白芨ISSR—PCR反應體系的建立及優(yōu)化

吳利玲

【摘 要】 目的：對白芨ISSR-PCR反應體系進行建立以及優(yōu)化。方法：采用正交試驗對影響白芨的ISSR-PCR反應體系中的6個影響因素Taq DNA聚合酶、BSA、引物、模板DNA、dNTP、Mg2+進行系統(tǒng)的篩選和優(yōu)化，尋找白芨ISSR-PCR的最優(yōu)條件。結果：經(jīng)過系統(tǒng)的優(yōu)化后，最終確立了最優(yōu)的白芨ISSR-PCR方案，50 μL反應液中Taq DNA聚合酶為2.5U、BSA為7.5g/L、引物為5.0μmoL/L、模板DNA為200ng、dNTP為0.4mmoL/L、Mg2+為4.0mmoL/L。結論：試驗結果得出最佳的白芨ISSR-PCR反應體系，為后期合理有效的應用ISSR方法對白芨遺傳資源的監(jiān)測提供了參考。

【關鍵詞】 白芨；ISSR-PCR反應體系；單因素試驗；正交試驗

【中圖分類號】R284 【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2016）24-0028-03

白芨屬蘭科，其性味甘、苦、澀，微寒，主要歸經(jīng)于肺[1]。白芨現(xiàn)已成為瀕臨滅絕的珍貴物種，對白芨遺傳資源的分類保護已成為人類研究的重大課題之一[2]。ISSR是近年來新興的一種分子標記技術，在植物遺傳資源的保育工作中已得到普及使用[3]。PCR擴增為ISSR的關鍵技術，主要受到6個因素的影響（Taq DNA聚合酶、BSA、引物、模板DNA、dNTP、Mg2+）[4]。研究采用單因素試驗以及正交試驗對影響白芨的ISSR-PCR反應體系中的6個影響因素進行優(yōu)化，尋找白芨ISSR-PCR反應體系的最優(yōu)條件。

1 材料與方法

1.1 材料 白芨購自同仁堂，購得的白芨放置在干燥陰涼處儲存。

1.2 主要試劑與儀器 Taq DNA聚合酶、dNTP、100 bp DNA Ladder、BSA、Mg2+均購自克勞寧（北京）生物科技有限公司。PCR擴增儀（PTC.200，美國MJ公司）、核酸檢測儀（Bio Photometer，美國Eppendoff公司）。

1.3 方法

1.3.1 DNA的提取 白芨基因組DNA的提取方法為改進的CTAB法，并用核酸檢測儀測定獲得的DNA濃度，并用蒸餾水稀釋濃度為0.05g/L，放置在-20℃冰箱中儲存。

1.3.2 PCR擴增反應條件及其產(chǎn)物檢測 參考預實驗結果，退火溫度選擇52℃，PCR擴增反應條件如下：4min預變性于94℃條件下，30s變性于94℃條件下，1min退火于52℃條件下，90s延伸于72℃條件下，共重復35次操作。取6μL所獲得的PCR擴增產(chǎn)物，行1h的電脈操作。用100 bp DNA Ladder作為參照物，1×TAE為緩沖液，5 V/cm恒壓條件，瓊脂糖凝膠為2.0%。

1.3.3 優(yōu)化方法 正交設計選取L25（56）的方案，反應液為50μL，結果見表1。由正交實驗得到的結果，選取數(shù)目多且清晰條帶的組合。

1.3.4 正交實驗的驗證實驗 按照優(yōu)化后的方法行三次ISSR-PCR反應，分析所測定的條帶情況。

2 結果

2.1 正交實驗結果 6因素5水平的正交設計共產(chǎn)生25個擴增產(chǎn)物，結果見表2。Taq DNA：由電脈圖分析可得，當Taq DNA為2.5U時條帶數(shù)目最多，且最清晰。BSA：由組別4的條件得到的電脈圖分析可知，選擇7.5g/L為BSA的最優(yōu)濃度。引物：從正交試驗結果可知，當引物濃度為5.0 μmoL/L時電脈圖條帶數(shù)目最多、最清晰。DNA模板：按不同的濃度進行加樣，其它因素均設為正交試驗的最優(yōu)條件，由電脈圖可知，200ng為最適濃度。dNTP及Mg2+：分別按不同的濃度進行加樣，其它因素均設為正交試驗的最優(yōu)條件，分析圖譜，得出最優(yōu)值。

2.2 正交實驗直觀分析及方差分析 由表2、3可知，最優(yōu)的白芨ISSR-PCR方案，50μL反應液中Taq DNA聚合酶為2.5 U、BSA為7.5g/L、引物為5.0μmoL/L、模板DNA為200ng、dNTP為0.4mmoL/L、Mg2+為4.0mmoL/L。結果分別見表2、表3。

2.3 正交實驗的驗證實驗結果分析 正交實驗的驗證實驗結果表明，優(yōu)化后的方案穩(wěn)定、可行。具體結果見表4。

3 討論

白芨具有消腫止痛以及收斂止血的功效，臨床主要用于肺結核，百日咳，矽肺，十二指腸潰瘍急性穿孔，十二指腸潰瘍出血等疾病的治療[5]。如今，白芨已成為瀕危物種，對其進行有效的育種至關重要，加之不同的白芨很難采用形態(tài)特征進行區(qū)分，而分子標記技術對遺傳資源的保育十分重要[6]。隨著科技的進步，人類對生物體的認識已經(jīng)上升到微觀水平。通過測定微觀分子的水平的線性結構（如DNA序列），來橫向比較不同物種的差異[7]。ISSR簡單易行，普遍應用于物種區(qū)分、遺傳資源保育等領域。具有檢測成功率高、成本較低等特點。ISSR技術可在預先不知序列信息的前提下，能夠僅用一條引物以及基因組中眾多的簡單重復序列就可以進行PCR擴增[8]。

PCR擴增為ISSR的重要技術，主要的影響因素為Taq DNA聚合酶、BSA、引物、模板DNA、dNTP、Mg2+。故每個白芨物種都要制定不一樣的ISSR-PCR條件。由于單因素試驗對所考察的因素水平進行逐一分析，任務量過大，操作過于繁瑣，且無法考察各因素相互的影響作用，故本研究不予單獨采用。正交試驗可全面考察各因素之間的相互影響作用，且能分析各因素之間的輕重次序。正交試驗的缺點為測定結果精密度較差，且對技術水平要求過高。正交試驗與單因素試驗具有互補的作用，故本研究將兩者結合的試驗方法進行優(yōu)化。最終對影響ISSR-PCR反應體系的Taq DNA聚合酶、BSA、引物、模板DNA、dNTP、Mg2+因素進行系統(tǒng)篩選，得到了最優(yōu)的反應條件（50 μL反應液中Taq DNA聚合酶為2.5 U、BSA為7.5g/L、引物為5.0μmoL/L、模板DNA為200ng、dNTP為0.4mmoL/L、Mg2+為4.0mmoL/L）。本實驗在不設重復時，試驗隨機誤差分散式隱含在正交表各列之中，由于隨機誤差與模型誤差相對混雜，而且較大，至使F檢驗的誤差均方差相對較大。

綜上所述，試驗結果得出最佳的白芨ISSR-PCR條件，為ISSR技術在白芨物種鑒別方面提供了實驗依據(jù)。

參考文獻

[1]卓微偉. 中藥白芨的藥理作用及臨床應用的研究進展[J]. 北方藥學， 2014，（11）：69.

[2]陳燦， 陳海霞. 白芨繁殖研究進展[J]. 湖南農(nóng)業(yè)科學， 2015，（5）：135-137.

[3]王建波. ISSR分子標記及其在植物遺傳學研究中的應用[J]. 遺傳， 2002， 24（5）：613-616.

[4]余艷， 陳海山， 葛學軍. 簡單重復序列區(qū)間（ISSR）引物反應條件優(yōu)化與篩選[J]. 熱帶亞熱帶植物學報， 2003， 11（1）：15-19.

[5]陶阿麗， 金耀東， 劉金旗，等. 中藥白芨化學成分、藥理作用及臨床應用研究進展[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學， 2013，（11）：6-9.

[6]和志嬌， 呂麗芬， 楊麗云，等. 白芨種質(zhì)資源遺傳多樣性的ISSR分析[J]. 西南農(nóng)業(yè)學報， 2008， 21（4）：1081-1085.

[7]郭峰. 分子生物學技術及與其他學科的關系[J]. 河南科技， 2011，（4）：9.

[8]劉亭， 金露， 蘭波，等. 白芨ISSR-PCR反應體系的建立及優(yōu)化[J]. 貴陽醫(yī)學院學報， 2014， 39（4）：455-458.

（編輯：陶希睿）