光催化合成銀納米簇對半胱氨酸的檢測

周林宗，王干珍，易曉明，朱麗琴，彭君

（1. 國土資源部長沙礦產資源監督檢測中心，湖南長沙，410007；2. 楚雄師范學院，云南楚雄，675000）

光催化合成銀納米簇對半胱氨酸的檢測

周林宗2，王干珍1，易曉明1，朱麗琴1，彭君1

（1. 國土資源部長沙礦產資源監督檢測中心，湖南長沙，410007；2. 楚雄師范學院，云南楚雄，675000）

以木瓜蛋白酶為模板，通過光催化法合成了光學性質穩定、生物相容性好的銀納簇。研究發現，將一定濃度的半胱氨酸加入銀納米簇和銀離子的混合溶液后，混合溶液在365 nm處會出現一個等離子共振吸收峰，且與半胱氨酸的濃度有良好的線性關系。因此，建立了半胱氨酸的紫外吸收光譜分析法，實現了0.5 μM～60.0 μM濃度范圍內半胱氨酸的定量測定，檢出限達0.5 μM。這種檢測方法具有良好選擇性，常見的生物小分子均不會對檢測造成影響。

銀納米簇；光催化；紫外分光光度法；半胱氨酸

引言

類似于金銀納米粒子等貴金屬納米粒子，因具有特殊光學性質而引起人們關注，并被廣泛應用到生物標記、細胞成像[1]、癌癥臨床診斷和治療[2]等各個領域。納米粒子是20世紀80年代中期發展起來的一種尺寸處于原子簇和宏觀物體交界過渡區域的一類特殊微粒[3]。由于納米顆粒具有量子效應、表面效應、小尺寸效應[4]以及“宏觀量子隧道效應”[5]，從而呈現出優良的光學性質[6]、電學性質和良好的生物相容性[2]等。目前，合成銀納米粒子的方法有化學合成法[7,8]、種子培養法[9]、微乳液培養法[10]、輻射法[11]、超臨界流體法[12]等，但是這些方法都要用到大量有毒有機試劑和還原劑，會對環境造成一定影響。另外，物理方法需要先進設備和嚴格條件控制。一些作為模板分子的天然產物雖可用來合成銀納米粒子，但是時間控制以及嚴格的合成條件也給合成帶來了挑戰。因此，建立一種簡單、快速及綠色的合成銀納米顆粒的方法令人期待。

半胱氨酸是廣泛存在于生物系統內的一種具有還原性基團琉基(-SH)的氨基酸[13]。半胱氨酸在人體內具有重要作用，它是通過二硫鍵支撐蛋白質的二級結構而與蛋白質分子作用，從而具有許多包括新陳代謝等的生物功能[14]。傳統的檢測半胱氨酸的方法有高效液相色譜法、熒光光譜法[15]和電化學伏安法等。然而，這些方法需要昂貴復雜的設備，操作復雜、費時，從而限制了其應用，因此建立一種簡單、快速、選擇性好的方法來檢測半胱氨酸具有重要意義。

綜合上述考慮，以木瓜蛋白酶為模板，利用光催化法合成了光學性質穩定、生物相容性好的銀納米簇，并根據納米簇等離子共振吸收峰變化來檢測半胱氨酸（Cys），這是一種快速簡單、綠色環保、低成本的新方法。首先，在紫外燈光照的情況下光催化合成銀納米簇，然后加入半胱氨酸，銀納米簇在365 nm處會出現一個等離子共振吸收峰，且在365 nm處的吸光度變化與半胱氨酸的濃度有良好的關系，在0.5 μM～60 μM有很好的線性范圍，最低檢測限為0.5 μM。此外，選擇性明顯提高，其他生物小分子，包括氨基酸、葡萄糖、多巴胺等，均對檢測無干擾。基于上述現象，最終建立了基于光催化合成銀納米簇紫外可見分光光度法對半胱氨酸的檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

銀納米粒子溶膠的紫外-可見吸收光譜是通過UV-2550紫外-可見分光光度計（日本，島津）用10 mm×2 mm寬的石英比色皿測得；銀納米粒子的形態和大小使用JEM-2100高分辨率透射電子顯微鏡（日本電子公司，日本）觀測；制備Ag（Ⅰ）-木瓜蛋白酶化合物的攪拌器使用SZCL-2A 數顯智能控溫磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責任公司）；紫外光照使用ZF-1型三用紫外分析儀（上海驥輝科學分析儀器有限公司）3 W燈進行光照實驗；QL-901漩渦混合儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）用于溶液混勻；實驗中緩沖溶液的pH是通過PHS-25型pH計（上海雷磁儀器廠）測定。

實驗所使用的試劑木瓜蛋白酶（國藥試劑化學試劑有限公司）、L-半胱氨酸（國藥集團化學試劑有限公司，上海）、儲備液置于4℃冰箱避光保存、AgNO3（99.999 5%，Alfa Aesar）、酪氨酸、谷氨酸、亮氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、組氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、精氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、纈氨酸、葡萄糖。其他化學試劑均為分析純，實驗中所用的水為超純水（電阻率18.25 MΩ）。

1.2 紫外光催化合成木瓜蛋白酶包裹的銀納米粒子

實驗使用王水洗過的玻璃儀器，在室溫下移取0.3 mL，50 mg/mL的木瓜蛋白酶溶液于10 mL圓底燒瓶中，在均勻攪拌下快速加入新配制的2.4 mL 10 mM的AgNO3溶液，快速攪拌10 min 后，將該混合溶液轉移到5 mL的石英比色皿里，在365 nm紫外光照射30 min，溶液顏色由無色變為淺棕黃色。然后將溶液轉移到試劑瓶中，在4℃的冰箱里儲存備用。

1.3 半胱氨酸檢測

紫外分光光度法檢測半胱氨酸：首先，將50 μL的銀納米溶膠加入到1.5 mL的離心管中，然后加入不同體積的半胱氨酸（0.1 mM）到反應體系中，快速震蕩30 s后，緊接著加入（20 mM，pH=5.6）B-R緩沖定容到1 000 μL，在漩渦儀上搖勻。實現用紫外分光光度法對半胱氨酸的檢測。

2 結果與討論

2.1 銀納米簇的表征

金屬納米粒子在紫外可見光區有吸收帶或吸收區，這是由等離子共振激發或者電子躍遷所形成的，這是納米粒子尺寸效應的表現，在塊體中是不存在的，而且銀納米粒子的紫外吸收峰一般在415 nm左右。因此觀察銀納米粒子的光學現象非常有意義。合成的銀納米簇通過紫外吸收光譜和掃描電鏡（TEM）來表征（如圖1）。銀納米簇最大吸收波長在420 nm處。從TEM圖中看出制備的銀納米簇的外觀基本為球形，粒度分布均勻，顆粒粒徑小，粒徑大部分小于5 nm。

圖1 木瓜蛋白酶穩定銀納米簇的紫外吸收光譜圖

2.2 半胱氨酸檢測實驗條件優化

本實驗利用紫外光催化合成的銀納米簇是首次報道的，實驗中對銀納米簇檢測半胱氨酸的檢測條件進行優化，主要優化了緩沖溶液和反應體系的pH值。

2.2.1 緩沖溶液的選擇

為了得到穩定的紫外吸收值，在相同銀納米簇里分別加入相同濃度不同種類的緩沖溶液，然后再加入30 μM的半胱氨酸，反應后掃描反應體系的紫外吸收光譜，對比365 nm處的吸收值。從實驗結果可以看出（如圖2所示），B-R緩沖條件下在365 nm處的紫外吸收增強得最多，所以選擇的緩沖溶液為B-R緩沖。

圖2 在365 nm處不同的緩沖溶液檢測半胱氨酸的紫外吸收值

實驗條件：銀納米簇（通過木瓜蛋白酶估算）1.112 mg/mL，Ag+濃度：1.78 mM，半胱氨酸：30 μM，緩沖溶液濃度：20 mM，pH=7.0，反應時間：20 min，反應溫度：25 ℃。

2.2.2 pH值的優化

緩沖溶液的酸度對半胱氨酸檢測的影響，實驗中在銀納米粒子和半胱氨酸濃度不變的情況下，通過改變加入不同pH值的B-R緩沖溶液來控制反應體系的酸度。pH值的酸度范圍是4～10，實驗結果如圖3所示。隨著pH值的增加，365 nm處的吸收峰強度明顯增強，當反應的pH為8時，365 nm處的紫外可見吸收值最強，有利于對半胱氨酸的檢測，所以最終選擇檢測半胱氨酸時使用pH為9的B-R緩沖溶液。

圖3 不同pH檢測半胱氨酸在365 nm處的紫外吸收值

實驗條件：銀納米簇：8 mg/mL；半胱氨酸：30 μM，反應時間：20 min，反應溫度為25 ℃。

2.3 選擇性實驗

為了考察方法的選擇性，實驗選用多種氨基酸、葡萄糖、多巴胺等進行了研究。結果如圖4所示，可以得出具有較強還原性的1.5 mM多巴胺（DA）和葡萄糖（Glu）與銀納米團簇反應后會引起體系吸光度增加很少，這說明本方法有較好的選擇性。

圖4 不同物質與銀納米簇反應在365 nm處的吸光度與空白樣品吸光度的比值

實驗條件：銀納米簇：3.2 mg/mL，半胱氨酸的濃度為30 μM，其他物質的濃度為1.5 mM，反應時間為20 min。

2.4 光譜法對半胱氨酸的檢測

在最佳實驗條件下，向銀納米簇溶液中加入不同濃度的半胱氨酸，當半胱氨酸的濃度不斷增加，如圖5（a）所示體系在365 nm 處的紫外吸收峰逐漸增強，且其吸光度值與半胱氨酸濃度具有良好的線性關系（如圖5（b）所示），線性回歸方程為A/A0= 0.970 + 0.137 C，R2= 0.996 7，檢測下限為0.5 μM。

圖5 光譜法對半胱氨酸的檢測

2.5 加標回收實驗

為了檢驗方法的可行性，采用加標回收實驗，結果如表1所示。可以看出此方法用來檢測半胱氨酸是可靠的。

表1 半胱氨酸分析結果

3 結論

以木瓜蛋白酶為模板，通過光催化法合成了光學性質穩定、生物相容性好的銀納米簇，并根據納米簇的等離子共振吸收峰變化來檢測半胱氨酸（Cys），這是一種快速簡單、綠色環保、低成本的新方法。這種方法首先在紫外燈存在的情況下光催化合成銀納米簇，然后加入半胱氨酸，在365 nm處會出現一個等離子共振吸收峰，且在365 nm處的吸光度變化與半胱氨酸的濃度有良好的線性關系，在0.5 μM～60.0 μM有很好的線性范圍，最低檢測限為0.5 μM。該檢測方法對半胱氨酸具有高選擇性。基于此現象，最終建立了基于光催化合成銀納米簇紫外可見分光光度法對半胱氨酸的檢測。

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彭君(1981-)，通信作者，男，湖南人，博士。主要研究方向：光譜分析。

E-mail: pengjun6539@126.com

Photocatalytic Synthesis of Silver Nanoclusters for Detection of Cysteine

ZHOU Lin-zong2, WANG Gan-zhen1, YI Xiao-ming1, ZHU Li-qin1, PENG Jun1

(1. The Ministry of Land and Resources of Changsha Mineral Resources Supervision and Inspection Center, Changsha, Hunan,410007, China; 2. Chuxiong Normal University, Chuxiong, Yunnan,675000, China)

Silver nanoclusters (AgNCs) with excellent photostability and biocompatibility have been synthesized using photocatalysis method in which papain is used as a template. When cysteine (Cys) with certain concentration is added into mixed solution of AgNCs and silver ions, a strong absorption band near 365 nm could be found in their absorption spectra owing to localized surface plasmon resonance (LSPR) of produced AgNCs. The absorbance changes at 365 nm have a good relationship with Cys concentration. The present assay allows for the sensing of Cys in the range from 0.5 μM to 60.0 μM, with a limit of detection (LOD) as low as 0.5 μM. More importantly, this colorimetric method has high selectivity to Cys. Potential interferes, such as glucose and dopamine will not affect the detection of Cys.

Silver Nanoclusters; Photocatalytic; UV Spectrophotometry; Cysteine

O6

A

2095-8412 (2016) 06-1060-05

10.14103/j.issn.2095-8412.2016.06.001

周林宗(1962-)，男，云南人，副教授。主要研究方向：應用化學。E-mail: zhoulinzong@163.com