不同外植體和植物激素對(duì)大蒜愈傷組織誘導(dǎo)的影響

孔素萍+杜紅霞+楊妍妍+霍雨猛+高莉敏+劉冰江+繆軍+吳雄

摘 要：以大蒜鱗芽基部、莖尖、根尖和試管苗葉片為外植體，研究不同激素配比對(duì)大蒜愈傷組織誘導(dǎo)的影響。結(jié)果表明：大蒜根尖和鱗芽基部比莖尖和試管苗葉片易于誘導(dǎo)愈傷組織，根尖愈傷組織誘導(dǎo)率最高。不同激素配比對(duì)4種外植體愈傷組織誘導(dǎo)的影響不同，根尖在6-BA和2，4-D不同激素配比下全部誘導(dǎo)出愈傷組織；鱗芽基部愈傷組織誘導(dǎo)的最適激素組合為0.3 mg/L 6-BA + 1.5 mg/L 2，4-D或0.5 mg/L 6-BA +2.0 mg/L 2，4-D，誘導(dǎo)率為100%；莖尖愈傷組織誘導(dǎo)的最適激素配比為0.7 mg/L 6-BA +1.5 mg/L 2，4-D，誘導(dǎo)率為85.83%；試管苗葉片愈傷組織誘導(dǎo)的最適激素配比為0.3 mg/L 6-BA + 2.0 mg/L 2，4-D，誘導(dǎo)率為71.67%。

關(guān)鍵詞：大蒜；外植體；植物激素配比；愈傷組織

中圖分類號(hào)：S633.404+.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2016）12-0020-05

Abstract The effects of different plant hormones on the callus induction of garlic were studied by using the base of clove， shoot tips， root tips and leaves of in vitro plantlet as explants in this study. The results showed that root tips and the base of clove were easier to induce callus than shoot tips and leaves of in vitro plantlet. And the callus induction rate of root tips was the highest in the four kinds of explants. Different plant hormone combinations had different effects on the four kinds of explants. The calli were induced from root tips in all combination of 6-BA and 2，4-D. The callus induction rate of the base of clove was 100% in the combination of 0.3 mg/L 6-BA +1.5 mg/L 2，4-D， or 0.5 mg/L 6-BA +2.0 mg/L 2，4-D. The callus induction rate of shoot tips was 85.83% in the best combination of 0.7 mg/L 6-BA and 1.5 mg/L 2，4-D. The combination of 0.3 mg/L 6-BA and 2.0 mg/L 2，4-D was the best for leaves of in vitro plantlet to induce callus， and the rate of callus induction was 71.67%.

Keywords Garlic； Explant； Plant hormone combination；Callus

大蒜（Allium sativum L.）為百合科（Liliacaea）蔥屬（Allium）植物，常年用鱗莖進(jìn)行無性繁殖，繁殖系數(shù)較低，愈傷組織途徑是解決此問題的有效手段之一[1-3]。目前，用于大蒜愈傷組織途徑植株再生的外植體主要有莖尖[4，5]、根[6，7]、葉片[8]、鱗莖盤[9]、花器官[10]等。植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)大蒜愈傷組織誘導(dǎo)起著重要作用[11]，高山林等[12]以MS為基本培養(yǎng)基，誘導(dǎo)莖尖分生組織產(chǎn)生愈傷組織的最適激素配比為0.2 mg/L BA+0.5 mg/L NAA；裴雁曦等[13]研究了2，4-D、NAA和6-BA三種激素與愈傷組織誘導(dǎo)率之間的回歸方程，通過模擬推測得出，愈傷組織最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+0.98～1.14 mg/L 2，4-D+0.93～1.09 mg/L NAA+1.19～1.36 mg/L 6-BA；李轉(zhuǎn)春等[14]在利用大蒜發(fā)芽葉誘導(dǎo)愈傷組織時(shí)發(fā)現(xiàn)，需要在生長素和細(xì)胞分裂素共同作用下才能獲得最佳愈傷組織誘導(dǎo)效果。不同植物激素配比對(duì)同種植物不同部位外植體的愈傷組織誘導(dǎo)影響不同[15-17]，王瑞等[18]報(bào)道，油茶葉片、莖段誘導(dǎo)愈傷組織的最佳激素組合為0.5 mg/L 2，4-D + 1.0 mg/L KT，莖尖誘導(dǎo)愈傷組織的最佳激素配比為0.5 mg/L 2，4-D + 2.0 mg/L KT；3種外植體中，葉片最容易誘導(dǎo)愈傷組織，誘導(dǎo)率可達(dá)100%。但目前不同激素配比對(duì)大蒜不同外植體愈傷組織誘導(dǎo)的影響鮮見報(bào)道。本試驗(yàn)以大蒜不同部位為外植體，研究不同激素配比對(duì)不同外植體愈傷組織誘導(dǎo)的影響，旨在篩選出大蒜愈傷組織誘導(dǎo)的最佳條件，為大蒜植株再生體系的建立奠定基礎(chǔ)，為進(jìn)一步完善大蒜的快繁體系提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及培養(yǎng)方法

選用蘭陵縣大蒜品種‘蒲棵為材料，取材時(shí)期為鱗莖自然晾干并通過休眠。外植體分別為鱗芽基部、莖尖、根尖、試管苗葉片：取健康的鱗芽，去皮后經(jīng)自來水沖洗0.5 h，在無菌條件下依次用75%乙醇消毒1 min、0.1%次氯酸鈉溶液消毒3 min，再用無菌水沖洗3遍。切取鱗芽基部2 mm左右作為外植體，將其按十字狀縱切為四份，接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；經(jīng)過消毒的鱗芽，在無菌條件下剝離出0.2 mm左右?guī)?個(gè)葉原基的莖尖作為外植體，接入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，剝離莖尖時(shí)用解剖針順莖尖生長的方向垂直扎兩針；根尖取自生根試管苗，當(dāng)在無激素培養(yǎng)基上生長的生根試管苗根長至1.5～2.0 cm時(shí)，在無菌條件下，取0.5～1.0 cm帶根尖的根段進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)；試管苗葉片取自利用莖尖在無激素培養(yǎng)基上生成的試管苗，當(dāng)試管苗長至4片葉左右時(shí)，在無菌條件下用剪刀將基部第二片葉剪成0.5 cm×0.5 cm的小塊，用于愈傷組織的誘導(dǎo)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

誘導(dǎo)愈傷組織的基本培養(yǎng)基為B5培養(yǎng)基，其中含蔗糖30 g/L，瓊脂粉6 g/L，pH值5.8～6.0。試驗(yàn)采用裂區(qū)設(shè)計(jì)，主區(qū)因素A為外植體類型（鱗芽基部、莖尖、根尖、試管苗葉片），裂區(qū)因素B和C分別為6-BA、2，4-D，各設(shè)3個(gè)水平：6-BA分別為0.3、0.5、0.7 mg/L，2，4-D分別為1.0、1.5、2.0 mg/L。每個(gè)處理接種60個(gè)外植體，分為3組，作為3次重復(fù)。經(jīng)60 d培養(yǎng)后調(diào)查不同外植體愈傷組織誘導(dǎo)率。

愈傷組織誘導(dǎo)率（%）=產(chǎn)生愈傷組織外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)×100。

1.3 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)室溫度（23.0±2.0）℃，光強(qiáng)25～31 μmol·m-2·s-1、光周期16 h/d。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用DPS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同外植體對(duì)愈傷組織形成的影響

不同外植體的愈傷組織誘導(dǎo)發(fā)生時(shí)間不同，根尖和莖尖愈傷組織形成較快，20 d左右愈傷組織開始形成；其次是試管苗葉片，愈傷組織形成時(shí)間為22 d；鱗芽基部愈傷組織形成最慢，約需25 d。不同外植體形成的愈傷組織顏色也有差別（見圖1），鱗芽基部、根尖和莖尖愈傷組織主要為淡黃色，而試管苗葉片愈傷組織主要為淡綠色，4個(gè)外植體均形成質(zhì)地疏松的愈傷組織。

2.2 不同外植體和植物激素配比對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

在6-BA和2，4-D不同配比條件下，各種外植體對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響具有顯著差異，由表1可知，根尖易于形成愈傷組織，不同6-BA和2，4-D配比下均全部誘導(dǎo)出愈傷組織；鱗芽基部、莖尖和試管苗葉片在不同激素配比下愈傷組織誘導(dǎo)率具有顯著差異，當(dāng)2，4-D為1.5 mg/L和2.0 mg/L時(shí)，鱗芽基部愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)90%以上，在0.3 mg/L 6-BA +1.5 mg/L 2，4-D和0.5 mg/L 6-BA +2.0 mg/L 2，4-D配比下，愈傷組織誘導(dǎo)率為100%；當(dāng)6-BA為 0.7 mg/L、2，4-D為1.5 mg/L時(shí)，莖尖愈傷組織誘導(dǎo)率最高，為85.83%；試管苗葉片愈傷組織誘導(dǎo)率最高為71.67%，在6-BA和2，4-D分別為0.3、2.0 mg/L時(shí)獲得。

2.3 不同因素愈傷組織誘導(dǎo)率的方差分析

方差分析結(jié)果（表2）表明，外植體類型、6-BA和2，4-D不同水平間愈傷組織誘導(dǎo)率差異均達(dá)到極顯著水平，且因素間的交互作用也均達(dá)到了極顯著水平，說明這三個(gè)因素及其交互作用對(duì)大蒜愈傷組織誘導(dǎo)具有極顯著影響。

2.4 不同因素愈傷組織誘導(dǎo)率的多重比較

對(duì)不同因素愈傷組織誘導(dǎo)率進(jìn)行多重比較，結(jié)果（表3）表明，外植體類型中，根尖愈傷組織誘導(dǎo)率最高，為100%，極顯著高于其它外植體；其次是鱗芽基部，愈傷組織誘導(dǎo)率為92.5%；而試管苗葉片愈傷組織誘導(dǎo)率最低，為41.30%。因此，根尖和鱗芽基部是誘導(dǎo)愈傷組織比較理想的外植體。

因素6-BA隨著其濃度的增加，愈傷組織誘導(dǎo)率降低，0.3 mg/L和0.5 mg/L的愈傷組織誘導(dǎo)率極顯著高于0.7 mg/L的；因素2，4-D在1.5 mg/L時(shí)愈傷組織誘導(dǎo)率較高，極顯著高于高濃度和低濃度處理下的愈傷組織誘導(dǎo)率。

3 討論與結(jié)論

3.1 外植體類型對(duì)大蒜愈傷組織誘導(dǎo)的影響

外植體的選擇是愈傷組織誘導(dǎo)的關(guān)鍵步驟[19，20]。李云玲等[21]研究表明，紫花苜蓿子葉和下胚軸在相同培養(yǎng)基MS+2.0 mg/L 2，4-D +1.0 mg/L NAA +0.5 mg/L BA上，下胚軸的愈傷組織誘導(dǎo)率高于子葉。李文靜等[22]選取野生薺菜下胚軸、子葉、真葉和葉柄作為外植體，結(jié)果表明下胚軸出愈率最好。蘇江等[23]研究表明巖黃連不同外植體在愈傷組織誘導(dǎo)上存在較大差異，葉柄和葉片愈傷組織誘導(dǎo)率明顯高于莖尖和莖節(jié)，且葉片愈傷組織誘導(dǎo)率最高。本研究結(jié)果同樣表明，不同類型外植體誘導(dǎo)愈傷組織的難易程度不同，大蒜根尖和鱗芽基部比莖尖和試管苗葉片誘導(dǎo)愈傷組織能力強(qiáng)，愈傷組織誘導(dǎo)率極顯著高于后兩者。

3.2 不同植物激素對(duì)大蒜愈傷組織誘導(dǎo)的影響

許多研究表明，影響愈傷組織誘導(dǎo)最大的因素是外源生長素和細(xì)胞分裂素濃度以及兩者之間的配比[24，25]，且外植體材料不同，誘導(dǎo)愈傷組織的適宜激素濃度不同[27，28]。李志勇等[26]研究表明，以MS為基本培養(yǎng)基，3.0 mg/L 2，4-D + 2.2 mg/L IBA的激素配比可促使廣州白皮蒜瓣愈傷組織大量發(fā)生。賈曉梅等[29]報(bào)道，0.3 mg/L NAA +2.0 mg/L 6-BA為貼梗海棠莖段誘導(dǎo)愈傷組織的最適激素配比，而0.3 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA為葉片誘導(dǎo)愈傷組織的最適激素配比。曲靜等[30]研究表明，以MS為基本培養(yǎng)基，誘導(dǎo)辣椒莖段愈傷組織生成的最佳激素組合為0.1 mg/L 6-BA+2.0 mg/L NAA，而誘導(dǎo)辣椒子葉愈傷組織生成的最佳激素組合為0.1 mg/L 6-BA+4.0 mg/L NAA。欒非時(shí)等[4，10]研究了2，4-D與BA配比對(duì)大蒜莖尖和花原始體愈傷組織誘導(dǎo)和生長的影響，結(jié)果表明，莖尖愈傷組織誘導(dǎo)最佳激素組合為2.0 mg/L 2，4-D+2.0 mg/L BA，花原始體愈傷組織誘導(dǎo)的最佳激素配比為0.05 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L BA。本研究結(jié)果也表明，根尖在6-BA和2，4-D不同配比下全部誘導(dǎo)出愈傷組織；鱗芽基部愈傷組織誘導(dǎo)的最適激素組合為0.3 mg/L 6-BA +1.5 mg/L 2，4-D或0.5 mg/L 6-BA+2.0 mg/L 2，4-D，愈傷組織誘導(dǎo)率為100%；莖尖愈傷組織誘導(dǎo)的最適激素配比為0.7 mg/L 6-BA+1.5 mg/L 2，4-D，莖尖愈傷組織誘導(dǎo)率為85.83%；試管苗葉片愈傷組織誘導(dǎo)的最適激素配比為0.3 mg/L 6-BA+2.0 mg/L 2，4-D，愈傷組織誘導(dǎo)率為71.67%。

參 考 文 獻(xiàn)：

[1] 湯青林， 王志敏， 宋明， 等. 大蒜不定芽的誘導(dǎo)及其增殖系數(shù)的調(diào)節(jié) [J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)， 2006， 22（6）： 224-226.

[2] 李娜， 崔連偉， 孫永生， 等. 海城大蒜組織培養(yǎng)快繁技術(shù)的研究 [J]. 遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2015 （3）： 39-41.

[3] 靳松， 陳澤斌， 夏體淵， 等. 中水大蒜組織培養(yǎng)與快繁技術(shù)研究 [J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2015， 28（3）： 1205-1209.

[4] 欒非時(shí)， 陳典， 崔喜波. 大蒜莖尖愈傷組織誘導(dǎo)、植株分化及變異的研究 [J]. 北方園藝， 1993（23）：25.

[5] Luciani G F， Mary A K， Pellegrini C， et al. Effects of explants and growth regulators in garlic callus formation and plant regeneration [J]. Plant Cell， Tissue and Organ Culture， 2006，87：139-143.

[6] Myers J M， Simon P W. Continuous callus production and regeneration of garlic （Allium sativum L.） using root segments from shoot tip-derived plantlets [J]. Plant Cell Reports， 1998， 17： 726-730.

[7] Zheng S J， Henken B， Krens F A， et al. The development of an efficient cultivar-independent plant regeneration system from callus derived from both apical and non-apical root segments of garlic （Allium sativum L.） [J]. In Vitro Cellular and Developmental Biology-Plant， 2003， 39（3）： 288-292.

[8] 鄭海柔. 大蒜葉片愈傷組織誘導(dǎo)研究 [J]. 上海農(nóng)業(yè)科技， 1989（6）： 19.

[9] 張素芝， 李紀(jì)蓉. 植物激素對(duì)大蒜莖盤組織培養(yǎng)的影響 [J]. 西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2006， 28（5）：805-808.

[10]欒非時(shí)， 陳典， 陳友. 脫毒大蒜花原始體培養(yǎng)增殖技術(shù)的研究 [J]. 中國蔬菜， 1995（3）： 4-6.

[11]林碧英， 傅睿清. 植物激素配比對(duì)大蒜鱗莖盤培養(yǎng)體系的影響 [J]. 福建農(nóng)業(yè)科技， 2008（6）： 71-72.

[12]高山林， 金雍安， 蔡朝暉， 等. 大蒜分生組織培養(yǎng)脫病毒和快速繁殖技術(shù) [J]. 植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)， 2000， 9（3）： 15-18.

[13]裴雁曦， 邢國明， 郝建平. 大蒜鱗芽組織脫分化條件的分析與預(yù)測 [J]. 山西大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 1999，22（1）： 65-70.

[14]李轉(zhuǎn)春， 王珍， 彭愛芳， 等. 寶坻大蒜愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生體系優(yōu)化 [J]. 天津農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，19（3）：9-12.

[15]盧婕， 張曉麗， 劉雯， 等. 外植體和植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)盾葉薯蕷愈傷組織誘導(dǎo)的影響[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2013，52（15）： 3693-3696.

[16]張家菁， 張美珍， 于元杰. 防風(fēng)愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生體系研究 [J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2012，44（8）： 13-16.

[17]毛志光， 劉彥珍， 李奇陽. 激素和外植體對(duì)辣椒愈傷組織誘導(dǎo)的影響 [J]. 吉林農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2013，38（1）： 72-74.

[18]王瑞， 陳永忠， 王湘南， 等. 不同外植體及植物激素對(duì)油茶愈傷組織誘導(dǎo)的影響 [J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)， 2012，28（19）： 29-32.

[19]楊峰， 劉巧蓮， 代真真， 等. 不同基本培養(yǎng)基和外植體對(duì)劍麻愈傷組織誘導(dǎo)及分化的影響 [J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2012，33（3）： 475-478.

[20]周麗麗， 王晶， 閆俊芳， 等. 不同外植體對(duì)紅掌初代培養(yǎng)及愈傷組織誘導(dǎo)的影響 [J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2012，40（28）： 13720-13724.

[21]李云玲， 苗錦山. 紫花苜蓿的組織培養(yǎng)與快繁技術(shù)研究 [J]. 安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)， 2013，19（7）： 51-52.

[22]李文靜， 李學(xué)強(qiáng)， 賈毛毛， 等. 6-BA、NAA和2，4-D不同配比對(duì)薺菜愈傷組織誘導(dǎo)、生長及植株再生的影響 [J]. 植物生理學(xué)報(bào)， 2012（2）： 141-146.

[23]蘇江， 岑忠用， 鄧晰朝， 等. 不同外植體類型誘導(dǎo)巖黃連愈傷組織和再分化的初步研究[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2013，40（17）： 13-15.

[24]張燕梅， 陳志， 李俊峰， 等. 劍麻愈傷組織的誘導(dǎo)和再生體系的建立 [J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2013， 34（1）： 61-66.

[25]劉健暉， 周歡， 伍琴文， 等. 不同激素濃度對(duì)羅漢果愈傷組織誘導(dǎo)的影響 [J]. 安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)， 2014（7）： 29-30，35.

[26]李志勇， 羅煥亮， 郭勇. 大蒜愈傷組織誘導(dǎo)條件的優(yōu)化 [J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 1999， 20（4）：54-58.

[27]郭紹云， 彭宏祥， 何新華， 等. 荔枝不同外植體愈傷組織誘導(dǎo)研究 [J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2014，27（2）： 748-753.

[28]張慶紅， 湯麗云， 司徒少金， 等. 藥用植物梔子的組織培養(yǎng) [J]. 植物學(xué)報(bào)， 2014，49（3）： 331-336.

[29]賈曉梅， 周悅， 曹柳青， 等. 不同外植體及激素組合對(duì)貼梗海棠愈傷組織誘導(dǎo)的影響[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2016，44（2）： 54-56.

[30]曲靜， 劉思言， 姚丹， 等. 辣椒組織培養(yǎng)再生體系的影響因素研究 [J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2014，46（6）： 27-29，34.