循環腫瘤DNA在胃癌發生發展中的作用

王曉楠，程民，胡世蓮

(安徽醫科大學附屬安徽省立醫院、安徽省立醫院，安徽省老年醫學研究所，腫瘤免疫與營養治療安徽省重點實驗室，安徽省循證醫學中心，合肥 230001)

·綜述·

循環腫瘤DNA在胃癌發生發展中的作用

王曉楠，程民，胡世蓮

(安徽醫科大學附屬安徽省立醫院、安徽省立醫院，安徽省老年醫學研究所，腫瘤免疫與營養治療安徽省重點實驗室，安徽省循證醫學中心，合肥 230001)

近年來，胃癌的發病率和死亡率居高不下，早期發現、早期診斷、早期治療是防治胃癌的關鍵。隨著現代醫學發展，腫瘤標志物已應用于臨床診斷，但由于腫瘤標志物靈敏度和特異度較低，臨床應用局限，難以滿足"精準醫療"要求。研究表明，循環腫瘤DNA(ctDNA)檢測技術是一種快速、高效、相對無創性的新型"液體活檢"技術，能夠實時監測機體腫瘤狀態、轉移、復發及預后評估。本文闡述ctDNA與胃癌的關系，介紹目前常用的ctDNA檢測技術，探討ctDNA在胃癌臨床診療中的應用價值。

胃腫瘤；腫瘤細胞,循環；基因檢測；分子靶向治療

胃癌是人類最常見的惡性腫瘤之一[1]，嚴重威脅人們的生命健康。近年來，腫瘤的個體化診療已經取得很好的效果，改善了患者的預后，但由于缺乏早期診斷的特異性標志物和有效的治療手段，胃癌患者的復發和轉移率仍居高不下。因此，胃癌的早診、早治是臨床亟待解決的問題。研究顯示，在腫瘤形成的早期階段，腫瘤組織可釋放腫瘤細胞和DNA至外周血，形成循環腫瘤細胞(CTC)及循環腫瘤DNA(ctDNA)。ctDNA的水平與腫瘤發生發展具有相關性，檢測腫瘤患者血液中ctDNA可以提供快速、高效、相對無創性的“液體活檢”[2]，這為腫瘤的早期診斷和治療提供新的研究方向。

1 循環腫瘤DNA與胃癌發生發展的關系

ctDNA與胃癌、乳腺癌、肺癌等多種腫瘤的發生發展關系密切[3-5]，其與胃癌的關系倍受關注，Sai等[6]采用實時熒光定量PCR(RTQ-PCR)對53例胃癌患者血漿ctDNA濃度檢測發現胃癌組血漿DNA濃度明顯高于健康組，晚期胃癌患者的血漿DNA濃度高于早期胃癌患者，說明ctDNA濃度與胃癌的進展有關，與臨床病理類型無關。胃癌的發生與基因改變有關，對胃癌患者的腫瘤組織和相應血漿中的ctDNA進行基因啟動子區的甲基化檢測，發現多數胃癌患者都存在一些基因啟動子區高甲基化的現象。有研究[7]檢測73例胃癌患者血漿中腫瘤細胞TFPI2甲基化，采用實時熒光定量甲基化特異PCR(RTQ-MSP)檢出7例TFPI2甲基化，提示TFPI2甲基化在胃癌患者中存在，在健康對照組中并未檢出。再對樣本進行RTQ-MSP法分析，發現淋巴結轉移和遠處轉移的患者中TFPI2甲基化程度更高，提示其與胃癌的轉移有關。RUNX3是一種腫瘤抑制因子，RUNX3啟動子異常甲基化與包括胃癌在內的很多腫瘤的發生有關。Sakakura等[8]采用RTQ-MSP法檢測胃癌患者血漿ctDNA的RUNX3甲基化，發現29%(19/65)的患者外周血中檢測到RUNX3高甲基化，經手術治療后患者血漿的RUNX3甲基化水平比術前降低12倍。對所有的術前和術后胃癌患者血漿RUNX3甲基化水平進行前瞻性研究發現，術后的胃癌患者RUNX3甲基化水平比術前下降83%，并且RUNX3甲基化程度與腫瘤的分期、淋巴結轉移、血管侵襲有關，敏感性高于CEA。Kolesnikova[9]和Tani[10]采用甲基化特異性聚合酶鏈式反應法(MSP)檢測MGMT，p15，和Hm-LH1的甲基化程度，發現20例胃癌患者MGMT，p15，和Hm-LH1的甲基化程度分別為50%、70%、25%，而晚期胃癌患者中MGMT，p15，和Hm-LH1甲基化程度分別為90%、90%、60%，在健康對照組中并未檢測到異常甲基化。核苷酸切除修復交叉互補基因1(ERCC1)是一種DNA損傷修復基因，王紅兵等[11]采用甲基化特異性PCR技術(MSP法)檢測30例胃癌患者外周血、胃癌組織中ERCC1基因啟動子CpG島甲基化狀態。結果顯示胃癌組織中ERCC1基因啟動子CpG島甲基化率為76.7%，外周血ctDNA的ERCC1基因啟動子CpG島甲基化率為63.3%，提示胃癌患者外周血中的ERCC1基因啟動子CpG島甲基化率與胃癌組織中相似，同時發現ctDNA與原發腫瘤基因組DNA具有相同的遺傳變異。檢測外周血ctDNA可發現腫瘤相關基因的變異，從而反映腫瘤組織的特征性改變。

1999年，García-Olmo在結腸癌腫瘤小鼠模型中發現腫瘤小鼠的血漿可改變人工培養的細胞，因此提出：原發腫瘤病灶的致癌基因通過轉染使易感細胞經過血液循環轉移到遠處的靶器官，這個假設稱為“基因轉移”[12]。Holmgren用實驗證明凋亡小體基因中的DNA能夠轉移到吞噬細胞內，這種轉移DNA可以一直在巨噬細胞內存在。由此推論，位于血液循環中的腫瘤細胞的凋亡小體被吞噬細胞攝取后，釋放發生變異的ctDNA重新進入其他細胞轉染基因，并修改受體細胞的基因組成，即具有轉化潛能的腫瘤DNA發生遷移，造成遠處組織器官轉移的機制稱為“基因轉移”[13]。這種機制與腫瘤的擴散有關，機體內此類轉化細胞應該具有干細胞潛能，因為他們同癌細胞相類似，都具有自我更新能力、分化及轉移到不同組織內等特點。ctDNA可能通過“基因轉移”機制參與了結腸癌、胃癌等的腫瘤復發與轉移[14]。

2 循環腫瘤DNA檢測技術

血清中ctDNA的量比血漿中高3～24倍，但血漿更適合用來分析ctDNA，可能是血清受溶解細胞DNA的污染而影響ctDNA的相對水平[15]。目前常用檢測ctDNA方法有熒光染料法、實時熒光定量PCR(RTQ-PCR)、液滴式數字PCR(ddPCR)和新一代靶向測序(NGS)等。由于所檢測DNA靶標的不同，造成檢測結果亦存在一定的差異，每種方法都有優缺點[16]。熒光染料檢測法敏感性高、重復性好，適合于大規模人群篩查和臨床診斷，但是特異性不強[17-18]。RTQ-PCR可以定量研究，應用范圍廣，但是不同的DNA片段，檢測條件也不相同，需要反復實驗，而且依賴于熒光信號和標準曲線，只能分析較少且已經確定的突變點[19]。ddPCR是將樣本通過微滴發生器進行微滴化處理后進行PCR反應，再用微滴檢測器對每個微滴逐個檢測，最終經分析軟件計算出目標DNA分子的濃度，有以下優點：第一，ddPCR采用終點檢測，直接計算目的序列的拷貝數，無需依賴于Ct值和標準曲線就可以進行精確的定量檢測。第二，ddPCR敏感度和特異度更高，可以篩查0.001%的突變頻率，較qPCR的敏感性增加了1000倍，廣泛地應用于稀有突變檢測、拷貝數變異分析和復雜樣本基因表達檢測等方面[20-21]。NGS可在全基因組進行高通量的檢測，速度快、檢測范圍更廣，并且提高了檢測的準確性，但存在一定的假陽性比率，需進一步驗證。NGS主要用于復發或病情惡化前進行早期預測，以ctDNA-NGS為基礎的分析方法可通過獲取新興突變片段或克隆選擇從而制定一個新的治療方案[22]。

3 循環腫瘤DNA在胃癌臨床診療中的應用

3.1 早期診斷 腫瘤早期診斷是提高腫瘤治愈率，降低腫瘤患者病死率的重要途徑。有些惡性腫瘤沒有可靠的蛋白質生物標志物，有些缺乏特異性，而且大多數的蛋白質生物標志物在循環中持續存在數周，難以準確評估病情。ctDNA的半衰期短(約2h)，特異性強，可動態評估癌癥情況[23]。Kim等[24]研究30例胃癌患者和34例健康對照組血漿ctDNA的水平，觀察胃癌患者術前和手術24 h后的ctDNA，發現晚期胃癌患者ctDNA濃度高于早期胃癌組，早期胃癌組高于健康對照組；相比于術前，胃癌術后患者的ctDNA的含量明顯下降。Park等[25]對54例胃癌患者和59例健康對照組研究發現，胃癌組的ctDNA濃度是對照組的2.4倍，提示血漿ctDNA可作為胃癌早期診斷的腫瘤標志物。腫瘤形成的早期，在外周血中檢測到脫落的ctDNA，有助于腫瘤的早期發現、早期診斷，并針對性治療。

3.2 療效評估 隨著治療手段的多樣化，選擇安全可靠的療效評估手段以驗證新療法的有效性。目前臨床常用療效監測方法有血清學指標(如腫瘤標志物)和影像學檢查(如B超、CT、MRI)均存在很多不足。Bai等[26]檢測非小細胞肺癌患者化療前ctDNA的EGFR突變比例為34.5%。但經化療治療后，下降為23.1%。而這些由EGFR突變陽性轉變為陰性的患者對化療藥物表現出較好的反應性和敏感性。研究對比ctDNA、CTC、CA153和影像學檢查監測轉移性乳腺癌疾病進展，發現ctDNA比其他指標能更早的反映疾病進展和藥物治療反應[27]。用血漿標本追蹤腫瘤特異性的突變基因的動力學變化，ctDNA能夠反映疾病的臨床進程[28]。

3.3 預后判斷 腫瘤的分期及細胞的分化程度是胃癌生存期預測的主要依據，其中TNM臨床分期與疾病診斷、治療方案、患者預后息息相關。觀察結直腸癌患者術后2～5年ctDNA的水平，結果顯示術后檢測到ctDNA的患者病情復發，而陰性的患者沒有復發[29]。將ctDNA與TNM分期結合，在治療前后動態監測ctDNA水平，便于臨床醫師評估療效及更改治療方案。

3.4 靶向治療 ctDNA最重要的臨床應用之一就是根據腫瘤特定基因改變采用特定相應的分子靶向治療，靶向治療不僅對患者身心的傷害小而且對腫瘤的治療效果將遠比傳統方法明顯[30]。甲基化的基因治療可以預防腫瘤的發生，Qu等[31]研究發現5-氮-2′-脫氧胞苷可以逆轉人乳腺癌細胞PDLIM2啟動子的甲基化狀態，恢復PDLIM2表達，并能抑制乳腺癌細胞的致瘤作用。未來幾年以基因治療為基礎的分子靶向治療將會是臨床研究應用的熱點[32]。

4 總結

ctDNA攜帶的腫瘤基因組信息與腫瘤組織具有良好的一致性，能克服常規腫瘤組織活檢所無法突破的腫瘤異質性問題。ctDNA檢測簡單無創，被稱為“液體活檢”。但是目前仍存在以下問題：在對同一類ctDNA定量研究發現各項研究數據之間有較大差異，這可能與ctDNA提取和定量方法不同或者腫瘤患者納入和排除標準不同有關[33]。研發具有特異性和敏感性的技術仍是應用于臨床檢測的關鍵。簡便、花費小的方法將有助于ctDNA的檢測技術盡快進入臨床。ctDNA在胃癌轉移的早期診斷、治療、療效評估和預后分析等方面具有重要意義，有利于針對腫瘤患者實施個體化綜合治療。

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The role of tumor circulating DNA in the development of gastric cancer and research progress

Wang Xiaonan, Cheng Min, Hu Shilian

(Anhui Provincial Hospital, Anhui Institute of Gerontology, Anhui Provincial Key Laboratory of Tumor Immunotherapy and Nutrition Therapy, Anhui Evidence-based Medicine Center, Hefei 230001, China)

HuShilian,Email:hushilian@126.com

With increasing morbidity and mortality of gastric cancer in recent years, the early detection, diagnosis and treatment are critical to the prophylaxis and therapy of gastric cancer nowadays. Tumor markers have gain growing concern to its clinical applications but still confined to the sensitivity and specificity which make it hard to fit for "precision medicine". Some research have shown that circulating tumor DNA(ctDNA) detection is a kind of "liquid biopsy " technology which is rapid、effective and noninvasive. The state of tumor, including metastasis, recurrence and prognosis can be monitored by detecting ctDNA. This review focuses on the relationship between ctDNA and gastric cancer, as well as the detection technology commonly used to explore the application of ctDNA in clinical diagnosis and treatment of gastric cancer.

Stomach neoplasms；Neoplastic cells,circulating；Genetic testing；Molecular targeted therapy

國家自然科學基金(81071808)；安徽省自然科學基金面上項目(1408085MH167)；安徽省國際科技合作項目(1303063017)

王曉楠，碩士在讀，Email:1006445947@qq.com

胡世蓮，主任醫師，教授，博士生導師，Email:hushilian@126.com

R735.2

A

10.3969/J.issn.1672-6790.2017.01.035

2016-08-17)