[19]、高粱[20]、野罌粟[21]、黃花梨[22]等植物上也有轉化成功的報道。

超聲波輔助植物轉化方法雖有操作簡單、周期較短、克服了植物轉化過程中的基因型依賴性等優點，但其較為突出的缺陷是不同植物、不同品種、不同的外植體都要求不同的超聲波處理強度、處理時間和間歇時間，具體實驗要各自尋找最佳超聲波處理參數的組合，所以顯得較繁瑣，不能一勞永逸，加之目前所能使用的超聲波發生儀及探頭的質量不過關，易破損，給實驗操作帶來不必要的困擾。另外超聲波處理易導致受體材料的機械損傷和熱損傷，轉化效率較低。

為提高轉化效率，進一步簡化操作流程，有必要對前人的研究工作進行總結，以便發現和解決轉化方法還存在的理論和技術問題，為國內大規模開展轉基因研究提供技術儲備。

本研究就超聲波輔助的植物轉化方法的研究進展情況予以綜述，希望能為相關領域的研究工作提供一些有價值的參考資料。

1 超聲波輔助植物轉化方法的原理及驗證

超聲波輔助植物轉化的原理，關于超聲波輔助植物轉化的原理，眾說紛紜，目前還沒有一個肯定而確切的定論。不過，大多數說法都圍繞Rayleigh的超聲波能產生空化效應的理論，認為空化效應是超聲波能夠輔助植物轉化的根本原因。在此基礎上，形成了目前較有說服力的2個假設：（1）1980年，Zimmermann等[23]提出，假設細胞膜的實際膜厚度是由膜兩側的電壓和所施加的壓力決定的，膜被擠壓的程度取決于其的介電常數和抗壓強度等，并預測存在著一個可以引起細胞膜機械損傷的膜電位差，而且這個理論預期值的臨界壓力取決于假設了膜的彈性模量的壓力依賴性和固有膜電位，這就是著名的Zimmermann電場機制模型；1991年，Joersbo等[11]根據這個模型提出了使用溫和的超聲波輔助對植物原生質體進行轉化的新方法，認為在超聲波作用下，細胞膜內的流體靜壓力引發細胞膜的可逆性破裂，從而引發細胞與周圍介質的物質交換。（2）1997年，丁志山和沃興德[24]根據超聲波的生物學效用是由空化現象產生的，提出超聲波處理時產生的空化泡在破裂時會釋放出瞬時的高壓與高溫，這種高溫高壓所形成的沖擊波可能會導致細胞質膜的局部破裂，使得細胞周圍的物質如外源DNA能夠進入細胞內，引發細胞被轉化。這2種假設的共同點是都用超聲波處理，引起細胞膜損傷而形成物質的跨膜交換，不同點是細胞膜損傷的機理不同，前者認為細胞破裂是由于超聲波處理下，膜內流體靜壓力發生改變所致，后者認為是由于超聲波所產生的沖擊波直接損傷細胞膜。在某一轉化事件中，也可能這種原理都起一定作用。

實驗驗證：路德明等[25]用超聲波處理鹽藻，發現超聲波強度大小是鹽藻細胞能否破碎的主因，一定時間范圍內隨著作用時間的增加，鹽藻破碎率呈直線上升，最高破碎率可達80%，此后再延長工作時間，鹽藻破碎率變化不大；Gambihler等[26]用超聲波處理‘L1210白血病細胞’時發現，超聲波處理既可減少細胞膜原有厚度，又可使細胞膜的通透性增加，這樣有益于將外源DNA導入細胞；Tachibana等[27]用0.3 W/cm2、48 kHz超聲波強度處理‘HL-60細胞’的懸浮液，發現低強度的超聲波就能使細胞膜的脂質雙分子層結構發生變化，細胞膜的通透性也因而增強，結果便是Ara-C更容易進入‘HL-60細胞’，細胞毒性因而得到加強；Parvizi等[28]在用超聲波處理大鼠軟骨細胞蛋白聚糖合成時發現，超聲波的空化作用增加了軟骨細胞的通透性，加速了鈣離子內流；盧群等[29]用超聲波處理酵母細胞，發現當超聲波參數為300 W的功率，工作時間3 s，間隔時間為4 s，工作30次時，透射電鏡觀察的結果是，細胞膜有不同程度的損傷，并且形成可逆小孔，即“穿孔效應”，并認為這是細胞膜通透性提高的主要原因。當超聲波參數增加為功率為500 W，總作用時間為225 s，脈沖時間為3 s時，膜的損傷也嚴重一些，但細胞并沒有死亡，一定時間的自我修復后細胞又會恢復正常；姚詠嫦[30]更巧妙地選擇能生產1,6-二磷酸果糖(FDP)的酵母細胞作為研究對象，用超聲波處理酵母細胞后，根據細胞的生存能力和介質中FDP濃度的變化，間接證明膜通透性的改變，用400、500、600 W功率的超聲波分別進行處理，結果發現：600 W的超聲波功率處理時，隨著時間延長介質中FDP的滲出濃度逐漸提高，在處理間隙時間為4 s時，3種處理均使介質中FDP濃度增加，但當間隙時間增大到6、8、10 s時，FDP的濃度不增反降，再延長間隙時間為12 s時，FDP的濃度又開始上升，同時還注意到，同樣的處理，介質中核酸、蛋白質濃度的變化不如FDP那么大，分析可能是因為FDP分子比較小，更容易穿透細胞膜所致。

上述研究根據細胞顏色的變化、顯微鏡或電子顯微鏡觀察、細胞毒性分析等，取得了充分可信的證據證明超聲波處理可以增加細胞膜的通透性，為超聲波輔助植物轉基因研究提供了科學依據。目前，有關超聲波輔助植物轉化的方法有2種，一是超聲波輔助其他植物轉化方法的轉化方法，如超聲波輔助農桿菌介導法、超聲波輔助花粉介導法等，它們以通常的轉化方法為主，輔助于超聲波處理用來提高該方法的轉化效率等；二是超聲波處理直接導入法，即直接將外源基因的DNA片段用超聲波處理方式導入到受體組織或細胞中，不需要農桿菌介導等技術手段。

2 超聲波處理的受體類型

作為超聲波處理的受體材料也是超聲波輔助轉化方法研究的主要內容之一，因為植物組織、器官或者細胞的生理年齡、基因型等與轉化效率有關，篩選易于得到、方便操作、適于轉化的材料作為處理對象是為了獲得轉化材料和提高轉化效率的有效手段。據不完全統計，用作受體接受超聲波處理的植物材料有葉片、子葉、子葉節、莖段（包括莖尖）、愈傷組織、百合鱗片、胚軸、細胞（包括原生質體、花粉、單細胞植物等）、胚（包括幼胚和成熟胚）、幼根、上表皮細胞等。不同植物品種的同一材料（如大豆葉片和煙草葉片）、同一植物品種的不同材料（如子葉、胚、莖段等），超聲波的處理強度、處理時間都不盡相同，選擇合適的超聲波處理參數是超聲波輔助植物轉化研究的重要任務。因為后文在介紹研究進展時要涉及這方面的具體內容，故就不加詳述。

3 超聲波處理對外源DNA的影響

外源DNA的完整性也是關系到轉化成敗的關鍵因素之一。超聲波處理時所產生的強大外力直接或間接地導致外源DNA分子斷裂，這樣即使轉化成功，目的基因因斷裂而達不到轉化初始目的。因此在有關超聲波輔助的轉化研究中，必須選擇合適的超聲波強度和處理時間，以保證外源DNA分子的完整性[31-32]。

張宏等[31]在超聲波介導玉米愈傷組織轉化時發現，超聲波處理40 m，不同聲強對DNA產生的效果不同，聲強為0.5 W/cm2時，外源DNA完好無損，聲強上升為0.75 W/cm2時，還能看到明顯的主帶，當聲強達到1.0W/cm2時，外源DNA嚴重斷裂，主帶消失；Wyber等[33]研究發現，超聲波處理不會改變質粒DNA的狀態，如超螺旋、線性和開環等；趙婷婷等[34]以聲強400 W的超聲波處理鮭魚精DNA，處理時長分別為20、25、30 m，結果發現，處理20 m時，鮭魚精DNA的條帶大小集中于100～250 bp，隨著處理時間延長，發現鮭魚精DNA被打斷，電泳條帶逐漸變寬；叢郁等[35]在應用超聲波直接轉化法把rolC基因導入八棱海棠的過程中發現，超聲波功率100 W時，質粒DNA在30 m之內均能保持完整，而處理40 m后發生降解；Karshafian等[36]采用超聲波介導輔助動物細胞‘HTC’的基因轉化，他發現在超聲波處理下，分子量為10 kD～2 MD的大分子均可以導入受體細胞，這是首次報道外源DNA大小與轉化的關系；張瑩等[37]報道說，最大功率的超聲波處理（未報道功率數字）質粒DNA時，處理5 m，質粒DNA完好無損，處理15～20 m，質粒DNA略有降解，處理30 m時，質粒DNA完全降解；董蓮華等[38]用功率300 W、頻率24 kHz的超聲波處理質粒DNA，可將質粒DNA降解為200～500 bp的小片段。

4 超聲波輔助轉化方法的研究進展

1990—1994年，許寧等[10]根據超聲波的作用原理，提出“超聲誘導基因轉移”方法，并在小麥幼胚和動物細胞上成功轉化。由于其操作簡單、轉化效率高、不受植物基因型限制等優點，得到大家認可，截至目前，國內外有關超聲波輔助或超聲波直接介導植物轉化的研究已有不少報道。

4.1 超聲波介導的直接轉化法研究進展

1990年，許寧等[10]利用超聲波介導法將GUS基因、NPT??基因導入小麥幼穗誘導的愈傷組織，用XGluc檢測GUS活性，超聲波處理的愈傷組材料均顯藍色，而對照組不顯藍色；超聲波處理轉化愈傷組織207塊，其中30%呈藍色，愈傷組織壓片鏡檢發現其中顯藍色的面積達70%～80%；1994年，許寧等[39]在用超聲波處理小麥幼胚時發現，在超聲波功率為0.5 W/cm2、處理時間也相同的情況下，連續型處理比脈沖型處理的轉化率低，當功率為1.0 W/cm2、處理時長還一樣，連續型超聲導致幼胚全部死亡，結論為脈沖型超聲更適合于基因轉移；同一年，許寧等[40]將二氫葉酸還原酶基因(dhfr)導入缺失二氫葉酸還原酶基因的倉鼠細胞(CHO)，外源基因轉化率達到2.8×10-3，同時還發現，脈沖寬度對轉化率也有較大影響，在‘CHO細胞’導入Calcein的實驗中，當占空比5:1、作用時間2 m時基因導人率為79%，而當占空比5:4、作用時間2 m時導入率則下降到43%；1990年，Joersbo等[41]采用溫和超聲波處理將氯霉素乙酰轉移酶(CAT)導入甜菜和煙草原生質體中，即在含質粒DNA的介質中用20 kHz超聲波處理原生質體，發現轉化子中目的基因的瞬間表達，當瞬間表達在煙草原生質體中達到80%時，超聲波處理對原生質體的活性還沒有太大影響，同時他們還發現，在30 W、570 ms脈沖超聲波處理下，隨著介質中質粒DNA 濃度的增大(0～110 μg/mL)，CAT基因活性也增高(0%～2.0%)；1991年章力健等[12]采用超聲波直接導入外源基因法轉化煙草，將GUS基因、卡那霉素抗性基因和NPT??基因導入到煙草葉片小塊，即在含上述基因的處理介質中用強度為0.5 W/cm2的超聲波脈沖處理30 m，經檢測，有86%的葉片小塊有GUS短暫表達，處理葉塊在含卡那霉素培養基上再生出小苗，經分子檢測，得到轉化小苗，轉化率達到22.3%，他認為，超聲波處理可以在外植體上產生易于農桿菌進入的通道，使得農桿菌與外植體間的接觸面增大，所以轉化率有所提高；1995年，秦松等[42]報道用超聲波處理飩頂螺旋藻制備原生質體和單細胞，發現當超聲波以20 kHz頻率、15 W功率處理飩頂螺旋藻懸浮液30 s，可使藻絲體斷裂成(15.0±1.6)個細胞長度，隨著作用時間的延長，藻絲體斷成2～6個細胞長度，此時發現有些細胞的細胞壁結構被破壞，得到部分原生質體，再延長作用時間,可得到少量原生質體和大量單細胞；1997年，Wyber等[33]將酵母(AH22)細胞等分并懸浮在含有質粒DNA的緩沖液中，用20 kHz超聲波處理緩沖液，發現當超聲波強度為2 W，處理30 s時，轉化的細胞數量是對照組的20倍，同時還發現，在他所使用的超聲波強度和時間范圍內，質粒DNA完好無損；同年，張宏等[31]玉米愈傷組織切塊，與質粒DNA一并放入緩沖液中，用聲強為0.5～1.0 W/cm2的超聲波處理緩沖液，處理時間范圍為10～45 m，結果發現，處理30 m時轉化率達到最高，為13.3%，分子檢測結果表明，他們首次成功地將Bt殺蟲蛋白基因導入了重要作物玉米中，并最終得到可育的轉基因植株及后代；1999年，李重九等[43]將煙草葉肉細胞與煙草花葉病毒(TMV)粒子放在緩沖液中，用超聲波處理，脈沖波強0.5～1.0 W/cm2，處理時間5～30 m，結果發現，處理5 m，再培養48 h，檢測到細胞的轉染率為59.7%，此時TMV粒子在細胞內的增殖也達到高峰，且這些TMV子代有較高的致病力；2005年，謝寶貴等[44]將銀耳菌株Tr21與帶有超霉素抗性基因和GUS基因的質粒DNA在超聲緩沖液中用超聲波處理，超聲波功率設80、120、160 W 3個處理，間隙時間分別分5、30、60 s 3個時段，工作時間分1、3、5 m 3個時段，按正交試驗設置，結果發現，功率80 W、間隙60 s、處理1 m的組合為最佳組合，得到754.7個轉化子，統計分析證明，間隙時間和處理時間的長短對銀耳芽孢轉化率有顯著影響，而聲強的影響不大，超霉素抗性檢測得到抗性轉化子，轉化子GUS活性檢測結果為陽性；2007年，Song等[45]利用低頻超聲波(40 kHz)處理法，將質粒pBBR1MCS2導入惡臭假單胞菌(UWC1)、大腸桿菌DH5α和假單胞菌SBW25，轉化率比常規的組合轉化法高9倍，比電穿孔法高4倍；Ananthakrishnan等[46]用超聲波處理不易組培再生的南瓜子葉外植體，把芐基腺嘌呤導入其外植體組織，發現非超聲波處理的外植體僅再生出很小的苗或芽狀結構，而超聲波處理的外植體出苗多、生長快，并認為這是超聲波處理增加了農桿菌與外植體細胞接觸的機會，從而提高了轉化效率。

4.2 超聲波輔助植物轉基因研究進展

超聲波輔助農桿菌介導法：1997年，Trick等[13]將超聲處理技術與農桿菌介導轉化法相結合，建立了超聲波輔助農桿菌遺傳轉化方法(SAAT)，他們用此法將GUS基因導入大豆和豇豆組織中，發現GUS基因的平均短暫表達頻率提高100～140倍，隨后他們又用此方法轉化大豆胚性懸浮培養物（直徑2～4 mm的胚性團塊）[47]，處理6～8周后發現了轉基因克隆，未用此法轉化的同樣組織沒有得到轉基因克隆，對超霉素抗性苗的分子檢測證實T-DNA已整合到胚性組織中；1999年，Humara等[48]利用SAAT法將含有uidA基因的質粒導入葉松的子葉中，培養7天后，49.7%的子葉呈現彌散的藍色，不過培養30天時，所有子葉全部死亡，作者認為這可能與細菌感染后植物的過敏性反應有關；國內，2001年，姚春娜等[49]用超聲波介導發根農桿菌的轉化，將發根農桿菌菌株A4、黃瓜子葉和下胚軸切段放入超聲波處理緩沖液中，超聲波強度500 W，頻率50 kHz，處理時間設為0、2、5、10 s 4個時段。發現處理對子葉和下胚軸的發根誘導頻率有明顯的促進作用，對照組發根生成率依次分別為21.1%和2.7%，而處理組（超聲波處理2 s）的根生成率依次為54.1%和33.4%(P＜0.01)，經冠癭堿檢測證明發根合成了農桿堿；2003年，趙東利等[50]采用超聲波處理將發根農桿菌A4等導入苦豆子子葉和下胚軸外植體中，超聲波功率120 W，頻率50 kHz，處理時間分5、15、25、30 m 4個時間段，處理外植體繼續培養、誘導生根，結果發現，隨超聲波處理時間的延長子葉和下胚軸的轉化率逐漸提高，25 m時達到最高點（分別為83.7%和39.1%），而對照組的轉化率僅有14.4%和9.8%，處理30 m時，轉化率又明顯下降，下胚軸的轉化率由39.1%下降為30.2%，子葉的轉化率由83.7%下降到60.5%，說明此時超聲波的處理已導致外植體組織受損；2004年，姜玲等[51]應用SAAT法轉化番木瓜胚性愈傷組織，其他條件相同的情形下，超聲波處理15 s，CP基因G轉化系的轉化率由對照組的1.6%上升為26.3%，CP基因B轉化系的轉化率由對照組的0提高到16.7%；2014年，薛曉鋒等[52]采用SAAT法將耐鹽基因SeNHX1導入紫苜蓿子葉外植體中，超聲波源自超聲波清洗儀，處理時間為0、5、10、20、30 m 5個時間段，處理時間20 m之前，隨著處理時間延長，卡那霉素抗性愈傷存活率也逐漸增加，但處理時間為30 m時，存活率反而下降，轉化體DNA進行分子檢測證實耐鹽基因的存在。

超聲波輔助花粉介導法：關于外源DNA能否進入花粉粒，最早采用的方法是花粉粒與外源DNA混合培養，處理花粉授粉后，有些后代植株表型發生變化[53-55]，此間，Hesolp-Harrison[56]通過試驗發現外源DNA能進入水合花粉的內壁，Picton等[57]和O’Driscoll等[58]發現萌發的花粉管尖端細胞的細胞壁缺失，并認為外源DNA可能通過花粉管尖端缺少細胞壁的細胞的胞吞作用進入花粉內，但這些發現或推論都沒有分子學上的依據，何況Hesolp-Harrison等[59]在1988年、Kranz等[60]在1990年還有相反的報道，所以Langridge等[61]認為，通過花粉途徑進行谷物類植物的轉化是很難的，上述一些研究成果大概有人為造假之嫌；接著研究者又試圖用一些其他方法解決外源基因導入花粉粒問題，如，Matthews等[62]通過電激法將外源基因導入煙草，注射法、基因槍法等也成功將外源DNA導入花粉粒，這些研究結果經分子雜交實驗、GUS活性分析、電鏡觀察等手段均得到花粉被轉化的依據；但是證明外源DNA能夠進入花粉且能夠保證花粉具有一定的生活力的研究還不夠，對這些攜帶外源基因的花粉的育性大小還需要詳細探討[63]；1996年，Deng等[64]在總結以前的有關轉化花粉的研究時首次提出花粉介導法這個概念，就在1997年，王景雪等[65]報道利用超聲波輔助花粉介導法獲得轉基因玉米植株，轉化率高達42.9%，這是關于超聲波輔助花粉介導遺傳轉化玉米并得到可育轉化后代的首例報道；2004年，王景雪等[14]進一步介紹該轉化材料中目的基因能夠穩定遺傳和表達，獲得了轉基因純合株系，并認為采用這種轉化方法，避免了傳統的基因槍法和農桿菌介導法轉化所要求冗長的組織培養過程，轉化方法簡單，易操作，具有很強的實用性；2002年，陳定虎[15]報道采用超聲波輔助花粉介導法將攜帶PAP基因的植物轉化載體導入玉米材料中，獲得1個轉化事件，抗病鑒定結果為接種病毒后對照7天發病，轉化系25天時也未發病；解志紅[16]采用超聲波輔助花粉介導法將幾丁質酶基因轉化棉花遠緣雜交高代材料，轉化率達到32%；2004年，王節之等[17]采用超聲波輔助花粉介導法將幾丁質酶基因導入谷子品種‘晉谷21號’不育系，T1代得到PCR檢測陽性植株，T2代噴霧除草劑篩選，存活植株做抗病鑒定，結果轉化系抗病性明顯高于對照，獲得了雙抗植株；杜春芳等[18]利用超聲波輔助花粉介導法將GUS基因導入油菜’晉油7號’，獲得6個轉化植株；2006年，梁雪蓮等[19]利用花粉介導法將抗蟲基因CpT?導入花生品種‘仲愷01號’，并發現超聲波強度為100 W時，花粉無損傷，200 W時，細胞結構完整，但細胞壁受損，300 W時，花粉解體，同時還發現超聲波強度為200 W時，染色觀察結果顯示花粉仍具有生活力；2007年，Wang等[20]以超聲波輔助花粉介導方法把帶有GUS基因和NPT??基因的質粒DNA導入高粱雄性不育系‘A2V4A’，獲得了轉基因后代材料；2008年，Wang等[65]將抗草甘膦基因aroA-M1用超聲波輔助花粉介導法轉入油菜品種，獲得了抗草甘膦除草劑的轉基因植株；杜建中等[66]以超聲波輔助花粉介導法將水稻幾丁質酶基因導入玉米自交系‘海92-1’中，獲得了5株轉基因植株，對其后代株系進行抗病鑒定，結果發現轉基因株系植株的抗病性比非轉化對照株系提高1～2級；2009年，魏玉杰等[21]以超聲波輔助花粉介導法將蘿卜抗菌肽基因轉入野罌粟花粉并給野罌粟授粉，結實率高達80%，超聲波處理時間對授粉后結實率的影響達顯著水平；2010年，任小燕等[67]采用超聲波輔助花粉介導法把山菠菜膽堿單加氧酶基因(AhCMO)導入玉米自交系‘鄭58’中，測定生理指標的結果證明轉化植株的耐鹽性比對照提高1～3級；2011年，韓凱[68]采用超聲波輔助花粉介導法將EPSPS基因和谷氨酰胺合成酶基因(GSI)導入玉米‘玉美頭’品種中，獲得了轉化植株，轉化率僅為4.17%，但仍高于基因槍法的轉化率；林春晶等[69]利用超聲波輔助花粉介導法（有改良）將玉米植酸酶基因phy轉入玉米品種，經PCR和RT-PCR檢測，證明得到轉化植株，目的基因也得到轉錄表達；2012年，宋鑒達等[70]利用經過改良的超聲波輔助花粉介導法將植酸酶基因phy和bar基因轉化到玉米品種‘鄭單958’中，經分子檢測，獲得了轉化陽性植株；2013年，馬倩倩等[22]以黃花梨花粉為載體，將綠色熒光蛋白基因GFP導入黃花梨植株，獲得了轉化植株，轉化率為3%，這在果木轉化中也算是較高的轉化效率；同年，李娜等[71]把綠色熒光蛋白基因GFP轉入玉米離體花粉中，對轉化花粉進行體外培養和人工授粉，用熒光顯微鏡觀察GFP基因在花粉、花粉管以及胚中的表現，發現轉化胚與非轉化胚均有強烈熒光，認為以花粉粒熒光反應作為花粉轉化依據不可靠；同時還發現，轉化花粉人工授粉后，被授粉植株的花粉管和胚中均有GFP表達的熒光反應，認為后兩者可作為花粉介導轉化的證據，授粉植株的種子播種后得到轉化植株及后代。2014年，王小麗等[72]采用超聲波輔助花粉介導法首次將BADH基因導入‘鄭58’玉米自交系，獲得了耐鹽的轉基因轉化材料。

除上述超聲波輔助農桿菌介導法、超聲波輔助花粉介導法外，就作者本人目前掌握的資料還沒有發現超聲波輔助其他遺傳轉化方法的研究。就狄紅梅《超聲波處理對大白菜花粉管通道法轉基因的影響》[73]一文經作者甄別也應屬于超聲波輔助花粉介導法，嚴格意義上講其采用方法與超聲波輔助花粉介導法更相近。

5 超聲波輔助植物轉化方法的優點

超聲波輔助的遺傳轉化方法的優點包括：不需要貴重精密儀器設備，所以投資少；方法簡單易于操作；組培過程簡單或不需組培過程，省時省力；出現嵌合體的概率低或沒有；突破基因型屏障，適用范圍廣，單子葉植物也廣泛應用；轉化效率高、轉化工作效率也高。

1996，王國英等[74]用基因槍法、超聲波法等轉化玉米，轉化玉米幼胚或胚性愈傷組織，基因槍法兩種外植體均轉化成功，但轉化率低，最高轉化率為平均每皿0.58個轉化體（每皿50～60個幼胚或胚性愈傷），超聲波處理直接轉化方法轉化率最高為15.3%(0.5 W/cm2，30 m)，超聲波處理提高轉化效率的效果明顯；2002年，梁雪蓮等[75]采用注射法、花粉介導法和萌動胚法轉化bar基因導入玉米‘黃糯’、‘白糯’、‘金黃96C’等中，均獲得了轉化植株，但3種轉化方法結實率分別為1%、3%～4%、3%～4%，從轉化目的性看，后兩者也強于注射法，進一步分析發現，同種試驗條件下，這3種方法的轉化率高于基因槍法和農桿菌介導法，且不需組培和再生過程，省時省力；2011年，韓凱[68]采用超聲波輔助花粉介導法將EPSPS基因和谷氨酰胺合成酶基因(GSI)導入玉米‘玉美頭’品種中，獲得了轉化植株，轉化率僅為4.17%，但仍高于基因槍法的轉化率。

6 展望

6.1 存在問題和應對策略

超聲波介導的植物轉化方法除了上述的優缺點，還存在的問題包括：（1）導入的外源基因通過非同源重組形式整合，隨機性較大，可能導致導入基因的沉默或者插入位點原功能基因的失活。這一問題可通過重組位點介導定點整合技術或者定點酶切介導定點整合技術來解決，即將外源DNA構建到Cre-lox等重組整合系統[76]，然后轉化，也可結合鋅指酶介導的定點整合技術[77]來完成轉化；（2）超聲波輔助介導對受體材料所產生的機械損傷和熱損傷，1998年，Santarem等[78]用掃描隧道顯微鏡觀察超聲波輔助處理的大豆子葉，發現子葉表面和深層有許多的微傷口；章力健等[12]、邱樹毅等[79]分別觀察到超聲波在介質中傳播時，會使介質的溫度升高，升高17～25℃，溫度升高也會造成外植體損傷。其解決方案一是優化超聲波處理強度，盡量降低機械損傷，二是配備冰浴系統，使整個超聲波處理過程處于低溫狀態，減少高溫損傷；（3）針對不同的受體材料，都需要摸索不同的超聲波處理強度和處理時長，工作繁瑣，且重復性差。解決問題的關鍵是開發植物轉化專用的超聲波處理設備，這個設備除操作簡單外，其超聲波強度范圍應適當加寬，探頭強度要更硬，處理室應可放置一定體積的冰浴盒，這樣便于優化處理強度和處理時長的組合，并且無需購買多臺設備以備用；（4）轉化效率有待提高，通過儀器配制的改進、處理介質的優化、處理參數等的完善，可以提高超聲波介導的植物轉化方法的轉化效率。

6.2 未來發展趨勢

植物轉基因研究已有30年歷史，中國的轉基因研究也正在步入轉基因作物產業化的起步階段，隨著時代發展和社會進步，植物轉基因研究將呈現一個欣欣向榮、成果斐然的新時代，因而完善現有植物轉化方法，開發新的轉化方法是歷史賦予人們的使命。

隨著人們對超聲波物理、化學性質的進一步了解和掌握，超聲波介導的植物轉化方法的操作過程和步驟將不斷簡化，轉化效率得到提高，加之其又可克服轉化過程中基因型的依賴性和便于推廣應用，故其應用前景十分廣闊。

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Advance in Plant Transformation Method Assisted by Ultrasonic

Wang Jianjun,Feng Liyun,Shen Hufei,Liu Jiao
(Xixian Agricultural Experiment Station,Shanxi Academy of Agricultural Sciences,Xixian 041399,Shanxi,China)

To evaluate the efficiency and potential development capacity of ultrasonic treatment for plant transformation,we started with the principle of ultrasonic-assisted plant transformation,summarized the validation of method,the receptor materials of ultrasonic treatment and the effects of ultrasonic treatment on exogenous DNA.Then,the research progresses in ultrasonic-assisted plant transformation were reviewed,and the advantages as well as disadvantages and existing problems of the method were discussed.Our results indicated that although the development of ultrasonic-assisted plant transformation was still in the primary stage,it demonstrated that the method was a simple,time-saving,labour-saving and widely applied plant transformation approach.Moreover,we proposed respective solution to the existing problems.Taken together,we consider that ultrasonic-assisted plant transformation method has broad development prospect.

Ultrasonic;Assistance;Plant;Transformation Method

Q812

A論文編號：cjas16120034

國家轉基因重大專項“抗病蟲、抗除草劑轉基因玉米新品種選育”(2016ZX08003001-002-003)；山西省科技攻關項目“多抗耐密型玉米新種質創制及新品種選育”(20140311002-1)。

王建軍，男，1972年出生，副研究員，本科，學士，主要從事作物遺傳育種工作。通信地址：041399山西省隰縣龍泉鎮下王家莊村164號山西農業科學院隰縣農業試驗站，Tel：0357-7321591，E-mail：wangjianjun1123@126.com。

2016-12-29，

2017-02-06。