活血止痛納米凝膠貼膏經皮滲透特性及藥效評價

姚瑤，馮偉紅，王嵐，易紅，梁日欣，何愛萍，殷曉杰，杜茂波，劉淑芝

1.首都醫科大學，北京 100069；2.中國中醫科學院中藥研究所，北京 100700；3.江西中醫藥大學，江西 南昌 330004

論著·中藥研究與開發

活血止痛納米凝膠貼膏經皮滲透特性及藥效評價

姚瑤1，2，馮偉紅2，王嵐2，易紅2，梁日欣2，何愛萍3，殷曉杰2，杜茂波2，劉淑芝2

1.首都醫科大學，北京 100069；2.中國中醫科學院中藥研究所，北京 100700；3.江西中醫藥大學，江西 南昌 330004

目的研究微乳/醇質體對活血止痛凝膠貼膏的經皮滲透特性及對藥效的影響。方法采用改進的Franz擴散池法進行體外透皮試驗，以離體小鼠皮膚為透過屏障，采用超高效液相色譜法測定指標成分丹皮酚、丁香酚、水楊酸甲酯的含量，評價活血止痛凝膠貼膏的經皮滲透效果。并采用小鼠醋酸扭體實驗比較其抗炎鎮痛作用。結果凝膠貼膏、微乳凝膠貼膏和醇質體凝膠貼膏丹皮酚24 h累計透過率分別為65.30％、61.30％、60.20％，丁香酚24 h累計透過率分別為51.08％、54.71％、55.66％，水楊酸甲酯24 h累計透過率分別為49.20％、65.17％、72.15％。微乳凝膠貼膏大劑量組、醇質體凝膠貼膏中劑量組對減少模型動物腹腔內毛細血管的炎性滲出、降低毛細血管通透性有較好的作用（P＜0.05）。結論基于微乳/醇質體技術的復合型納米載體可使活血止痛凝膠貼膏中有效成分透過皮膚屏障的能力更優，從而提高藥效。

活血止痛凝膠貼膏；微乳；醇質體；透皮試驗；抗炎；鎮痛

活血止痛膏由干姜、陳皮、丁香、胡椒、荊芥、牡丹皮、水楊酸甲酯等28味中藥組成，具有活血止痛、舒筋活絡功效，主治筋骨疼痛、肌肉麻痹、痰核流注、關節酸痛[1]。原劑型為橡膠膏劑，上市多年，療效確切，被廣泛使用。由于橡膠膏劑透氣性差、易致敏[2]，故將其改為凝膠貼膏。活血止痛膏處方均含有揮發油等脂溶性成分，而凝膠貼膏是以水溶性高分子材料為基質的外用貼劑，為保證處方藥與基質的高度融合，提高制劑穩定性，本研究以凝膠貼膏為載體，微乳/醇質體[3-5]為釋藥系統，制備復合型納米經皮給藥制劑，在解決脂溶性成分與水溶性基質相容性的同時，利用微乳、醇質體納米化的優勢，促進藥物經皮滲透。以方中脂溶性成分丹皮酚、丁香酚、水楊酸甲酯為定量指標，考察體外經皮滲透特性和對藥效的影響，評價微乳、醇質體在中藥復方經皮給藥制劑中應用的可行性。

1 儀器、試藥與動物

Waters Acquity HPLC H-Class Core System超高效液相色譜儀，BSA224S CW型電子分析天平（德國賽多利斯公司），TK-20B型Franz擴散池（上海鍇凱有限公司），透析袋（截留相對分子質量7000，北京經科宏達生物技術有限公司），Z92-BD多功能攪拌器（天津利華儀器廠）。

活血止痛凝膠貼膏（自制，批號160615），微乳活血止痛凝膠貼膏（自制，批號160626），醇質體活血止痛凝膠貼膏（自制，批號160626）；丹皮酚對照品（批號D-002-140728）、丁香酚對照品（批號D-064-140728）、水楊酸甲酯對照品（批號S-018-150728），成都瑞芬生物科技有限公司；甲醇、乙腈為HPLC級（美國，Fisher公司），水為屈臣氏蒸餾水，冰醋酸（北京化工廠，批號20150704），伊文思藍（上海化學試劑廠，批號030712），其余試劑均為分析純。

昆明種小鼠，雄性，透皮試驗小鼠體質量14～16 g、4～5周齡，藥效學試驗小鼠體質量20～22 g、6～7周齡，中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心，飼養于SPF級動物房，動物許可證號SCXK（軍）2012-0004。

2 方法與結果

2.1 方法學考察

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取丹皮酚、丁香酚、水楊酸甲酯對照品適量，置25 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，配成濃度分別為1.48、8.92、18.2 mg/L的混合對照品儲備液。精密量取該儲備液1 mL于 10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得混合對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取活血止痛凝膠貼膏體外透皮接收液，過0.20 μm微孔濾膜，取續濾液，即得。

2.1.3 陰性對照溶液的制備 取凝膠貼膏空白基質體外透皮接收液，過0.20 μm微孔濾膜，取續濾液，即得。

2.1.4 色譜條件與系統適用性試驗 色譜柱：Acquity UPLC?BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1％甲酸水（B），梯度洗脫（0～4 min，10％～90％A）；檢測波長：280 nm，柱溫：30 ℃，流速：0.6 mL/min。在上述色譜條件下，對照品溶液、供試品溶液中丹皮酚、丁香酚和水楊酸甲酯均分離良好，陰性對照溶液無干擾。色譜圖見圖1。

圖1 活血止痛凝膠貼膏中3種成分UPLC圖

2.1.5 線性關系考察 取混合對照品溶液3 mL置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，進樣1 μL，再將混合對照品儲備液分別進樣0.1、0.5、1.0、2.5、5.0 μL，按“2.1.4”項下色譜條件進樣，測定丹皮酚、丁香酚和水楊酸甲酯的峰面積，并以各成分的進樣質量（ng）為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程。結果顯示，3種待測成分在確定的線性范圍內線性關系良好，見表1。

表1 丹皮酚、丁香酚和水楊酸甲酯線性關系考察結果

2.1.6 日內精密度試驗 分別精密吸取2、1、12 h接收液，為高、中、低濃度，于1 d內連續進樣6次，分別測定丹皮酚、丁香酚和水楊酸甲酯峰面積，結果顯示各成分RSD均在3％以下，表明儀器精密度良好，見表2。

2.1.7 日間精密度試驗 分別精密吸取2、1、12 h接收液，為高、中、低濃度，于3 d內每日分別連續進樣6次，分別測定丹皮酚、丁香酚和水楊酸甲酯峰面積，結果顯示各成分RSD均在3％以下，表明儀器精密度良好，見表2。

2.1.8 穩定性試驗 精密吸取同一份供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24、48 h進樣，測定丹皮酚、丁香酚和水楊酸甲酯峰面積，結果RSD分別為1.4％、1.2％、0.24％，表明供試品溶液在48 h內穩定，見表2。

2.1.9 重復性試驗 精密吸取6份供試品溶液，注入超高效液相色譜儀中，分別測定丹皮酚、丁香酚和水楊酸甲酯含量，RSD分別為1.3％、1.6％、1.2％，表明方法的重復性良好，見表2。

表2 活血止痛凝膠貼膏含量測定方法學考察結果（％）

2.1.10 加樣回收率試驗 精密量取已知含量的接收液5 mL，按樣品含量∶對照品加入量大致為1∶1比例加入丹皮酚、丁香酚和水楊酸甲酯混合對照品溶液，加甲醇定容至10 mL，按“2.1.4”項下色譜條件進行測定，結果丹皮酚、丁香酚、水楊酸甲酯的平均加樣回收率分別為98.44％、102.33％、101.93％，RSD分別為1.68％、0.65％、1.90％，表明方法的準確度良好，結果見表3。

2.2 凝膠貼膏基質的制備

2.2.1 活血止痛凝膠貼膏的制備 精密稱取處方量活血止痛浸膏和凝膠貼膏基質，混合均勻，制成膏體后均勻涂布于襯布上，加蓋聚乙烯薄膜，即得活血止痛凝膠貼膏樣品。活血止痛浸膏中丹皮酚、丁香酚、水楊酸甲酯含量分別為1.42、11.19、125.36 mg/g浸膏。

2.2.2 微乳活血止痛凝膠貼膏的制備 按處方比例稱取活血止痛浸膏、樟腦、薄荷腦、冰片、水楊酸甲酯與適量中鏈甘油三酸酯、聚氧乙烯氫化蓖麻油和丙二醇，按微乳制備工藝混合，使藥物溶解完全，于室溫采用磁力攪拌器邊攪拌邊加入處方量的水至澄清透明，即得O/W型載藥活血止痛微乳，用載藥微乳溶脹輔料混合均勻，制成膏體后均勻涂布于襯布上，加蓋聚乙烯薄膜，即得微乳活血止痛凝膠貼膏樣品。

表3 活血止痛凝膠貼膏中丹皮酚、丁香酚和水楊酸甲酯加樣回收率試驗

2.2.3 醇質體凝膠貼膏的制備 采用注入法制備活血止痛醇質體，稱取處方量冰片、樟腦、薄荷腦、水楊酸甲酯加入膽固醇、磷脂、表面活性劑和維生素E油，注入一定量的乙醇，在密閉、溫度35 ℃、磁力攪拌條件下溶解完全后，將純水緩慢加入乙醇溶液中，持續攪拌5 min，攪拌結束后將醇質體放至室溫，經0.20 μm微孔濾膜過濾，得醇質體。將醇質體與其他藥材醇提物混合均勻，即得醇質體浸膏。稱取處方量醇質體浸膏和基質，混合均勻，制成膏體后均勻涂布于襯布上，加蓋聚乙烯薄膜，即得醇質體活血止痛凝膠貼膏樣品。

2.3 體外經皮滲透試驗

2.3.1 離體鼠皮的制備 小鼠斷頸處死，適量脫毛劑脫去鼠毛，生理鹽水沖洗干凈，剝離皮膚，去除脂肪層、筋膜，置于生理鹽水中，選取完整無破損皮膚。

2.3.2 經皮滲透試驗 采用Franz擴散池，將活血止痛凝膠貼膏、微乳活血止痛凝膠貼膏、醇質體活血止痛凝膠貼膏分別設為A、B、C組，每組精密稱取凝膠貼膏0.500 g/份，平行5份。將鼠皮固定在擴散池與接收池之間，擴散面積為3.14 cm2，接收液為PEG400-95％乙醇-生理鹽水（1∶3∶6），磁力攪拌轉速為350 r/min，控制溫度為（32±0.2）℃，計時，分別于1、2、4、8、12、24 h時間點將接收液全部取出，同時補加同體積的新鮮接收液。將接收液作為供試品溶液，過0.20 μm微孔濾膜，采用超高液相色譜法（UPLC）測定供試品中丹皮酚、丁香酚、水楊酸甲酯的含量，分別按照公式計算其累計透過率（Q）。。式中，Ci為第i個時間點樣品的質量濃度，V為每次取樣的體積，W為所取凝膠貼膏樣品中待測成分的含量。以Q對透皮時間（t）作圖，繪制體外透皮曲線。各成分經皮滲透動力學方程見表4～表6，透皮曲線見圖2～圖4。

凝膠貼膏、微乳凝膠貼膏和醇質體凝膠貼膏丹皮酚24 h累計透過率（Qp）分別為65.30％、61.30％、60.20％，丁香酚24 h累計透過率（Qe）分別為51.08％、54.71％、55.66％，水楊酸甲酯24 h累計透過率（Qm）分別為49.20％、65.17％、72.15％。不同釋藥載體的3種成分中只有水楊酸甲酯24 h累計透過率微乳/醇質體凝膠貼膏具有明顯優勢，見圖5。

表4 活血止痛凝膠貼膏中丹皮酚、丁香酚和水楊酸甲酯經皮滲透動力學

表5 微乳活血止痛凝膠貼膏中丹皮酚、丁香酚和水楊酸甲酯的經皮滲透動力學

表6 醇質體活血止痛凝膠貼膏中丹皮酚、丁香酚和水楊酸甲酯的經皮滲透動力學

圖2 活血止痛凝膠貼膏中各成分透皮曲線（n＝5）

圖3 微乳活血止痛凝膠貼膏中各成分透皮曲線（n＝5）

圖4 醇質體活血止痛凝膠貼膏中各成分透皮曲線（n＝5）

圖5 不同活血止痛凝膠貼膏中水楊酸甲酯累計透過率對比曲線

2.4 不同釋藥載體活血止痛凝膠貼膏藥效學比較

2.4.1 給藥劑量 本品為已上市產品改劑型，處方劑量不變，折算成小鼠大、中、小劑量為0.52、0.26、0.13 g原藥材/kg。根據每組劑量計算給藥面積，大、中、小劑量分別為1.29、0.645、0.33 cm2/20 g體質量。制備A、B、C樣品貼膏，分別為活血止痛凝膠貼膏、微乳活血止痛凝膠貼膏、醇質體活血止痛凝膠貼膏。

2.4.2 分組與給藥 動物隨機分為11組，對照組（空白基質膏貼），陽性藥組（涂抹雙氯芬酸二乙胺乳膠劑0.1 g/20 g體質量），A樣品大、中、小劑量組，B樣品大、中、小劑量組，C樣品大、中、小劑量組，每組11只。3種樣品均按上述劑量給藥，每日1次，貼于小鼠背部皮膚，固定，4～6 h去除藥膏，清潔皮膚，連續3 d。

2.4.3 觀察指標

2.4.3.1 扭體次數 于第3日給藥后40 min，動物腹腔注射0.6％醋酸0.1 mL/10 g體質量，觀察20 min內各組出現扭體反應的次數，以腹腔內凹、伸展后肢、臀部抬高為陽性指標。計算20 min內小鼠扭體反應次數及藥物對扭體反應的抑制率[6]，抑制率（％）＝（對照組扭體均數－藥物組扭體均數）÷對照組扭體均數×100％。

2.4.3.2 腹腔液吸光度 于給藥后1 h，小鼠靜注0.5％伊文思藍生理鹽水溶液0.1 mL/10 g體質量，20 min后脫頸椎處死，剪開腹部皮膚肌肉，5 mL生理鹽水分數次洗滌腹腔，吸管吸出洗滌液合并，3000 r/min離心15 min，取上清液，于590 nm波長處比色測定光密度（OD）值[6]。

2.4.4 統計學方法 采用SPSS20.0統計軟件進行分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用方差分析。

P＜0.05表示差異有統計學意義。

2.4.5 藥效試驗結果 不同釋藥載體活血止痛凝膠貼膏鎮痛抗炎作用比較見表7。

陽性藥組、微乳凝膠貼膏大劑量組、醇質體凝膠貼膏中劑量組OD值明顯低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）；陽性藥組和凝膠貼膏大、中劑量組，微乳凝膠貼膏中、小劑量組，醇質體凝膠貼膏小劑量組扭體次數均明顯低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），扭體抑制率在50％以上。微乳凝膠貼膏大劑量組、醇質體中劑量組對減少小鼠腹腔內毛細血管的炎性滲出，降低毛細血管通透性有較好作用（P＜0.05），各樣品之間作用未見明顯差異。

表7 活血止痛膏3種樣品鎮痛抗炎作用比較（±s）

表7 活血止痛膏3種樣品鎮痛抗炎作用比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別劑量/（g原藥材/kg）OD值（—x±s）扭體次數（—x±s）抑制率/％對照組 0.925±0.176 26.4±13.1陽性藥組 5.0 0.566±0.175**10.4± 6.3*60.46 A樣品大劑量0.52 0.854±0.172 12.8±10.5*51.40 A樣品中劑量0.26 0.856±0.187 11.4± 9.2*56.61 A樣品小劑量0.13 0.883±0.205 18.7±11.029.23 B樣品大劑量0.52 0.727±0.216*13.2±12.249.87 B樣品中劑量0.26 0.878±0.183 13.5± 9.6*48.99 B樣品小劑量0.13 0.784±0.198 10.1± 8.3*61.66 C樣品大劑量0.52 0.806±0.193 19.1±11.127.58 C樣品中劑量0.26 0.715±0.202*18.2±11.131.00 C樣品小劑量0.13 0.835±0.169 10.6± 6.5*59.81

3 討論

凝膠貼膏、微乳凝膠貼膏和醇質體凝膠貼膏丹皮酚24 h累計透過率分別為65.30％、61.30％、60.20％，丁香酚24 h累計透過率分別為51.08％、54.71％、55.66％，經t檢驗，二者組間比較差異均無統計學意義（P＞0.05）；水楊酸甲酯24 h累計透過率分別為49.20％、65.17％、72.15％，凝膠貼膏與醇質體凝膠貼膏組間比較P＜0.01，微乳凝膠貼膏與醇質體凝膠貼膏組間比較P＜0.01，凝膠貼膏與微乳凝膠貼膏組間比較P＞0.05，三者比較，納米載體對水楊酸甲酯促進經皮滲透效果明顯。丹皮酚、丁香酚組間比較差異無統計學意義，可能與其分子量小且均具有芳香走竄特性，容易經皮滲透等因素有關[7-8]。其透皮特性基本符合Higuchi模型特點。0～4 h經皮滲透過程符合零級過程，4 h后透皮速率減慢且非恒速，可能是皮膚表面藥物濃度降低，皮膚遠端藥物擴散緩慢達不到前4 h制劑中的藥物濃度所致。

從藥效試驗結果可以看出：不同釋藥載體的活血止痛膏貼均能不同程度降低由化學刺激引起的腹腔疼痛，減少小鼠扭體次數，提高扭體反應抑制率；且微乳凝膠貼膏大劑量組、醇質體凝膠貼膏中劑量組對減少小鼠腹腔內毛細血管的炎性滲出、降低毛細血管通透性具有較好作用（P＜0.05）。說明將藥物納米化可提高某些藥物的累計透過率及透皮速率，從而提高藥效[9-11]。

將活血止痛膏制成納米釋藥載體，增加了藥物在整個體系中的溶解度[12-13]，藥物以分子形式容易透過皮膚。同時，微乳或醇質體將脂溶性成分轉化為水溶性，在解決水性凝膠與之相容性并提高了制劑穩定性的同時，又利用微乳和醇質體在經皮滲透中的優勢使藥物透過皮膚。因此，采用納米復合載藥釋藥系統，凝膠貼膏中有效成分透過皮膚屏障的能力更優[14]，本研究也為中藥復方外用制劑的開發提供了新思路。

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Evaluation on Transdermal Absorption Properties and Efficacy of Huoxue Zhitong Cataplasm

YAO Yao1,2, FENG Wei-hong2, WANG Lan2, YI Hong2, LIANG Ri-xin2, HE Ai-ping3, YIN Xiao-jie2,DU Mao-bo2, LIU Shu-zhi2
(1. Capital Medical University, Beijing 100069, China; 2. Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China; 3. Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330004, China)

ObjectiveTo study the effects of microemulsion/ethosomes on transdermal absorption properties and efficacy of Huoxue Zhitong Cataplasm.MethodsThe improved Franz diffusion cells were used for the in-vitro permeation experiment with rat skins as the barriers, which was used to evaluate the transdermal absorption properties. In the erxeriment, the contents of paeonol, eugenol and methyl salicylate were used as markers, and detected by ultra performance liquid chromatography to evaluate the transdermal absorption effects. The anti-inflammatory and analgesia activity were evaluated through the writhing plate experiments.ResultsThe cumulative release rate of paeonol in Huoxue Zhitong Cataplasm, Microemulsion Huoxue Zhitong Cataplasm and Ethosomes Huoxue Zhitong Cataplasm were, in order, 65.30％, 61.30％ and 60.20％ in 24 h; eugenol were, in order, 51.08％, 54.71％ and 55.66％ in 24 h; methyl salicylate were, in order, 49.20％, 65.17％ and 72.15％ in 24 h. Furthermore, Microemulsion Huoxue Zhitong Cataplasm high-dose group and Ethosomes Huoxue Zhitong Cataplasm medium-dose group had good effects on reducing the inflammatory exudate of peritoneal capillary and capillary permeability (P＜0.05) in animal models.ConclusionHuoxue Zhitong Cataplasm based on microemulsion/ ethosomesnano-technology has good transdermal absorption properties and efficacy.

Huoxue Zhitong Cataplasm; microemulsion; ethosomes; transdermal experiment; anti-inflammatory; analgesia activity

R283.5

A

1005-5304(2017)02-0070-06

2016-09-23）

（

2016-10-14；編輯：陳靜）

國家科技重大專項-重大新藥創制（2014ZX09301306009）

劉淑芝，E-mail：liushuzhi2004@sina.com

DOl：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.02.018