草甘膦對巴西橡膠樹芽接苗葉片莽草酸和4種激素含量的影響

李曉娜+潘敏+王萌+楊葉+鄭服叢+朱朝華+張宇

摘 要 為探究草甘膦誘導橡膠樹芽接苗葉片畸變的作用機理，以巴西橡膠樹品種‘熱研7-33-97芽接苗為材料，噴施188 g a.i/hm2的草甘膦劑量，分析芽接苗不同形態葉片莽草酸和4種激素含量變化規律。結果表明：莽草酸積累量在草甘膦施藥前后呈顯著差異，當葉片出現半黃半綠表型時，莽草酸積累量較未施藥前上升12.40%，而在2種再生畸形葉（葉片長度<7 cm和>7 cm）和恢復葉時分別下降75.01%、77.48%和62.69%；噴施草甘膦后各類型葉片生長素和赤霉素的含量均與未施藥前對照葉片差異不顯著，脫落酸和玉米素含量較對照差異顯著，半黃半綠葉片脫落酸含量較未施藥對照下降12.40%，玉米素較施藥前下降33.54%；2種再生畸形葉出現后，脫落酸含量較未施藥前分別升高30.40%和45.61%，玉米素分別升高41.48%和86.02%。說明莽草酸和植物激素共同調節著橡膠樹的生長，且影響了橡膠樹葉片畸形。

關鍵詞 巴西橡膠樹 ；草甘膦 ；莽草酸 ；激素

中圖分類號 S794.1 文獻標志碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.11.011

Abstract The mechanism of glyphosate spraying on the induction to the distortion of the rubber tree grafting budding seedling leaf is unclear. In this study， rubber variety CATAS 7-33-97 grafting budding seedlings leaves sprayed 188 g a.i/hm2 of glyphosate dose， were used for analysis of shikimic acid and 4 kinds of hormone contents. Results show that the accumulation of shikimic acid in leaves before and after glyphosate spraying was significantly different. When in half yellow half green leaf phenotype， shikimic acid accumulation is up 12.40% before spraying， and in two regeneration deformed leaf （less than 7 cm and more than 7 cm length） and restoring leaf fell by 75.01%， 77.48% and 75.01%， respectively. Auxin and GA3 contents in various types of leaves after glyphosate spraying show no significant differences compared with leaves before spraying， while significant difference are found in content of abscisic acid and zeatin. Abscisic acid and zeatin contents in half yellow half green leaf fell by 12.40% and 33.54 than control leaf， respectively. In two regeneration deformed leaf， abscisic acid content is increased 30.40% and 30.40%， zeatin is increased 41.48% and 86.02% than control leaf， respectively. The results showed that shikimic acid and hormones regulated the growth of rubber tree together， and affected the the leaf of rubber tree distorted.

Keywords Hevea brasiliensis Muell. Arg. ； glyphosate ； shikimic acid ； hormone

草甘膦（Glyphosate）是由孟山都公司開發的高效、廣譜的內吸傳導型滅生性除草劑[1]。在使用過程中草甘膦藥液飄移往往會使作物受到藥害，甚至會導致作物死亡[2]。草甘膦抑制5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶（5-enolpyruvoylshikimate-3-phosphate-synthase， EPSPS）活性，導致莽草酸含量大量積累，從而影響植物細胞分裂和葉綠素等生理代謝功能[3]。莽草酸積累量是草甘膦對作物生理機制影響的重要指標[4-5]。

生長素（Auxin， IAA）、玉米素（Zeatin， ZR）、赤霉素（Gibberellin， GA3）和脫落酸（Abscisic acid， ABA）是主要的植物內源激素，與植物的基因表達、生長發育和代謝等過程密切相關[6]。IAA調控花序、花分生組織以及花器官的發育[7]。ABA在水分脅迫下對植物氣孔運動[8-9]、種子萌發、開花時間和果實成熟等生理過程中起到重要調節作用[10-12]。GA3促進種子萌發和植物生長[13]，降低植物對逆境的抵御能力[14]，在植物的生物合成和信號傳導方面發揮重要的作用[15]。ZR屬于細胞分裂素的一種，能夠促進細胞分裂、分化，維持蛋白質合成的正常機能[16]。

已有研究結果表明，在噴施草甘膦后，大豆的莽草酸積累量增加會使植株死亡[17]。草甘膦誘導棉花花藥中生長素、赤霉素、脫落酸和玉米素含量產生變化導致花粉粒畸形[18-19]。在草甘膦的作用下，生長素含量的變化引起棉花和玉米葉片扭曲[20]。草甘膦與赤霉素作用可以促進玉米生長[21]。巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis Muell. Arg.）幼苗生長過程中需要進行雜草防除，草甘膦噴施過程中會因人為、環境等因素沾濺到橡膠樹葉片上，被橡膠樹吸收傳導，導致草甘膦藥害產生。筆者推測，在草甘膦處理下，莽草酸和激素含量的變化會影響橡膠樹葉片畸形。因此，筆者采用巴西橡膠樹‘熱研7-33-97芽接苗為材料，探析草甘膦處理后巴西橡膠樹幼苗不同形態葉片中莽草酸和激素含量的變化規律，以期更深入地了解草甘膦對巴西橡膠樹幼苗葉片畸形的原因，為研究草甘膦對巴西橡膠樹作用機制打下良好的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

以中國熱帶農業科學院橡膠研究所培育的巴西橡膠樹品種‘熱研7-33-97一年生芽接苗為材料，芽接苗種植于海南大學環境與植物保護學院（儋州校區）實驗基地，草炭土與粘土體積比例為3∶1的育苗袋中。

41%草甘膦水劑，由浙江綠野農化生物科技有限公司生產。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集

將41%草甘膦有效劑量188 g a.i/hm2，噴施在‘熱研7-33-97芽接苗第一蓬葉，每批處理6株，每株取葉柄中間的一片葉片進行分析。以下5種形態葉片進行測定：（1）未施藥前葉片（對照）；（2）3～5 d半黃半綠葉片；（3）30 d再生<7 cm畸形葉；（4）>7 cm畸形葉；（5）36 d再生恢復葉。

1.2.2 莽草酸含量測定

莽草酸含量測定參考Gaitonde[22]、婁遠來[23]和王迪[24]等的方法，稍作改動。用液氮分別研磨未施藥前葉片、半黃半綠葉片、小于7 cm畸形葉、大于7 cm畸形葉和新生的恢復葉，各取0.2 g樣品于2.0 mL離心管，加入0.25 mol/L HCL 1.0 mL，4℃，12 000 r/min下離心30 min。然后取200 μL上清液于10 mL離心管，加入2.0 mL氧化劑溶液（1%高碘酸和1%過碘酸鈉溶液混合），室溫靜置3 h，加入 1.0 mol/L NaOH溶液2.0 mL，最后加入0.1 mol/L甘氨酸1.2 mL 混勻，靜置5 min，用紫外分光光度計在380 nm比色，以0.25 mol/L HCL為空白對照。

莽草酸標準曲線制作：取莽草酸的標準樣品0.01 g，溶于1 mL的0.25 mol/L HCL，混勻，分別取5、10、25、37.5、50 μL于1.5 mL離心管，加0.25 mol/L HCL溶液，定容至1.0 mL，以下步驟同莽草酸含量測定，并繪制標準曲線。

1.2.3 4種內源激素含量測定

參考陳建華[25]和馬有寧[26]等的方法，稍作激素前處理改動：用液氮分別研磨未施藥前葉片、半黃半綠葉片、小于7 cm畸形葉、大于7 cm畸形葉和新生的恢復葉，各取0.5 g樣品于5 mL 80%冰凍色譜純甲醇（含0.1%酮試劑）里，4℃避光提取過夜，13 000 r/min ，4℃下離心10 min，濾紙過濾后，加入20 μL氨水，在旋轉蒸發儀上40℃加壓蒸發至水相，然后加入乙酸乙酯1 mL萃取，在35℃濃縮至近干，提前分別用10 mL色譜純甲醇和滅菌的超純水活化迪馬公司PXC小柱，處理好的樣品過PXC小柱，先用10 mL 0.1 mol/L的HCL淋洗柱子，再用10 mL色譜純甲醇洗脫，洗脫液在40℃下減壓蒸發至近干，用1 mL色譜純甲醇溶解，0.22 μm無機濾膜過濾，-80℃保存或待測。

4種內源激素含量測定：采用酶聯免疫（ELISA）分析試劑盒法（雙抗體夾心法）測定IAA（生長素）、GA（赤霉素）、ABA（脫落酸）和ZR（玉米素）4種內源激素，加入準備好的樣品和標準品，空白對照不加樣品及酶標試劑，其余步驟相同：37℃反應30 min；洗板5次，加入酶標試劑（避光），37℃反應30 min；洗板5次，加入顯色液A、B，37℃顯色10 min；加入終止液，15 min內在酶標儀上讀OD值，最后制作標準曲線并帶入計算。

1.2.4 數據統計

實驗測定為3次重復，采用SAS 9.1.3對數據進行單因素方差分析和多重比較分析，采用Excel 2013軟件進行數據處理和作圖。

2 結果與分析

2.1 對芽接苗不同時間形態的影響

將草甘膦稀釋液噴施在橡膠樹幼苗第一蓬葉片上，不同時間葉片癥狀如圖1。從圖1可以看出，圖1-A為對照，草甘膦噴施3～5 d后橡膠樹幼苗葉片變黃（圖1-B），10～15 d葉片脫落。葉片脫落后，橡膠樹幼苗枝條開始分蘗、長芽，同時長出第二蓬葉。約30 d第二蓬葉片穩定，呈細長、卷曲形（圖1-C）。約35 d第二蓬新生的葉片形狀會有所恢復，但是仍長于正常葉片（圖1-D），這說明草甘膦對橡膠樹幼苗葉片產生一定的影響。

2.2 對芽接苗葉片中莽草酸和4種激素含量的影響

2.2.1 對莽草酸含量的影響

草甘膦噴施橡膠樹幼苗后，按照試驗方案進行采樣，并測定莽草酸含量，數據顯示，其幼苗在不同形態葉片中莽草酸含量有一定的變化（圖2）。由圖2可知，莽草酸含量未施藥前葉片、半黃半綠葉、<7 cm畸形葉、>7 cm畸形葉和恢復葉分別為1 521.13、1 709.82、380.06、342.56和567.56 μg/g FW，呈下降趨勢。葉片出現半黃半綠時其莽草酸有一定積累，較未施藥前升高了12.40%，隨后畸形葉出現時，莽草酸積累量逐漸下降，分別比未施藥前下降75.01%和77.48%；而當新生葉片恢復時莽草酸積累量有所升高，但相對未施藥前下降62.69%。說明草甘膦只在施藥前期中斷橡膠樹幼苗莽草酸的途徑，使其不能分解下游產物，橡膠樹幼苗后期莽草酸積累量減少，可能由于環境變化或植株自身代謝將草甘膦分解。

2.2.2 對4種激素含量的影響

為了探求葉片扭曲對植物內源激素的影響，測定5種不同葉片形態下ABA（脫落酸）、GA3（赤霉素）、IAA（生長素）、ZR（玉米素）4種激素含量（圖3）。由圖3可以看出，未施藥前葉片、施藥后半黃半綠葉片、<7 cm畸形葉、>7 cm畸形葉和新生的恢復葉IAA含量分別為25.79、22.74 、24.31、25.60和27.04 pmol/L；GA3含量分別為69.0、139.60、159.92、167.26和196.45 pg/mL。橡膠苗從施藥到長出恢復葉的過程中，IAA和GA3含量都呈現緩慢上升，與對照差異不明顯。未施藥前葉片、施藥后半黃半綠葉片、<7 cm畸形葉、>7 cm畸形葉和新生的恢復葉ABA含量分別為100.82、88.32、131.47、146.80和124.84 μg/L，葉片處于半黃半綠時ABA含量較對照下降12.40%，而在畸形葉和恢復葉中ABA含量分別較未施藥前升高30.40%、45.61%和23.82%。橡膠苗從施藥到長出恢復葉的過程中，ZR含量分別為146.23、97.19、206.89、272.02和123.42 ng/L，葉片處于半黃半綠和恢復葉時，ZR含量較對照分別下降33.54%和15.60%，而在畸形葉中ZR含量分別較未施藥前升高41.48%、86.02%，說明草甘膦影響橡膠樹生長過程中激素含量的運輸及分布。

3 討論與結論

近年來，隨著勞動力成本的增加，草甘膦的用量不斷上升，已成為市面上應用最廣的除草劑品種[27]。草甘膦在施藥過程中，地面或航空噴霧的飄移對作物造成的藥害已成為生產中急需解決的問題[28-30]。

草甘膦競爭性抑制莽草酸合成途徑中的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶的活性，因此，提高EPSPS活性，可以將植物體內多余的莽草酸代謝掉，保證芳香族氨基酸的正常代謝[31]。國內外研究結果表明：在噴施草甘膦后，正常植物體內莽草酸含量上升，植物EPSPS酶活性受到抑制。在大豆實驗中，被草甘膦處理的常規大豆中莽草酸含量隨藥害天數逐漸增加，最終導致植株死亡[32]。對比研究發現，經草甘膦處理后不同形態橡膠樹葉片的莽草酸含量較對照組反而下降。說明橡膠樹可能受外界因素或是自身代謝作用的影響，導致本研究結果與大豆實驗不同。另有研究結果表明，草甘膦可以降低棉花花粉活性，產生畸形花，可能是棉花受到草甘膦脅迫產生了抗性基因，具有抗性基因的EPSPS酶將莽草酸轉化為EPSP[33]，使莽草酸含量沒有積累。

植物激素既可以調節植物生長，也可以在逆境中維持植物的生長[34]。有研究結果表明，IAA、GA、ZR的含量不足會導致花藥在減數分裂時期得不到足夠的底物和能量。在劉吉燾等[18]的棉花實驗中，草甘膦作用下，棉花花粉敗育，植株體內IAA、GA、ZR的含量低于正常植株，ABA的含量則高于正常植株。在本研究中，草甘膦處理下，橡膠樹不同形態葉片中IAA和GA3含量都呈緩慢上升，但較對照無明顯差異。說明橡膠樹在草甘膦作用下，IAA和GA3含量變化影響不大。ABA和ZR在橡膠樹畸形葉中含量顯著升高，ABA含量高，會抑制細胞生長和促進細胞衰老死亡[18]。ABA和ZR在草甘膦作用下，能夠抑制橡膠樹葉片中細胞生長，橡膠樹葉片畸形可能是其在逆境中所表現的一種應激反應。

本實驗通過對巴西橡膠樹葉片中莽草酸含量和4種激素含量的分析發現，草甘膦導致橡膠樹葉片畸形時，莽草酸含量顯著降低。脫落酸和玉米素含量顯著升高，說明莽草酸和植物激素共同調節著橡膠樹的生長，且影響了橡膠樹葉片畸形。

參考文獻

[1] 武 驍. 草甘膦抗性研究進展[J]. 世界農藥，2014，36（5）：15-19.

[2] Amrhein N， Deus B， Gehrke P. The Site of the Inhibition of the Shikimate Pathway By Glyphosate：Ⅱ.Interference of Glyphosate with Chorismate Formation in Vivo and in Vitro[J]. Plant Physiol， 1980， 66（5）： 830-834.

[3] 高 越，劉 輝，陶 波. 抗草甘膦野生大豆篩選及其抗性生理機制研究[J]. 大豆科學，2013，32（1）：76-79.

[4] Stanton R A， Pratley J E， Hudson D， et al. A risk calculator for glyphosate resistance in Lolium rigidum （gaud.）[J]. Pest Manaq Sci， 2008， 64（4）： 402-408.

[5] Pline W A， Wilcut J W， Duke S O， et al. Tolerance and Accumulation of Shikimic Acid in Response to Glyphosate Applications in Glyphosate-resistant and Nonglyphosate-resistant Cotton （gossypium Hirsutum.）[J]. Agricultural and Food Chem， 2002， 50（3）： 506-512.

[6] 許智宏，李家洋. 中國植物激素研究：過去、現在和未來[J]. 植物學通報，2006，23（5）：433-442.

[7] Barazesh S， Mcsteen P. Hormonal control of grass inflorescence development[J]. Trends in Plant Science， 2008， 13（12）： 656-662.

[8] 李保珠，安國勇，韓 栓. 植物激素ABA在水分脅迫下的功能及信號途徑[J]. 植物生理學報，2012，48（1）：11-18.

[9] 趙 翔，李 娜，王棚濤. 脫落酸調節植物抵御水分脅迫的機制研究[J]. 生命科學，2011，23（1）：115-120.

[10] Bolle C. The role of GRAS proteins in plant signal transduction and development.[J]. Planta， 2004， 218（5）： 683-692.

[11] Fleet C M， Sun T P. A DELLAcate balance： the role of gibberellin in plant morphogenesis[J]. Current Opinion in Plant Biology， 2005， 8（1）： 77-85.

[12] Reddy K N， Bellaloui N， Zablotowicz R M. Glyphosate Effect on Shikimate， Nitrate Reductase Activity， Yield， and Seed Composition in Corn[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry， 2010， 58（6）： 3 646-3 650.

[13] 顧振新，陳志剛，蔣振暉. 赤霉素處理對糙米發芽力及其主要成分變化的影響[J]. 南京農業大學學報，2003，26（1）：74-77.

[14] Thomas S G， Sun T P. Update on gibberellin signaling. A tale of the tall and the short.[J]. Plant Physiology， 2004， 135（2）： 668-676.

[15] 魏靈珠，程建徽，李 琳，等. 赤霉素生物合成與信號傳遞對植物株高的調控[J]. 生物工程學報，2012，8（2）：144-153.

[16] 王兆龍，曹衛星. 細胞分裂素對植物基因表達的調節[J]. 生理學通訊，2000，6（1）：82-88.

[17] 楊鑫浩，李香菊. 草甘膦對耐草甘膦大豆體內莽草酸含量及產量的影響[J]. 雜草科學，2014，2（1）：78-82.

[18] 劉吉燾，狄佳春，陳旭升. 草甘膦誘導抗草甘膦棉花花藥中激素和游離氨基酸含量的變化[J]. 分子植物育種，2014，12（3）：530-536.

[19] 孟慶忠，王貴春，李國榮，等. 草甘膦作為棉花殺雄劑應用研究初報[J]. 湖北農業科學，2010，49（11）：2 706-2 708.

[20] Baur J R. Effect of Glyphosate on Auxin Transport in Corn and Cotton Tissues[J]. Plant Physiol.， 1979， 63（5）： 882-886.

[21] 李小艷，許 晅，李桂俊. 赤霉素對草甘膦的增效作用及其作用機制[J]. 南京農業大學學報，2013，36（3）：36-40.

[22] Gaitonde M K， Gord M W. A Microchemical Method for the Detection and Determination of Shikimic Acid [J]. Biol Chem， 1958， 230（2）： 1 043-1 050.

[23] 婁遠來，鄧淵鈺，沈晉良. 甲磺隆和草甘膦對空心蓮子草乙酰乳酸合酶活性和莽草酸含量的影響[J]. 植物保護學報，2005，32（2）：185-188.

[24] 王 迪. 抗草甘膦野生大豆資源篩選鑒定及抗性機理研究[D]. 河北：河北科技師范學院，2014.

[25] 陳建華，曹 陽，李昌珠，等. 板栗內源激素的高效液相色譜測定方法[J]. 中南林學院學報，2004，24（5）：39-41.

[26] 馬有寧，陳銘學. 植物內源激素預處理方法與色譜檢測技術的研究進展[J]. 中國農學通報，2011，27（3）：15-19.

[27] 蘇少泉. 草甘膦述評[J]. 農藥，2005，44（4）：145-149.

[28] Bellaloui N， Reddy K N， Zablotowicz R M， et al. Simulated glyphosate drift influences nitrate assimilation and nitrogen fixation in non-glyphosate-resistant soybean.[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry， 2006， 54（9）： 3 357-3 364.

[29] Reddy K N， Ding W， Zablotowicz R M， et al. Biological responses to glyphosate drift from aerial application in non-glyphosate-resistant corn[J]. Pest Management Science， 2010， 66（10）： 1 148-1 154.

[30] 楊治峰，張振玲. 草甘膦生殖發育毒性的研究進展[J]. 環境與職業醫學，2013，30（2）：154-156.

[31] 原向陽，郭平毅，張麗光. 不同時期噴施草甘膦對大豆生理指標的影響[J]. 中山大學學報，2009，48（2）：90-94.

[32] 楊鑫浩. 大豆對草甘膦耐受性檢測方法研究[D]. 北京：中國農業科學院，2014.

[33] 卜貴軍. 草甘膦對大豆葉片生理和形態結構的影響[D]. 哈爾濱：東北農業大學，2009.

[34] Peleg Z， Blumwald E. Hormone balance and abiotic stress tolerance in crop plants[J]. Current Opinion in Plant Biology， 2011， 14（3）： 290-295.