基于16S/18S rRNA基因文庫技術研究釀醋大曲固態發酵過程中微生物群落結構演變

劉雄，甘興，羅立新

（華南理工大學，生物科學與工程學院，廣東廣州510006）

基于16S/18S rRNA基因文庫技術研究釀醋大曲固態發酵過程中微生物群落結構演變

劉雄，甘興，羅立新

（華南理工大學，生物科學與工程學院，廣東廣州510006）

針對釀醋大曲發酵過程中不同階段樣品，以16S/18S rRNA基因為目的片段，采用16S/18S rRNA克隆文庫法分析大曲中細菌、真菌微生物群落的組成，并通過豐度和多樣性分析剖析發酵過程中微生物群落的演變。整個固態發酵過程中，細菌類共檢測到4個目14個屬，真菌類共檢測到3個目11個屬。大曲固態發酵過程中微生物群落結構呈現明顯動態變化。其中，片球菌（Pediococcus），乳桿菌（Lactobacillus），明串珠菌（Leuconostoc）以及畢赤酵母（Pichia）為固態發酵前期優勢菌；泛菌屬（Pantoea），腸桿菌屬（Enterobacter），阪崎腸桿菌（Cronobacter）以及淀粉霉（Amylomyces），根霉（Rhizopus）為固態發酵中后期優勢菌；而芽孢桿菌（Bacillus）以及Rasamsonia，曲霉菌（Eurotium）為固態發酵后期優勢菌。PCA分析表明，釀醋大曲固態發酵過程中不同階段的微生物種群多樣性不一，發酵1 d、3 d，發酵7 d、13 d，發酵19 d、25 d、30 d各分為一類。研究大曲制作過程中菌群結構演變，對提高食醋品質具有重大意義。

釀醋大曲；克隆文庫；微生物群落；固態發酵；動態演變

大曲中的微生物組成主要分為細菌、酵母菌、霉菌3種，其群落組成對后續的釀造生產起著關鍵作用且各自扮演著不同角色。在釀造中，細菌主要產生蛋白酶、淀粉酶及多種有機酸[2]；酵母菌主要合成一系列的酯類、酸類、醇類、醛類等風味物質[3]；霉菌則是主要的糖化微生物群，并且還形成部分酯類和其他物質來改善風味[4]。

目前對大曲的研究主要集中在釀酒大曲，而對醋用大曲微生物多樣性研究較少。本研究采用16S/18S rRNA基因克隆文庫法對釀醋大曲微生物菌群進行種類和豐度的分析，該方法被廣泛應用于各種環境樣品或食品中的微生物生態分析，且不需要微生物的純培養，能更全面地揭示各種生態環境樣品中的微生物多樣性[5]。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

根據陜西某食醋廠大曲固態發酵過程中傳統的成熟階段，分別取發酵1 d（室溫）、3 d(35～38℃)、7 d(40～50℃)、13 d(53～60℃)、19 d(35～40℃)、25 d(28～34℃)和30 d(室溫)的大曲樣品。粉粹后保存至-20℃下，用于后續分析。

1.2 樣品基因組提取

樣品預處理如下：取0.5 g大曲樣品，置于2m L離心管中，再加入1m L PBS緩沖液，浸泡30m in，12000 r/m in離心2m in，棄上清液，收集菌體。之后采用Omega soil DNA kit提取微生物基因組DNA，詳細提取步驟參見操作說明書。用1%的瓊脂糖凝膠電泳對提取后的基因組DNA進行檢測（98 V,25min），同時采用核酸蛋白測定儀測定樣品基因組DNA的濃度。基因組于-20℃下保存。

1.3 16S/18S rRNA基因克隆文庫構建

(4)技術力量在突破人類中心論中扮演了重要角色。因為技術力量對人類行為及其后果的改變，使得倫理學研究范疇超越了傳統的時間和空間范圍，因此，勢必將打破大部分早期倫理體系中的人類中心論地位。與早期倫理學關注人、人的行為和行為后果不同，技術時代的倫理視域已經擴展開來，并逐漸呈現出一種宏大的、整體的視角。人的倫理學不僅關注人，而且關注人類整體，關注人類處于其中的自然。此外，從一種存在主義的視角看，人類的獨斷的情感和態度，與人類自身生存的未來已經不相符合，對人類自身，尤其是大自然的認識需要調整適應，建立一種突破人類中心論的倫理學勢在必行。

1.3.1 16S/18S rRNA基因擴增與純化

分別采用細菌通用引物27F/1492R，真菌通用引物NS1/FR1[6]擴增16S/18S rRNA基因。擴增的目的基因利用OMEGA膠回收試劑盒進行純化回收。

1.3.2 16S/18SrRNA基因TA克隆

純化后的PCR產物與載體PMD 18-T vector在16℃連接1 h，然后轉化到E.coil DH5α-感受態細胞后培養1.5 h，最后取適量菌液均勻涂布在有氨芐青霉素的LB平板，37℃過夜培養。在平板上隨機挑選菌落為模板，M 13F和M 13R[7]為引物進行菌落PCR，保證每個目的基因陽性克隆不少于80個。

1.3.3 陽性克隆子的RFLP分析

將菌落PCR驗證為陽性克隆子的16S/18S rRNA基因PCR產物分別用內切酶HinfI和MspI(Justéet al. 2014)，HinfI和Hae III[8]進行雙酶切。再用濃度為10%的中性PAGE膠，于150 V電壓下電泳70m in分析酶切產物，最后分析酶切產物的電泳圖譜，分類不同類型的圖譜，并計算每種圖譜出現的頻率，挑選每種圖譜具有代表性的陽性克隆子送往廣州艾基生物有限公司進行測序分析。

1.4 數據分析

序列相似性大于97%視作同一OTU。將每個OTU序列與NCBI數據庫比對并且挑選同源性最高的序列。再選取與OTU序列相近的序列與OTU序列一起通過MEGA6.0軟件中的Neighbor-Joining構建系統發育樹[9]。根據每個樣品中OTU數量和種類的不同，分析微生物的多樣性，并用SPSS17.0軟件進行主成分分析，對大曲制作過程中微生物群落結構的變化進行剖析。

2 結果與分析

2.1 16S/18S rRNA基因克隆文庫

部分陽性克隆子菌落PCR瓊脂糖凝膠檢測圖見1，目的條帶明顯，陽性克隆率較高。對菌落PCR產物雙酶切后用中性PAGE膠檢測，部分分型瓊脂糖凝膠檢測圖見圖2，分型效果較好，易于OTU分類。

圖1 部分陽性克隆子菌落PCR電泳圖

圖2 部分RFLP中性PAGE電泳圖

通過對陽性克隆子測序結果和不同OTU數目計數，分析了大曲樣品中微生物種類與豐度。通過聚類分析，16S rRNA基因克隆文庫共發現32個OTU，分屬于14個屬，見圖3。在大曲發酵前期，Pediococcus、Lactobacillus、Leuconostoc為優勢菌屬，隨即在中后期呈下降趨勢，最后相對豐度降低甚至檢測不出。其中，Pediococcus在1 d時豐度為40%，隨著發酵時間的增長，豐度逐漸降低，最后在30 d時，甚至未檢測出。不同于Pediococcus在整個發酵過程中相對豐度呈現出逐漸降低的趨勢，Lactobacillus與Leuconostoc只在第1天和第3天檢測到。Lactobacillus豐度從第1天的37%降低至第3天的33%，隨后至發酵結束并未檢測出。Leuconostoc豐度從第1天的13%明顯降低至第3天的1%，隨后至發酵結束并未檢測出。而在大曲發酵中期，Pantoea、Enterobacter、Cronobacter為主要的優勢菌屬。其中，Pantoea的相對豐度從第3天的12%迅速增長至第7天的61%，Enterobacter的相對豐度從第3天的20%增長至第7天的31%，并分別于第7天達到該屬在整個發酵過程中的最高豐度；Pantoea相對豐度從第7天的61%逐漸降低，在第25天降低至17.5%,隨即在第30天迅速增長至52%，并成為成熟大曲中的主要優勢菌之一。在大曲后期，Bacillus成為優勢菌屬，其相對豐度從第19天的30%明顯增加至第25天的70%，隨后在第30天降低至25%。在第30天時，成熟大曲中檢測的主要細菌屬主要為Pantoea(52%)，Bacillus(25%)，Enterobacter(10%)，Thermoactinomyces sanguinis(7%)。

圖3 16S rRNA基因文庫

圖4 18S rRNA基因文庫

通過18S rRNA基因文庫構建，共發現13個OTU，分屬于11個屬，見圖4。在大曲前期，Pichia anomala為絕對優勢菌屬，在第3天時相對豐度為99%，而其在中后期基本沒有檢測到，只有在第19天時檢測到2%。惠豐立等[10]在分析某中溫大曲酵母群落結構時，共發現Pichia、Saccharomyces、Debaryomyces、Zygosaccharomyces、Endomyces、Candida、Hanseniaspora、Rhodotorula、Issatchenkia等9個已知酵母菌屬。本研究所發現的酵母屬種類相對較少且單一，且在前期占據真菌類的主導地位，與報導的文獻有一定區別。在大曲發酵中期，Amylomyces、Rasamsonia、Rhizopus為優勢菌屬，其中Amylomyces相對豐度在第7天高達95%，Rasamsonia從第7天開始檢測出，相對豐度在第25天達到最高的47%，且在成熟大曲中的顯示依然占有很大比重。Rhizopus只有在發酵過程中的第13天至第30天有檢測到，其豐度一直在10%左右上下浮動，最后在第30天穩定在6%；在大曲發酵后期，Aspergillus有增長趨勢。主要的優勢菌屬為Aspergillus(45%)，Rasamsonia(32%)，Eurotium(12%)，Rhizopus (6%)。

通過對測序結果比對，選出最相近和次相近的序列構建進化樹，見圖5和圖6。其中，16S rRNA基因文庫進化樹(圖5)顯示，細菌類微生物主要可分為4大類：Enterobacteriales,Actinomycetales,Bacillales和Lactobacillales。18S rRNA基因文庫進化樹（圖6）顯示，真菌類微生物主要分為3大類，Eurotiales，Saccharomycetales和Mucorales。

2.2 16S/18S rRNA基因克隆文庫PCA分析

細菌和真菌微生物的多樣性主成分分析見圖7。PCA分析表明，發酵1 d、3 d可聚為一類，發酵7 d、13 d可聚為一類，而19 d、25 d、30 d可聚為一類。微生物多樣性的聚類與大曲整個制作過程的溫度變化保持一定的相關性，在傳統大曲制作過程中，大曲發酵前7 d溫度持續上升，發酵7 d以后進入大火階段，溫度達到峰值；后期溫度逐步下降，證明溫度對大曲微生物多樣性的影響是一個比較重要的因素[11]。

根據16S/18S rRNA基因克隆文庫中每個OTU陽性克隆子的數量，結果見表1。每個大曲樣品的陽性克隆子最少的有159，最高的有206，滿足文庫標準。文庫覆蓋率在92%以上，最高98%。從指數H、J和D可以看出，大曲微生物的多樣性是先升后降又升的趨勢，在大曲發酵前3 d，最高溫度不到40℃，適合絕大多數的微生物生長，所以微生物多樣性增加。發酵3～7 d之間溫度持續升高至55℃，微生物多樣性略有下降。發酵19 d以后，溫度也降到38℃左右，微生物多樣性又開始逐漸增加。

3 討論

大曲微生物群落組成復雜，不同的微生物群落組成使得大曲種類不一。在白酒生產過程中，不同類型的大曲使用的生產目標不一，可見大曲對于產品特色與質量的重要性，本實驗以陜西某醋廠生產使用的大曲為研究對象，基于16S/18S rRNA基因為目的片段，采用微生物指紋圖譜分析技術16S/18S rRNA克隆文庫法分析了大曲中微生物群落的組成，共發現37個細菌菌種，分屬于16個屬，其中，Pediococcus、Lactobacillus、Leuconostoc、Pantoea、Enterobacter、Cronobacter、Bacillus為大曲中的主要的細菌類群。共發現13個真菌菌種，分別屬于11個屬，其中，Amylomyces、Rasamsonia、Rhizopus、Aspergillus、Eurotium、Pichia為大曲中主要的真菌類群。

圖6 18S rRNA基因文庫系統發育樹

圖7 16S/18S rRNA基因克隆文庫PCA分析

目前，國內學者采用多種生態學技術手段研究并闡述了各類大曲中微生物多樣性。陳玲等[12]利用克隆文庫法與高通量測序法得出濃香型大曲優勢細菌群落分別為Bacillus、Lactobacillaceae、Pseudomonas、Streptomyces、Erwinia和unclassified Enterobacteriaceae；湯斌等[13]通過構建16S rDNA克隆文庫，得出大曲中細菌微生物主要為Lactobacillaceae和Bacillus；羅惠波等[14]利用可培養真菌的分離鑒定方法得出大曲中Aspergillus、Monascus、 Rhizomucor、Lichtheimia、Saccharomycescerevisiae、Wickerhamomycesanomala、Sporidioboluspararoseus為主要優勢真菌類群；王海燕等[15]通過PCR-DGGE技術比較了不同香型大曲中的細菌、酵母及霉菌組成差異，結果表明，大曲內酵母優勢類群為Saccharomycopsisfibuligera和Pichiaanomala，還存在其他非酵母菌科的酵母如Hanseniaspora guilliermondii、Debaryomyceshansenii、Issatchenkiaorientalis、Trichosporonasahii等。

從以上研究報道與本次克隆文庫實驗檢測的優勢菌落結果可以得出Lactobacillaceae、Bacillus、Rhizopus、Aspergillus、Pichia為大曲比較常見的優勢群落。Bacillus可產生吡嗪、芳香族類、有機酸類物質，它們可能對白酒的風味產生重要作用[16]。乳酸作為食醋中含量僅次于醋酸的一種有機酸，其不僅是食醋中不揮發酸的重要組成成分，也是食醋的重要呈味物質[17]，乳酸菌能利用碳水化合物在發酵過程中產生乳酸[18]，所以Lactobacillaceae對食醋的風味貢獻突出；霉菌是我國傳統發酵食品的菌種，Rhizopus能產生豐富的葡萄糖淀粉酶，因而可能將原料中的淀粉直接降解為酵母菌可利用的還原糖，進而刺激酵母菌的生長，同時，促進原料中的碳源向發酵終產物酒精的代謝流[19]，Aspergillus產生糖化酶、淀粉酶，Pichia產酒精與乳酸菌聯合作用生成酯類物質等豐味物質[20]。本次對微生物群落的研究中，除了檢測到其他大曲研究中檢測到的常見功能種群外，整個微生物群落組成和演變與其他大曲研究不同，造成這種區別的原因可能是本實驗研究的大曲為制醋大曲，而非制酒大曲。

本研究中，乳酸菌Pediococcus、Lactobacillus、Leuconostoc及酵母菌Pichia為固態發酵前期優勢菌；細菌Pantoea、Enterobacter、Cronobacter及真菌Amylomyces、Rhizopus為固態發酵中后期優勢菌；而細菌Bacillus及真菌Rasamsonia，Eurotium為固態發酵后期優勢菌。其演變規律與汾酒大曲微生物群落結構演變規律相類似[21]。Bacillus為大曲發酵后期的絕對優勢菌種與江東材[22]的研究中芽孢桿菌在片高溫大曲發酵過程的演變相似。而大曲固態發酵過程中，發酵溫度被認為是影響大曲微生物群落結構動態演變的重要因素[23]。下一步，將集中研究大曲固態發酵過程中微生物群落結構與環境因子間內在聯系，以期對環境因子脅迫下食醋大曲固態發酵過程微生物演變規律有一個更全面的認識。

表1 16S/18S rRNA基因克隆文庫多樣性指數分析

[1]LIP,LIS,CHENG L,et al.Analyzing the relation between the microbial diversity of Daqu and the turbidity spoilage of traditional Chinese vinegar[J].Applied microbiology and biotechnology,2014,98(13)：6073-6084.

[2]雷振河.汾酒發酵主要有機酸成分分析與產酸細菌的鑒定[J].釀酒,2011,38(4)：24-28.

[3]WUQ,XU Y,CHEN L.Diversity of yeast species during fermentative process contributing to Chinese Maotai-flavour liquor making[J].Letters in applied microbiology,2012,55(4)：301-307.

[4]楊躍寰,葉光斌,邊名鴻,等.瀘曲中兩株高產糖化酶菌的分離鑒定與初步應用[J].釀酒科技,2013(10)：65-68.

[5]OLINE D K.Phylogenetic comparisons of bacterial communities from serpentine and nonserpentine soils[J]. Applied and environmental microbiology,2006,72(11)：6965-6971.

[6]VAINIO E J,HANTULA J.Direct analysis of wood-inhabiting fungi using denaturing gradient gel electrophoresis of amplified ribosomal DNA[J].Mycological research,2000,104 (08)：927-936.

[7]STUBNER S.Enumeration of 16S rDNA of Desulfotomaculum lineage1 in rice field soil by real-time PCR with SybrGreen?detection[J].Journal of microbiological methods,2002,50(2)：155-164.

[8]KIM TW,LEE JH,KIM SE,et al.Analysis of microbial communities in doenjang,a Korean fermented soybean paste, using nested PCR-denaturing gradient gel electrophoresis[J]. International journal of food microbiology,2009,131(2/3)：265-271.

[9]LIANG B,WANG LY,MBADINGA SM,et al. Anaerolineaceae and Methanosaeta turned to be the dominant microorganisms in alkanes-dependent methanogenic culture after long-term of incubation[J].AMB Express,2015,5：37.

[10]惠豐立,柯濤,褚學英,等.大曲中酵母菌種群結構及多樣性分析[J].食品與生物技術學報,2009,28(1)：102-106.

[11]WANG H Y,XU Y.Effect of temperature on microbial composition of starter culture for Chinese light aroma style liquor fermentation[J].Lett appl microbiol,2015,60(1)：85-91.

[12]陳玲,袁玉菊,曾麗云,等.16S rDNA克隆文庫法與高通量測序法在濃香型大曲微生物群落結構分析中的對比研究[J].釀酒科技,2015(12)：33-36.

[13]湯斌,劉金英,周慶武,等.免培養技術對濃香型白酒大曲中細菌多樣性的影響[J].食品與發酵工業,2011,37(9)：36-40.

[14]羅惠波,楊曉東,楊躍寰,等.濃香型大曲中可培養真菌的分離鑒定與系統發育學分析[J].現代食品科技,2013(9)：2047-2052.

[15]WANG HY,GAO Y B,FAN Q W,et al.Characterization and comparison of microbial community of different typical Chinese liquor Daqus by PCR-DGGE[J].Lett appl microbiol, 2011,53(2)：134-140.

[16]YAN Z,ZHENG XW,HAN B Z,et al.Monitoring the ecology of Bacillus during Daqu incubation,a fermentation starter,using culture-dependent and culture-independent methods[J].J microbiol biotechnol,2013,23：614-622.

[17]蔣忠,馮文利,王偉,等.乳酸菌和酵母菌共酵改善食醋品質的研究[J].中國釀造,2015,34(9)：104-108.

[18]侯小歌,杜小波,李學思,等.中溫大曲中乳酸菌的分離鑒定及產酸特性[J].釀酒科技,2010(9)：17-20.

[19]喬曉梅,趙景龍,杜小威,等.高通量測序法對清香大曲真菌群落結構的分析[J].釀酒科技,2015(4)：28-31.

[20]ZHENG XW,YAN Z,HAN B Z,et al.Complex microbiota of a Chinese"Fen"liquor fermentation starter(Fen-Daqu), revealed by culture-dependent and culture-independent methods[J].Food microbiol,2012,31(2)：293-300.

[21]ZHENG X W,YAN Z,NOUT M R,et al.Microbiota dynamics related to environmental conditions during the fermentative production of Fen-Daqu,a Chinese industrial fermentation starter[J].Int j food microbiol,2014,182：57-62.

[22]江東材,周瑞平,陳云宗,等.偏高溫大曲發酵過程中芽孢桿菌的演替[J].釀酒科技,2012(9)：62-65.

[23]WANG HY,XU Y.Effect of temperature on microbial composition of starter culture for Chinese light aroma style liquor fermentation[J].Lett appl microbiol,2015,60(1)：85-91.

Analysis of Dynamic Change in Microbial Groups during Solid-State Fermentation of Daqu for Vinegar Brewing on the Basis of 16S/18S rRNA Clone Library

LIU Xiong,GAN Xing and LUO Lixin
(College of Bioscience and Engineering,South China University of Technology,Guangzhou,Guangdong 510006,China)

In this study,16S/18S rRNA clone library was used to analyze microbial groups and fungi groups in Daqu for vinegar brewing in different fermenting stage,and the dynamic change in microbial groups in abundance and diversity was further analyzed.A total of 14 bacterial genera within 4 orders and 11 fungal genera within 3 orders were detected during solid-state fermentation of Daqu.A succession of microbial assemblages was observed during the fermentation of Daqu.Bacterial genera of Pediococcus,Lactobacillus,Leuconostoc and yeast of Pichia were dominant bacteria in prior fermentation period.Bacterial genera of Pantoea,Enterobacter,Cronobacter and fungal genera of Amylomyces, Rhizopus were considerably accelerated during medium fermentation stage and were dominant bacteria until the end of the fermentation.However,bacterial genus of Bacillus and fungal genera of Rasamsonia,Eurotium were prevailing bacteria in late fermentation stage.In addition, PCA analysis indicated that microbial groups diversity varied in different fermenting stages(1 d and 3 d of the fermentation different from 7 d and 13 d of the fermentation,and 19 d,25 d,and 30 d of the fermentation).These exploratory findings were of great significance in improving the quality of edible vinegar.

Daqu for vinegar brewing;clone library;microbial community;solid-state fermentation;dynamic evolution

TQ925.7；Q93-3；TS264.22

A

1001-9286（2017）01-0042-06

10.13746/j.njkj.2016331

2016-11-09

劉雄(1991-)，男，碩士研究生，研究方向為食品微生物發酵。

羅立新，教授，博士生導師，研究方向：工業微生物學，發酵工程，微生物分子生態學。

優先數字出版時間：2016-11-25；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20161125.1423.011.html。