中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所OIE豬瘟參考實驗室豬瘟研究進展

王 琴，趙啟祖，徐 璐，張乾義，鄒興啟，朱元源，寧宜寶，李 翠，范學(xué)政

（中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，OIE豬瘟參考實驗室，北京 100081）

研究進展

中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所OIE豬瘟參考實驗室豬瘟研究進展

王 琴，趙啟祖，徐 璐，張乾義，鄒興啟，朱元源，寧宜寶，李 翠，范學(xué)政

（中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，OIE豬瘟參考實驗室，北京 100081）

中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所國家豬瘟參考實驗室是由農(nóng)業(yè)部2002年公布的第一批國家參考實驗室，2017年6月1日，世界動物衛(wèi)生組織（OIE）確認中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所豬瘟實驗室成為新的OIE豬瘟參考實驗室，該實驗室是國內(nèi)最早開展豬瘟（Classical Swine Fever，CSF）研究的權(quán)威實驗室之一。按照國家重大動物疫病防控的需求以及OIE 參考實驗室職能的要求，該實驗室近年來承擔(dān)了近22項國家和省部級的研究課題，研究經(jīng)費達2 000萬元。開展了我國豬瘟病毒（Classical Swine Fever Virus，CSF V）的分子流行病學(xué)研究、豬瘟流行病學(xué)監(jiān)測和信息系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫建設(shè)、豬瘟新型診斷試劑的研發(fā)、豬瘟標(biāo)準品和參照品的制備和標(biāo)定、豬瘟新型疫苗的研發(fā)、相關(guān)基礎(chǔ)研究和豬瘟綜合防控和凈化技術(shù)研究，取得了重要的進展。簡要總結(jié)如下：

1 我國豬瘟流行病學(xué)及數(shù)據(jù)庫研究

豬瘟病毒分子流行病學(xué)研究的科學(xué)意義，在于實時跟蹤CSFV的變異特征及抗原性變異程度，監(jiān)測新的CSFV流行毒株的情況和疫苗對流行毒株的有效性。通過分析我國自1979年到2016獲得和收集的868條E2基因主要抗原區(qū)域序列（190 bp）(含中國臺灣地區(qū)的49條)，中國流行的CSFV分屬為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ三個基因型，1.1、2.1、2.2、2.3 和3.4五個基因亞型。經(jīng)分析中國大陸的819條E2基因序列，74.24%屬于基因Ⅱ型，其中2.1亞型為499條，占60.93%；1.1亞型為211條，占25.76%；其他為少量的2.2和2.3亞型分別為93條（11.36%）和16條（1.95%）；中國臺灣地區(qū)存在基因Ⅲ型。全國各省市自治區(qū)均存在基因Ⅱ型，表明基因Ⅱ型在中國CSF流行中占絕對優(yōu)勢，屬優(yōu)勢基因型。序列比對分析研究還發(fā)現(xiàn)中國CSFV流行株基因組在37 年間處于穩(wěn)定狀態(tài)。監(jiān)測結(jié)果還表明，到目前為止，中國大陸一直沒有監(jiān)測到基因Ⅲ型的傳入與流行，但周邊國家及中國臺灣地區(qū)存在其他亞型毒株，如韓國存在3.2亞型、泰國存在3.3亞型、中國臺灣和日本存在3.4亞型毒株。因此，要警惕周邊國家及地區(qū)的新亞型流行毒株傳入我國大陸。

我們采用上述CSFV流行病學(xué)數(shù)據(jù)，與數(shù)據(jù)庫、GIS（地理信息系統(tǒng)）、生物信息學(xué)技術(shù)相結(jié)合，創(chuàng)建了我國第一個豬瘟流行病學(xué)信息系統(tǒng)（CSFinfo），包含1 000株中國流行毒株、868條CSFV E2基因序列和其他序列，成為全球繼德國之后第二個擁有這種數(shù)據(jù)庫的國家。對CSFV流行病學(xué)監(jiān)測提供了重要技術(shù)平臺，為政府提供可靠的疫情資料。

2 豬瘟診斷技術(shù)

準確、特異和快速的實驗室診斷技術(shù)是豬瘟防控的重要手段，病原學(xué)檢測技術(shù)方面，我國OIE豬瘟參考實驗室采用自主研發(fā)的CSFV E2單克隆抗體優(yōu)化和完善了CSFV分離培養(yǎng)技術(shù)、熒光抗體檢測技術(shù)、免疫過氧化物酶檢測技術(shù)和體外病毒中和試驗；研制了CSFV通用熒光RT-PCR診斷試劑盒、CSFV MGB鑒別熒光RTPCR診斷試劑盒和CSFV套式RT-nPCR 診斷試劑盒3種CSFV核酸診斷試劑盒，用于CSF疫情監(jiān)測、強弱毒鑒別診斷、分子流行病學(xué)調(diào)查；研制了豬瘟兔化弱毒疫苗和牛病毒性腹瀉病毒檢測試劑盒，用于疫苗中間產(chǎn)品效力檢驗的動物實驗替代方法及原材料中牛病毒性腹瀉病毒的檢測，為疫苗質(zhì)量安全提供技術(shù)保障；還研發(fā)了CSFV QuantiGene ViewRNA原位雜交檢測方法，可用于CSFV RNA在易感細胞中的復(fù)制規(guī)律進行研究和臨床診斷。所有病毒核酸診斷試劑盒的敏感性均高于商品化的國外ELISA抗原檢測試劑盒，特異性好。只要根據(jù)CSF的臨床特征，合理地采用適當(dāng)?shù)姆椒ǎ耆梢酝ㄟ^實驗室診斷達到確診CSF的目的。

在我國，通過抗體水平的監(jiān)測來制定合理、有效的免疫程序是提高群體免疫水平的保證，也是評價疫苗免疫效果的重要技術(shù)手段。OIE豬瘟參考實驗室采用桿狀病毒表達的CSFV E2蛋白原創(chuàng)性研發(fā)的CSFV間接ELISA抗體檢測試劑盒，較國外產(chǎn)品具有更高的敏感性、適用性和實用性，解決了長期使用國外同類產(chǎn)品費用高昂的困境，更合適中國目前全面普免的抗體普查，是我國第一個獲得新獸藥證書的豬瘟抗體檢測ELISA制品；采用E2蛋白和自制的CSFV E2單克隆抗體原創(chuàng)性地研發(fā)了CSFV阻斷ELISA抗體檢測試劑盒，解決了CSFV間接ELISA抗體檢測試劑盒特異性較差的問題，同時敏感性高于同類產(chǎn)品；隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，將靈敏的化學(xué)發(fā)光分析技術(shù)結(jié)合競爭ELISA原理，建立了豬瘟病毒化學(xué)發(fā)光抗體檢測試劑盒，進一步提升了豬瘟病毒ELISA技術(shù)的敏感性和特異性。采用上述E2單抗完善了OIE推薦的方法：豬瘟病毒熒光抗體病毒中和試驗（Neutralization-immunofluorescence，NIF）和豬瘟病毒過氧化物酶聯(lián)中和 試 驗（Neutralization peroxidaselinked antibody，NPLA）。

目前，我國OIE豬瘟參考實驗室不但建立、完善、使用并推廣OIE手冊確認的豬瘟診斷技術(shù)，還自主研發(fā)了一系列的豬瘟新型診斷技術(shù)。建立了病毒標(biāo)準庫、血清標(biāo)準庫和單抗標(biāo)準品庫，發(fā)布了2項國家標(biāo)準，并制定了系統(tǒng)的實驗室診斷標(biāo)準操作程序（SOP）。2009年至2016年，我實驗室6次參加了OIE/歐盟CSF參考實驗室（EUCSFRL）組織的來自42個國家50個實驗室的CSF診斷能力比對試驗（ILCT），達到歐盟標(biāo)準。實驗室已具備OIE要求的診斷能力，人員技術(shù)水平和操作技能也達到OIE要求。部分診斷方法被推薦為2011-2017年國家豬瘟免疫和監(jiān)測方案使用方法。

至此，我實驗室在CSF診斷、疫情監(jiān)測、分子流行病學(xué)分析等所需的檢測方法已經(jīng)系統(tǒng)建立，突破了我國豬瘟診斷試劑長期依賴進口的狀態(tài)，標(biāo)志著我國的豬瘟診斷技術(shù)達到國際先進水平，提升了中國CSF診斷技術(shù)在國際上的認可，為其防控和凈化掃清了障礙。

3 其他研究進展

近年來我實驗室成功研發(fā)出了豬瘟傳代細胞疫苗，通過對C-株疫苗再評價研究，分子流行病學(xué)研究結(jié)合動物免疫保護實驗證實了現(xiàn)用C-株疫苗對我國流行毒株（Ⅰ和Ⅱ型）能實施有效保護，來自英國APHA的數(shù)據(jù)顯示C-株疫苗對基因Ⅲ型也能提供完全保護，為我國繼續(xù)使用豬瘟兔化弱毒疫苗進行全面免疫提供了重要科學(xué)依據(jù)，為堅持我國政府制定的100%強制免疫策略奠定了科學(xué)理論基礎(chǔ)，否定了多年來提出的“由野毒株變異引起免疫失敗”的學(xué)術(shù)爭端。正在開展DIVA疫苗和E2亞單位疫苗等新型疫苗的研究。

還在豬瘟慢性感染與免疫機制、豬瘟病毒和RNA在感染豬體內(nèi)的分布和C-株減毒分子機制等基礎(chǔ)研究方面取得了重要的進展。闡明了感染與免疫的分子機制，發(fā)現(xiàn)了豬瘟病毒致弱的區(qū)域。

根據(jù)中國豬瘟流行特點，在國家“十一五”科技支撐計劃的支持下，對我國部分示范養(yǎng)豬場CSF凈化的成功先例表明，在我國目前豬病流行狀態(tài)下，在規(guī)?；i場和部分區(qū)域開展CSF的凈化并逐步對其根除是完全可行的。構(gòu)建了符合我國國情規(guī)模化豬場的CSF凈化模式，制定了系列《規(guī)?；i場豬瘟凈化技術(shù)指南》、《集約化、規(guī)模化豬場生物安全體系的實施方案》方案和指南，取得重要創(chuàng)新性成果，為規(guī)?；i場豬瘟凈化提供了技術(shù)措施。

2017-11-02）