基因測序技術在細菌性傳染病監測中的應用

張 淳 張媛媛

基因測序技術在細菌性傳染病監測中的應用

張 淳①張媛媛①

基因測序技術是現代分子生物學研究中最為重要的技術手段，經過數十年發展，以其通量高、速度快及準確性高而被廣泛應用于疾病檢測和監測中。為此，對基因測序技術原理和發展歷程進行綜述，系統介紹目前常見的一代、二代及三代測序技術方法的原理以及基于不同技術原理的各類測序設備，探討各類測序設備在細菌性傳染病應急和預警監測過程中的選擇和應用，并對測序技術在生物學和生物醫學研究中應用發展進行綜述和展望。

基因測序；測序儀器；細菌性傳染病；基因組學；精準醫學

基因測序技術即測定DNA或RNA堿基排序的技術，是現代分子生物學研究中最為重要的技術手段，為基因組學和醫學研究的發展做出了巨大的貢獻。20世紀70年代，Frederick Sanger發明了雙脫氧鏈終止法核酸測序技術(亦被稱為Sanger技術)，揭開了人類解密地球生物遺傳物質的序幕[1]。1990年，人類基因組計劃(human genome project，HGP)正式啟動，該項目利用Sanger測序技術首次完成了人類染色體中所包含的30億個堿基對組成的核苷酸序列，并于2001年發表人類基因組工作草圖，標志著人類基因組計劃成功[2]。二代測序技術的出現改變了過去的研究模式，給基因組學、轉錄組學和宏基因組學研究提供了更為有力的技術工具，并逐步深入到精準醫學研究及細菌性傳染病應急和預警監測過程中。

1 基因測序技術應用概述

細菌性傳染病是公共衛生安全中的重要方面，關系到全社會公民的健康和生命安全。隨著交通越來越便捷，病原體也在全球范圍內迅速擴散，并不斷出現新的變異種類。同時，散發的細菌感染也在不斷發生，無論是人畜共患病還是醫院內感染，都可能造成嚴重的公共衛生事件，威脅人類健康。因此，在應對細菌性傳染病的發生、發展和擴散中最為關鍵的環節是病原體的快速檢測和溯源。傳統的微生物檢測方法，主要包括形態檢查、生物化學和分子生物學方法，涉及的實驗較多、操作繁瑣、培養需要時間較長、準備和收尾工作繁多，且分辨率低，而微生物繁殖速度快，新毒株不斷出現，也使傳統檢測方法的效率大打折扣。而基因測序技術的出現無疑為細菌性傳染病的快速檢測、追蹤溯源提供了有效的技術方法和工具，極大地提高了細菌性傳染病應急和預警監測工作效率和作用。

自1995年迄今20年時間內，已經發布了3萬余株細菌基因組測序數據，這些數據和分析結果所組成的數據庫構成了基于測序技術的細菌性傳染病應急和預警預測體系的堅實基礎，而不斷更新的測序技術和更快、更小及更準確的測序設備，以及更加低廉的測序成本，都使測序技術成為細菌性傳染病應急和預警監測過程中最為重要的技術手段[3]。

2 測序技術原理及應用

2.1 一代測序技術

1977年，桑格測定的第一個基因組序列是全長5，375個堿基的噬菌體X174[4-5]。Sanger測序法，即雙脫氧鏈末端終止法，這一技術是目前最為常用的第一代基因測序技術，其基本原理為，在測序反應中只加入單端引物，并按照一定比例混入4種具有不同熒光標記的雙脫氧核苷酸(dideoxyribonucleoside triphosphate，ddNTP)，使部分DNA鏈的延伸反應由于缺乏3'-OH而終止，從而產生大量具有相同起始點和不同終止點的DNA片段，且這些片段只相差一個堿基；隨后，用高分辨率毛細管電泳分離這些片段，檢測器依次讀取片段末端的熒光信號；最后，利用計算機軟件將這些熒光信號解讀為DNA序列。Sanger法與其他測序技術的主要區別在于：在一個測序反應中只能測定一條目的片段的堿基序列，具有目標明確、結果精準、通量小且讀長長的特點，其測序長度可以達到1，000 bp，對于一些臨床上小樣本基因的檢測和鑒定具有很高的實用價值[6]。

第一臺商業化測序儀是由美國Applied BioSystems公司出品的ABI Prism 370A，其產量為1，000 bp/日。隨后，美國ABI公司又發布了第一臺毛細管電泳測序儀Prism 310，其采用毛細管電泳技術，使含有4種熒光染料的測序產物在一根毛細管中電泳分離，極大提高了測序的精確度，其產量為5，000～15，000 bp/日。在測序技術商品化應用的前20年中，美國ABI公司幾乎壟斷了整個測序市場，從早期的377到ABI 3730XL全自動DNA測序儀以至于最新推出的3500系列，一代測序技術和設備被廣泛應用于基因研究的各個領域。

到目前為止，Sanger測序仍然是作為基因檢測的金標準，也是二代測序(next-generation sequencing，NGS)基因檢測后進行家系內和正常對照組進行驗證的主要手段。同樣地，在細菌性傳染病的應急檢測過程中，Sanger測序技術常常被用來作為細菌感染的確證手段，在獲得可靠線索之后，可根據線索設計引物對病原體的特異基因進行擴增并測序，獲得的基因序列經與數據庫進行比對之后得到明確的病原體種類信息；在細菌性傳染病預警監測過程中，基于Sanger測序技術開發了一系列的細菌性傳染病病原體檢測方法和病原體分子流行病學監測技術，如AFLP、MLVA和MLST等，并被應用于研究細菌的流行病學、群體生物學、致病性和進化等領域[7-9]。

2.2 二代測序技術

一代測序的主要技術特點是測序讀長長(800～1，000 bp)，準確性高(可達99.999%)，但是成本高，通量低，已經不能滿足大數據量產出和未知樣本測序的要求，這些缺點影響了一代測序技術的進一步應用。經過不斷的技術開發和改進，以Roche公司的454技術、Illumina公司的Solexa技術和ABI公司的Solid技術為標志的第二代測序技術誕生。第二代測序技術，亦被稱為下一代測序技術(next generation sequencing，NGS)在極大降低了測序成本的同時，還大幅提高了測序速度，并且保持了高準確性，在病原微生物的快速檢測、溯源及傳染病性疾病防控等公共衛生方面發揮越來越大的作用。

2.2.1 Solexa測序技術

Solexa測序技術原理、商業化設備和應用。Solexa測序技術的核心思想是“邊合成邊測序”(seqencingby synthesis，SBS)，包含“DNA成簇”和“可逆性末端終結反應”兩種核心技術。Solexa測序技術首先將DNA打斷到約100～500 bp大小，再將測序接頭連接到這些短片段上制成測序文庫，然后在含有接頭序列的芯片(flowcell)上將已連接接頭的DNA片段綁定在flowcell上，經橋式PCR反應，將每一個DNA片段擴大百萬倍，形成一個序列單一的模板簇。在接下來的測序反應中，在每個循環過程里，分別標記有4種熒光染料的dNTP和聚合酶被加入到flowcell中。互補的dNTP和DNA片斷的一個堿基配對，通過酶作用加入到引物上，并可通過堿基加到引物后端時所釋放出的熒光基團來提供檢測信號。熒光信號被CCD采集，CCD快速掃描整個陣列檢測特定的結合到每個片斷上的堿基。通過上述的結合，檢測可以重復數百個循環，最后通過計算機軟件，將熒光信號轉化為堿基序列。與一代測序技術相比，Solexa測序技術具有通量高、成本低、準確率高以及讀長較短(單端＜300 bp)的特點[10]。

Illumina公司在2006年初開始推出基于Solexa測序技術的商業化測序設備，第一代設備被命名為Genome Analyzer，GA系列，隨后推出了Hiseq平臺，包含Hiseq2000、2500、3000、4000以及高度集成的X-ten測序系統。同時，為了適應不同客戶的需求，Illumina還推出了集高通量測序性能和臺式測序儀為一體的Nextseq平臺和通量小且更靈活的Miseq平臺。隨著這些測序平臺的推出與應用，測序數據的產出量也由最初的1 Gb升級(GA I)到1.6～1.8 Tb，測序速度不斷加快，而單堿基測序成本則極速降低[11]。

Solexa測序系統是主流的測序設備，市場占有率高達70%，在細菌性傳染病的應急和預警監測過程中，有許多成功應用案例，如通過Hiseq2000系統全基因組分析表明，2011年德國大腸桿菌O104：H4菌株是不同的菌株重組而成的強毒株；利用全基因組序列數據進行分析，表明農場主飼養的綿羊將新型的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌mecC株傳染給了其主人[12]；Harris等[13]針對兒童醫院內部感染的MRSA，通過MiSeq桌面式測序儀快速分析，最終發現醫護人員作為病菌攜帶者導致了兒童監護病房內的持續感染。總之，在現階段細菌性傳染病應急和預警監測過程中，Solexa測序技術幾乎被應用于所有環節當中。

2.2.2 SOLiD測序技術

SOLiD測序技術原理、商業化設備和應用。SOLiD(Sequencing by Oligonucleotide Ligation and Detection，SOLiD)測序技術的核心思想是“邊連接邊測序”，其核心技術為“油包水PCR”和“連接酶測序法”。該技術的測序文庫構建方法與Solexa技術類似，然后通過雜交反應將DNA文庫連接至磁珠，并將磁珠和PCR反應成分液滴包裹在礦物油滴中，形成獨立的反應空間，從而將測序模板進行擴增。測序磁珠通過3'末端的修飾共價結合在SOLiD玻片表面，每個磁珠即一個檢測單元，可以獲得一條序列。SOLiD測序的測序基本原理是通過熒光標記的8堿基單鏈DNA探針與模板配對連接，發出不同的熒光信號，從而讀取目標序列的堿基排列順序。SOLiD技術準確率達到99.99%，優于其他二代測序技術，這是由于目標序列的所有堿基都被讀取了兩次，而且連接測序技術避免了PCR反應在高GC區域的低效，因此對于高GC含量的樣本，SOLiD系統具有非常大的優勢[14]。

SOLiD3測序系統是ABI公司于2007年開始投入用于商業測序應用的儀器，2010年末又發布了最新產品—ABI 5500xl SOLiDTM System測序平臺(SOLiD5版本)，至近年來又發表了ABI 5500xl W SOLiDTM System測序平臺，目前該平臺單次運行可獲得320 Gb數據，但其測序讀長仍維持在單端75 bp，雙端50 bp的水平上，因此在外顯子測序和RNA測序方面仍有應用，但在微生物研究和細菌性傳染病防控領域應用較少[15]。

2.2.3 Roche 454測序技術

454測序技術原理、商業化設備和應用。454測序技術，亦稱為焦磷酸測序技術，其核心思想亦是“邊合成邊測序”，包含“油包水PCR”和“焦磷酸測序技術”兩種核心技術。該技術的建庫方法與上述二代測序技術文庫構建技術類似，三者區別僅為測序接頭序列不同。油包水技術與SOLiD技術類似，而磁珠在測序載體上的固定方式則完全不同，454技術需將磁珠放在一種特制的直徑約為44 μm小孔的PTP平板上，此種平板上每個小孔僅能容納一個磁珠，通過這種方法來固定每個磁珠的位置，以便進行接下來的測序反應過程。使用這種空間區隔測序單元方法，更大程度地避免了光學信號的互相干擾，使454技術成為二代測序技術中讀長最長(可達到600 bp)的測序技術。測序方法采用焦磷酸測序法，在小孔中進行PCR反應，按照一定順序每個反應周期僅加入一種dNTP，如果dNTP能與待測序列配對，則會在合成后釋放焦磷酸基團。釋放的焦磷酸基團會與反應體系中的ATP硫酸化學酶反應生成ATP，生成的ATP和熒光素酶共同氧化使測序反應中的熒光素分子并發出可見光，同時由PTP板另一側的CCD照相機記錄，最后通過計算機進行光信號處理而獲得最終的測序結果。其最主要的一個缺點是無法準確測量同聚物的長度，如當序列中存在類似于PolyA的情況時，測序反應會一次加入多個T，而所加入的T的個數只能通過熒光強度推測獲得，這就有可能導致結果不準確。也正是由于這一原因，454技術會在測序過程中引入插入和缺失的測序錯誤[16-17]。

Roche 454測序系統是第一個商業化運營二代測序技術的平臺，先后推出2個型號，即測序通量較高的GS FLX系統和通量較低的GS Junior系統。前者單次運行可獲得400 Mb數據，后者則獲得35 Mb，二者均可在10 h內完成上機測序實驗，測序反應時間較前述兩種技術具有較大優勢。Roche公司在2013年宣布，在未來3年內逐步關閉454業務，因此，在近3年內基于454技術的測序平臺未進行硬件升級，這也導致454測序技術的應用范圍逐步縮小。

由于在NGS技術中454測序技術具有速度快、通量高、讀長長、準確性高、一致性好及簡便高效的優勢，使其在微生物群落多樣性研究和細菌基因組從頭測序(De novo測序)中的應用十分普遍。微生物群落多樣性以整個微生物群落基因組為研究對象，以功能基因篩選和測序分析為研究手段，研究微生物的多樣性、種群結構、進化關系、功能活性、相互協作關系及與環境之間的關系的微生物研究方法[18]。這種研究方法在細菌性傳染病的應急和預警監測過程中亦有應用，例如基于16s rDNA序列的細菌性病原體檢測，相較于傳統方法，可以實現新病原識別和混合感染中的病原識別[19]。

2.2.4 Ion torrent測序技術

Ion torrent測序技術原理、商業化設備和應用。454技術的發明人之一Jonathan Rothberg還發明了一種基于半導體芯片的測序技術-Ion Torrent。該項技術僅在信號檢測方面與454技術有所不同，在測序過程中不是通過檢測焦磷酸熒光顯色，而是通過檢測H+信號的變化來獲得序列堿基信息。該技術使用了一種布滿小孔的高密度半導體芯片，可以檢測反應池中的pH值的變化。當離子感受器感受到H+信號，H+信號再轉化為數字信號，從而讀出DNA序列。Ion Torrent相比于其他測序技術來說，不需要昂貴的成像設備，因此，設備成本較低，測序速度快，整個上機測序可在2～3.5 h內完成[20]。

ABI公司基于Ion Torrent平臺推出了IonPersonal Genome Machine(PGM)Dx與Ion S5系列，二者的區別為Ion PGM Dx系統可以進行雙向測序，更高通量的Ion Proton與S5系統卻并不支持雙向測序。這些硬件設備為不同需求的研究人員提供了不同的芯片與設備，通量從50 Mb到15 Gb不等，運行時間也從2～7 h不等。ABI同時還基于這些平臺開發了更多的配套設備和配套試劑盒，實現了臨床檢測的高度自動化和標準化[21]。

Ion Torrent在微生物領域的應用與454技術類似，但是由于測序讀長較短，在微生物群落多樣性中的應用弱于454技術，后者的應用范圍更廣。作為目前最快速的二代測序平臺，Ion Torrent在細菌性傳染病的應急檢測中具有其他方法不可比擬的時間優勢。2.3 三代測序技術

基因測序技術在近兩三年中又有新的里程碑。以PacBio公司的單分子實時測序技術和Oxford Nanopore Technologies的納米孔單分子測序技術，被稱之為第三代測序技術。與前兩代相比，其最大的特點是實現了對一個DNA分子的序列測定，也就是說在測序過程無需進行PCR反應來對模板分子進行擴增以擴大檢測信號的強度，這就避免了PCR過程中所引入的偏差(Bias)和錯誤(Error)，實現了對特殊序列的DNA片段的測序。

2.3.1 單分子實時測序技術

單分子實時測序技術原理、商業化設備和應用。單分子實時測序法(single-molecule realtime sequencing，SMRT)是目前最常用的長讀長測序法，該技術核心為“零模波導孔”(zero-mode waveguides，ZMW)。SMRT技術的一個關鍵是怎樣將反應信號與周圍游離堿基的強大熒光背景區別出來，便是利用了ZMW原理，ZMW的孔徑小于檢測激光波長，能量不會輻射到周圍，而是保持直線狀態(光衍射的原理)。當激光從底部打上去后不能穿透小孔進入上方溶液區，能量被限制在一個小范圍里，正好足夠覆蓋需要檢測的部分，使得信號僅來自這個小反應區域，而孔外過多游離核苷酸單體依然留在黑暗中，從而實現將背景降到最低。該技術的酶反應與Solexa技術類似，不同的是將專利的DNA聚合酶(該酶可保持長時間酶活性)固定在孔的底部，讓環狀DNA模板通過ZMW。熒光標記dNTP結合在每個孔的單分子模板上，通過激光或者成像設備記錄ZMW底部標記在核糖核酸上的發射波長的顏色與持續時間來進行序列的讀取。SMRT的技術特點決定了SMRT具有讀長長(平均讀長＞4.5 kb)，速度快(每秒可以讀取10個堿基)的優點，其準確性則是依靠對單一模板的多次測序來實現糾錯，使其最高準確率與Sanger法相似[22]。

2010年4月，美國Pacific Biosciences公司正式發售第三代測序系統-PacBio RS系統，隨后又推出了PacBio RS II系統，系統設備和試劑的升級，帶來了更靈活的臨床應用，更高的測序通量，以及更快的測序速度。

由于SMRT硬件設備高昂的價格，對樣本DNA質量嚴苛的要求，使該設備的應用具有一定的局限性。但是，因其無可比擬的超長讀長、組裝結果高準確度、較高的敏感性(可以檢測頻率在0.1%的minor variants)以及可檢測堿基修飾等特點，使該技術在細菌性傳染病的預警監測過程中，尤其是對于新病原體的鑒定、特定基因元件檢測以及細菌轉錄組測序中具有明顯的優勢[23]。

2.3.2 納米孔測序技術

納米孔測序技術原理、商業化設備和應用。納米孔(nanopore)測序技術是近年來發展的最具應用潛力的測序技術，納米孔的直徑非常細小，僅允許單個核酸聚合物通過，因而可以在此基礎上使用多種方法來進行高通量檢測。納米孔測序技術的共同特點為：①超長的讀長，讀長可達到數十Kb到100 Kb；②錯誤率在1%～4%，且為隨機錯誤，可通過提高測序通量解決；③測序通量高；④測序數據實時可讀；⑤起始DNA在測序過程中不被破壞；⑥樣品制備簡單且成本最低[24]。

2014年，第一個消費級別的nanopore測序儀的原型機——MinION在Oxford Nanopore Technologies(ONT)誕生。MinION技術的核心為“蛋白納米孔測序”，其利用金黃色葡萄球菌α溶血素(Staphylococcus aureus toxin，α-hemolysin)制成納米孔(孔道蛋白)，并使ssDNA鏈穿過納米孔產生特定的電壓改變(K-mer)，相較于其他測序平臺只有1～4種信號而言，MinION的K-mer可有1000多種可能，尤其是當DNA序列中存在堿基修飾的時候可以直接被測定。ONT先后推出了GridION、MinION和PromethION測序平臺，GridION是可以擴展的測序系統，既可以單獨作為一臺儀器工作，又可以多臺連接，帶來更快的結果。MinION測序系統是一次性設備，只有手掌大小，可以直接連接筆記本電腦進行測序，該款測序儀已經完成了太空測序任務，其結果與地面結果無差別。另外一款納米孔測序設備PromethION則是通量最高的納米孔測序設備，體積與一臺平板電腦的大小類似，包含了48個獨立流動單元的高通量平臺，最多可以在2日內輸出2～4 Tb的數據量[25]。

納米孔測序技術作為具有最優應用前景的測序技術，目前，在我國尚未可用的商業化設備，而在全球范圍內，納米孔技術也尚未大規模的應用于細菌性傳染病的防控和研究工作當中。

3 總結與展望

隨著基因測序技術在醫學和生物學領域應用和普及，以及對測序數據數量和質量愈來愈高的要求，推動了基因測序技術持續的高速發展[26]。經過近40年的發展，從一代Sanger測序技術，發展至廣泛應用的二代測序技術，直至日漸成熟的三代測序技術，每一次升級都得益于技術的革命性改變，可以說已經基本實現了高通量、自動化及低成本的目標。

就細菌性傳染病應急和預警監測工作的需求而言，二代和三代基因測序技術與一代基因測序技術聯合應用已經可以基本滿足要求，可在數小時至數日內獲得可靠結果，是細菌性傳染病在應急、預警監測和溯源等必備的技術體系。當實驗室在選擇基因測序技術和購買測序設備時應該充分考慮以下問題：①測序數據量和讀長要求；②單位時間內的測序工作量；③核酸樣本質量；④生物信息分析能力。

綜上所述，隨著對基因組信息更深層次的理解、基因測序技術的進步和生物信息學分析軟件的革新，相信基因測序技術將在生物學和生物醫學研究中發揮更大的作用。

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Application of gene-sequencing technique in the monitoring of bacterial infectious diseases/ZHANG Chun, ZHANG Yuan-yuan//China Medical Equipment,2017,14(7):134-138.

Gene-sequencing technique is the most important techniques in the research of modern molecular biology. After decades of development, it has been widely used in disease detection and monitoring due to its high throughput, fast speed and high accuracy. Therefore, the principle and development process of gene-sequencing technique were summarized in this paper, and the principle of gene-sequencing technique of the first generation, the second generation and the third generation and all kind of gene-sequencing equipment based on various principle of technique were systematic introduced in this paper. Besides, the paper also explored and discussed the selection and application of various kind of gene-sequencing equipment in the emergency and early warning monitoring for bacterial infectious disease. On the other hand, the paper also summarized and prospected the application and development of gene-sequencing technique in biology and biomedical research.

Gene-sequencing; Sequencing instrument; Bacterial infectious diseases; Genome; Precision medicine

Department of Medical Engineering, Beijing Ditan Hospital Capital Medical University, Beijing 100015, China.

張淳,女,(1968- ),碩士，高級工程師。首都醫科大學附屬北京地壇醫院醫學工程處，從事醫療設備管理及醫療設備選型采購工作。

2017-04-05

10.3969/J.ISSN.1672-8270.2017.07.035

1672-8270(2017)07-0134-05

R515

A

①首都醫科大學附屬北京地壇醫院醫學工程處 北京 100015