溫郁金揮發油通過PI3K/Akt信號途徑對阿爾茨海默模型小鼠tau蛋白磷酸化表達的影響

齊越++秦文艷++康凱++姜鴻++李昭++王亞斌++賈冬

摘要：目的 觀察溫郁金揮發油對阿爾茨海默病（AD）模型小鼠tau蛋白磷酸化的影響，探討其相關作用機制。方法 60只昆明種小鼠隨機分為假手術組、模型組、溫郁金揮發油低劑量組、溫郁金揮發油高劑量組、鹽酸多奈哌齊組和參枝苓組，海馬組織注射Aβ25-35制作AD小鼠模型，各給藥組給予相應藥物灌胃，連續15 d。末次給藥后，免疫組化檢測小鼠tau蛋白磷酸化位點（Ser 404和Thr 231）的蛋白表達，Western blot 檢測tau蛋白磷酸化位點及磷脂酰肌醇-3-激酶信號/蛋白激酶B（PI3K/Akt）的蛋白表達。結果 與假手術組比較，模型組tau蛋白磷酸化位點蛋白表達增加（P<0.05），PI3K及Akt磷酸化水平明顯降低（P<0.05）；與模型組比較，溫郁金揮發油高劑量組tau蛋白（Thr231和Ser404）磷酸化水平明顯降低（P<0.05），PI3K及Akt磷酸化水平明顯增加（P<0.05，P<0.01）。結論 溫郁金揮發油可降低模型小鼠tau蛋白磷酸化水平，其作用機制可能與PI3K/Akt信號途徑有關。

關鍵詞：溫郁金揮發油；阿爾茨海默病；tau蛋白；磷脂酰肌醇-3-激酶信號/蛋白激酶B；小鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.01.012

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）01-0045-04

Effects of Wenyujin Essential Oil on tau Protein Phosphorylation in Mice with Aβ-induced Alzheimer Disease through PI3k/Akt Pathway QI Yue1， QIN Wen-yan1， KANG Kai2， JIANG Hong1， LI Zhao2， WANG Ya-bin2， JIA Dong2 （1. Department of Pharmacology， The Second Hospital Affiliated to Liaoning Chinese Medical University， Shenyang 110034， China； 2. Laboratory Center， Liaoning University of Traditional Chinese Medicine， Shenyang 110847， China）

Abstract： Objective To investigate the effects of Wenyujin essential oil on tau protein phosphorylation in mice with Alzheimer Disease （AD）； To discuss the relevant mechanism of action. Methods Sixty Kunming mice were divided into six groups randomly： sham-operation group， model group， Wenyujin essential oil low- and high-dose group， donepezil group and Shenzhiling group. β-Amyloid protein （Aβ25-35） was infused into the hippocampal of mice. Mice in each group were given relevant medicine for gavage for 15 d. After the last administration， immunohistochemistry was used to detect the expressions of tau protein phosphorylation points （Ser 404 and Thr 231）. Western blot was used to detect tau protein phosphorylation points and the expression of PI3K/Akt protein. Results Compared with sham-operation group， tau protein phosphorylation points in the model group increased （P<0.05）， but the phosphorylation levels of PI3K and Akt decreased significantly （P<0.05）. Compared with the model group， tau protein phosphorylation （Thr231 and Ser404） in Wenyujin essential oil high-dose group decreased significantly （P<0.05）， and the phosphorylation levels of PI3K and Akt increased （P<0.01）. Conclusion Wenyujin essential oil can inhibit tau protein phosphorylation in mice. The possible mechanism may be related to the PI3K/Akt signal pathway.

Key words： Wenyujin essential oil； Alzheimer disease； tau protein； PI3K/Akt； miceendprint

基金項目：國家科技重大專項-重大新藥創制（2012ZX09102201-005）

通訊作者：賈冬，E-mail：jiadg2003@126.com

阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）是一種以進行性記憶力減退、行為異常和認知功能發生障礙為特征的慢性神經退行性疾病[1]，其主要的病理特征為老年斑沉積、神經原纖維纏結和tau蛋白磷酸化。tau蛋白是微管相關蛋白，含量占整個蛋白家族的80%，與微管的組裝和穩定密切相關，對于神經細胞的生長發育、軸突生長、神經元極性形成、軸突的通信傳導和物質運輸等均有著至關重要的作用[2-3]。溫郁金Curcuma wenyujin Y. H. Chen et C. Ling為姜科姜黃屬植物的干燥塊根，在我國資源豐富，價格低廉，具有活血行氣、破瘀、清心解郁之功效。課題組前期研究表明，溫郁金揮發油可改善AD模型小鼠學習記憶障礙，減輕神經元的損傷，但其作用機制尚不清楚。本實驗觀察溫郁金揮發油對AD模型小鼠tau蛋白磷酸化的影響，探討其相關的作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF級昆明種小鼠60只，雌雄各半，8周齡，體質量（20±2）g，遼寧長生生物技術有限公司，合格證號SCXK（遼）2010-0001。飼養于遼寧中醫藥大學附屬第二醫院實驗動物中心，室溫20～23 ℃，濕度50%～60%，自由飲水進食。

1.2 藥物

溫郁金購自浙江溫州，經遼寧省中醫藥研究院藥學室尤獻民研究員鑒定為正品，符合2010年版《中華人民共和國藥典》項下規定。揮發油提取：取溫郁金藥材1 kg，加水6000 mL，提取揮發油8 h，收得揮發油4.5 mL，遼寧省中醫藥研究院制劑中心制備，藥液置于4 ℃冰箱保存備用。參枝苓口服液，山東沃華醫藥科技股份有限公司，批號5250101；鹽酸多奈哌齊片，衛材（中國）藥業有限公司，批號140606A。

1.3 主要試劑與儀器

Aβ25-35（Sigma公司），tau-5（Invitrogen 公司），rabbit anti-phospho-tau（Thr231）抗體、rabbit anti- phospho-tau（Ser404）、rabbit anti-PI3K p85抗體、rabbit anti-phospho-PI3 K抗體、rabbit anti-phospho-Akt抗體，北京博奧森生物技術有限公司；Akt抗體，Santa公司；抗β-actin鼠單克隆抗體，康為世紀生物科技有限公司；山羊抗小鼠IgG（H+L）二抗、山羊抗兔IgG（H+L）二抗，北京中杉金橋生物技術有限公司；DAB顯色試劑盒，福州邁新生物技術開發有限公司；即用型SABC（兔IgG）試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司；水合氯醛，天津市津東試劑廠。DW-200腦立體定位儀（成都泰盟科技公司），TD1002B電子臺秤（四川中泯科技公司），Western blot電泳儀（美國BIO-RAD公司），BX51顯微鏡（日本奧林巴斯株式會社）。

2 實驗方法

2.1 造模

參照文獻[4]方法并加以改進，小鼠腹腔注射水合氯醛350 mg/kg麻醉，固定于腦立體定位儀上。頭部皮膚常規碘酒、酒精消毒，沿顱骨中線切開約2 cm切口，確定囟門位置，囟門后0.5 mm、旁開1 mm距離移動微量進樣器，進針3 mm，注入3 μL老化的Aβ25-35，2 min內緩慢注入側腦室內，留針5 min，創口處涂抹青霉素鈉粉，肌注青霉素鈉注射液，鼠籠飼養，注意保暖。假手術組注入等量生理鹽水。

2.2 分組及給藥

手術后第2日，除假手術組外，其余小鼠按體質量隨機分為模型組、鹽酸多奈哌齊組（1.3 mg/kg）、參枝苓組（2.6 mL/kg）和溫郁金低劑量組（6.0 mg/kg）、溫郁金高劑量組（18.0 mg/kg），每組10只。各給藥組給予相應藥物灌胃，假手術組和模型組給予等量蒸餾水灌胃。給藥體積為20 mL/kg，每日1次，連續15 d。

2.3 免疫組化檢測小鼠tau蛋白磷酸化位點（Ser404和Thr231）的表達

末次給藥后1 h，每組取小鼠6～7只，腹腔注射3.5%水合氯醛10 mL/kg麻醉，臥倒后剪開胸腔，暴露心臟，將輸液針經心尖刺入左心室，右心耳處剪一小口，先用預冷生理鹽水快速灌注，待右心房流出液體變透明時，將輸液針連接至預冷的4%多聚甲醛，先快后慢灌注，直至肝臟發白、四肢及尾巴抽搐、僵硬時，斷頭取腦，4%多聚甲醛4 ℃固定，常規制作成5 μm厚的石蠟切片，常規脫蠟脫水，高壓修復，5%BSA封閉，滴加一抗，4 ℃過夜，PBS洗滌后，滴加二抗，DAB顯色，鏡下觀察。每只各取10張冠狀切片，每張切片隨機選取5個不同的視野，陽性結果為細胞內現棕黃色顆粒，用JEOA 801D形態學圖像分析系統計算各組陽性細胞平均光密度值。

2.4 Western blot檢測小鼠tau蛋白磷酸化位點（Ser404和Thr231）及PI3K/Akt蛋白表達

末次給藥后1 h，每組取3只小鼠快速斷頭，冰上分離海馬，稱重。小鼠海馬經蛋白裂解液裂取后提取總蛋白，BSA法測定蛋白濃度，10%凝膠電泳，轉膜，5%脫脂牛奶封閉，一抗孵育，4 ℃靜置過夜。PBS洗滌后加入二抗孵育，再次洗滌后加入超敏ECL化學發光試劑盒，借助凝膠成像系統觀察相關蛋白的表達。用Quantity One 4.6.2圖像分析軟件進行分析。

3 統計學方法

采用SPSS17.0統計軟件進行分析。實驗數據以—x±s表示，組間比較采用方差分析，多重比較采用Fisher's LSD。P<0.05表示差異有統計學意義。

4 結果endprint

4.1 溫郁金揮發油對小鼠海馬組織tau蛋白磷酸化（Thr231和Ser404）表達的影響

與假手術組比較，模型組小鼠腦組織p-tau（Thr231和Ser404）蛋白陽性表達顯著增加（P<0.05）；與模型組比較，溫郁金高劑量組、鹽酸多奈哌齊組、參枝苓組小鼠腦組織p-tau（Thr231和Ser404）蛋白陽性表達顯著降低（P<0.05）。結果見圖1、圖2、表1。

4.2 溫郁金揮發油對小鼠海馬組織tau蛋白（Thr231和Ser404）、PI3K及Akt磷酸化表達的影響

與假手術組比較，模型組小鼠海馬組織tau（Thr231和Ser404）磷酸化水平明顯升高，PI3K和Akt磷酸化水平明顯降低（P<0.05）；與模型組比較，溫郁金高劑量組tau蛋白（Thr231和Ser404）磷酸化水平明顯降低、PI3K和Akt磷酸化水平明顯升高（P<0.05，P<0.01）。結果見表2、圖3。

5 討論

AD屬中醫學“呆證”范疇。雖病位在腦，但與腎關系密切，年邁者易腎精虧虛，致髓海空虛，神機失用而成癡呆。另一方面，人至暮年，臟腑虛衰，氣血虧損，導致氣虛血瘀；情志不暢，肝失疏泄，導致氣滯血瘀，血瘀導致臟腑化生的氣血不能充養元神之府，腦失所養而成癡呆。因此，中醫把補腎益精、活血通絡作為治療AD的主要方法。有研究表明，以郁金為主要組分的方劑治療AD，可明顯改善AD患者的認知和日常生活能力[5]。提示郁金單獨作用可能具有潛在的抗AD作用。

tau蛋白過度磷酸化是AD的主要病理特征之一，過度磷酸化的tau蛋白容易聚合形成不溶性纖維絲，進而對神經元形態、軸突的通信傳導和物質運輸等方面產生影響[6-7]，甚至造成神經元丟失，造成神經退行性病變。tau蛋白上與AD相關的磷酸化位點有Thr181、Thr231、Ser262、Ser199、Ser396和Ser404等。因此，檢測tau蛋白在Thr231和Ser404等位點的磷酸化情況，可以反映AD的輕重程度。免疫組化結果顯示，注射Aβ后，小鼠腦組織tau蛋白Thr231和Ser404位點過磷酸化的神經細胞明顯增多，溫郁金揮發油干預后，小鼠腦組織tau蛋白Thr231和Ser404位點過磷酸化的神經細胞明顯減少，說明溫郁金揮發油可以減少神經細胞中tau蛋白Thr231和Ser404位點的過磷酸化。

PI3K/Akt是細胞內重要的信號轉導通路，具有調節葡萄糖轉運、糖原及蛋白質合成與分解等多種細胞功能[8-9]。活化的PI3K/Akt通過磷酸化多種下游因子來調節細胞的生理過程[10]。Schubert M等[11]發現，PI3K/Akt信號傳導不足將導致tau蛋白過度磷酸化，表明PI3K/Akt在調節tau蛋白磷酸化中起重要作用。本實驗結果顯示，與假手術組比較，模型組小鼠腦組織PI3K和Akt的磷酸化水平降低，而tau蛋白（Thr231和Ser404）的磷酸化水平升高，可能的原因是Aβ抑制了PI3K/Akt信號通路的活性，Akt對tau蛋白激酶的抑制不足，使其活性增加，從而使tau蛋白的Thr231及Ser404位點磷酸化。溫郁金揮發油干預后，小鼠腦組織PI3K和Akt磷酸化水平升高，而tau蛋白（Thr231和Ser404）磷酸化水平降低，表明溫郁金揮發油降低Aβ致AD小鼠tau蛋白的磷酸化水平，推測其作用機制是激活PI3K/Akt信號通路，抑制tau蛋白激酶的活性，從而抑制其對tau蛋白的過度磷酸化。

綜上，溫郁金揮發油可降低AD模型小鼠海馬區神經元tau蛋白Ser404和Thr231位點的過磷酸化，其機制可能與上調PI3K/Akt通路磷酸化水平有關。

參考文獻：

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（收稿日期：2016-07-05）

（修回日期：2016-07-29；編輯：華強）endprint