雷帕霉素減輕氧糖剝奪對SH-SY5Y細(xì)胞的損傷*

盧 娜， 魏林郁， 王寶英， 李 璐， 楊坤麗， 李東亮

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與神經(jīng)生物學(xué)教研室，河南 新鄉(xiāng) 453003)

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雷帕霉素減輕氧糖剝奪對SH-SY5Y細(xì)胞的損傷*

盧 娜△， 魏林郁， 王寶英， 李 璐， 楊坤麗， 李東亮

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與神經(jīng)生物學(xué)教研室，河南 新鄉(xiāng) 453003)

目的： 觀察雷帕霉素(Rapa)對氧糖剝奪(OGD)的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞的影響，并探討自噬在其中的作用。方法: SH-SY5Y細(xì)胞隨機分為4組: 正常對照組(常規(guī)培養(yǎng)，不進(jìn)行OGD處理)、Rapa組、OGD組(無糖培養(yǎng)基、1% O2的三氣培養(yǎng)箱內(nèi)孵育細(xì)胞12 h)和Rapa+OGD組。進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察;MTT法檢測細(xì)胞活力；乳酸脫氫酶(LDH)漏出率判斷細(xì)胞損傷的程度；caspase-3 活性檢測試劑盒檢測酶活性；原位末端標(biāo)記(TUNEL)法檢測凋亡水平；Western blot法檢測凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2、自噬標(biāo)志蛋白LC3B-Ⅱ及自噬調(diào)控蛋白beclin-1的表達(dá)。結(jié)果: 與OGD組相比，Rapa+OGD組的細(xì)胞存活率明顯升高(P<0.05)，LDH 漏出率及caspase-3酶活性明顯降低(P<0.05)。TUNEL染色觀察結(jié)果顯示，與OGD組相比，Rapa+OGD組的細(xì)胞凋亡明顯減少(P<0.05)；Western blot實驗結(jié)果顯示Rapa+OGD組的Bcl-2、beclin-1及LC3B-Ⅱ蛋白的表達(dá)水平顯著高于OGD組(P<0.05)，而Bax蛋白水平明顯低于OGD 組(P<0.05)。 結(jié)論: Rapa對OGD 損傷的SH-SY5Y細(xì)胞具有保護作用，其機制可能與上調(diào)beclin-1蛋白、激活自噬有關(guān)。

雷帕霉素； SH-SY5Y細(xì)胞； 氧糖剝奪； 自噬

神經(jīng)細(xì)胞的氧糖剝奪(oxygen-glucose deprivation，OGD)模型近年來多被用于在細(xì)胞水平模擬臨床腦卒中過程，并主要以氧糖剝奪后快速恢復(fù)氧糖供應(yīng)，從而模擬腦缺血再灌注損傷進(jìn)行細(xì)胞自主修復(fù)及藥物研究[1]。雷帕霉素(rapamycin，Rapa)不僅是一種免疫抑制劑，同時也是一種自噬反應(yīng)增強劑[2]。近年來，來自人類和動物模型的大量研究均顯示，細(xì)胞自噬與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的進(jìn)展及預(yù)后密切相關(guān)[3-5]。本研究擬以SH-SY5Y細(xì)胞為對象，通過建立氧糖剝奪模型來模擬卒中的局部腦梗死過程，并進(jìn)一步研究Rapa對于SH-SY5Y 細(xì)胞損傷的影響，對進(jìn)一步探討自噬對缺血缺氧過程中神經(jīng)元的保護機制, 探索新的治療靶點具有重要意義。

材 料 和 方 法

1 材料及主要儀器

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞株由上海中科院典型細(xì)胞培養(yǎng)庫提供；DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清購于HyClone；MTT細(xì)胞活力及細(xì)胞毒性檢測試劑盒、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)檢測試劑盒、caspase-3活性檢測試劑盒和一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)公司；鼠抗Bcl-2和Bax單克隆抗體及兔抗beclin-1、LC3B-Ⅱ多克隆抗體購自Abcam；蛋白Marker購自碧云天生物技術(shù)公司；Rapa購自Gene Operation。三氣培養(yǎng)箱購自Thermo Scientific；IX71熒光顯微鏡購自O(shè)lympus。

2 方法

2.1 SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)及分組 細(xì)胞置于含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的DMEM中，在37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)為5% CO2的飽和水汽培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔48 h換培養(yǎng)液，當(dāng)單層細(xì)胞融合后，行傳代處理。傳代后隨機分為對照(control)組、Rapa組、OGD組和Rapa+OGD組。每次每組設(shè)6 個平行復(fù)孔，實驗重復(fù)3 次。

2.2 SH-SY5Y細(xì)胞OGD模型的建立 OGD模型制備參照文獻(xiàn)[1, 6-8]并進(jìn)行改良。選用生長良好的SH-SY5Y細(xì)胞，置換成無糖無血清培養(yǎng)基孵育，放入37 ℃三氣培養(yǎng)箱(1% O2、5% CO2和94% N2)中培養(yǎng)3 h、6 h、9 h、12 h和24 h，以選擇最佳作用時間。

2.3 Rapa工作液的配置 取5 mg Rapa粉末，置于滅菌EP管中，加入100 μL無水乙醇充分溶解，加至100 mL DMEM完全培養(yǎng)基，充分混勻，即為50 mg/L Rapa工作液。

2.4 形態(tài)學(xué)觀察 SH-SY5Y細(xì)胞分別進(jìn)行不同處理后，置于Olympus CKX41倒置相差顯微鏡上觀察各組細(xì)胞形態(tài)特征，隨機選擇視野拍照。

2.5 MTT比色法檢測細(xì)胞存活率 將細(xì)胞以5×107/L密度接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL，24 h后處理細(xì)胞。作用完畢后每孔加入MTT(5.0 g/L)10 μL、置入培養(yǎng)箱孵育4 h后，每孔再加入100 μL Formanzan溶解液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)再繼續(xù)孵育4 h。采用酶聯(lián)免疫檢測儀在570 nm測定各孔吸光度(absorbance，A)，評價細(xì)胞存活率。SH-SY5Y存活率(%)=實驗組A值/對照組A值×100%。本實驗對照組的細(xì)胞存活率定為100.0%。

2.6 LDH釋放檢測 根據(jù)細(xì)胞的大小和生長速度將適量細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)孔板中，細(xì)胞密度約70%～80%。處理完畢后，將細(xì)胞培養(yǎng)板用多孔板離心機400×g離心5 min。取上清120 μL，移入新的96孔板相應(yīng)孔中，各孔再加入60 μL LDH檢測工作液，混勻，室溫(約25℃)避光孵育30 min(用鋁箔包裹后置于水平搖床或側(cè)擺搖床上緩慢搖動)。然后在490 nm處測定吸光度。選用600 nm作為參考波長進(jìn)行雙波長測定。LDH活力=(處理樣品吸光度-背景空白對照孔吸光度)/(標(biāo)準(zhǔn)管吸光度-標(biāo)準(zhǔn)空白管吸光度)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度。

2.7 Caspase-3活性檢測試劑盒檢測caspase-3酶活性 冰浴裂解細(xì)胞15 min，4 ℃、20 000×g離心10 min，將上清轉(zhuǎn)移到96孔板中。配置反應(yīng)體系，再加入Ac-DEVD-pNA反應(yīng)底物后混勻，37 ℃孵育60 min，測定A405。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對比計算出樣品中催化產(chǎn)生多少量的黃色的對硝基苯胺(p-nitroaniline, pNA)，反映caspase-3的活性。

2.8 一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒檢測細(xì)胞凋亡 取生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細(xì)胞，以2×105/L、每孔500 μL細(xì)胞懸液接種于24孔板內(nèi)的載玻片上。培養(yǎng)24 h后，分組處理細(xì)胞；棄培養(yǎng)液、PBS洗滌1次、4%多聚甲醛固定1 h、0.1% Triton X-100冰浴孵育5 min、在樣品上加50 μL TUNEL檢測液，37 ℃避光孵育60 min，封片后立即在熒光顯微鏡下觀察。在100倍鏡下，隨機取5個視野，計數(shù)呈現(xiàn)綠色熒光的凋亡細(xì)胞，取平均值，計算細(xì)胞凋亡率(%)=凋亡細(xì)胞數(shù)/視野下細(xì)胞總數(shù)×100%。實驗重復(fù)3 次。

2.9 Western blot法檢測蛋白表達(dá) 收獲細(xì)胞，4 ℃預(yù)冷的PBS洗1次，加入適量的細(xì)胞裂解液，用細(xì)胞刮子刮下細(xì)胞，低溫離心機12 000 ×g離心10 min，取上清液，棄沉淀。用BCA法測定各組蛋白含量，每孔上樣25 μL蛋白，經(jīng)15% SDS-PAGE 80 V電泳2 h后，300 mA恒流轉(zhuǎn)膜40 min，5% 脫脂牛奶常溫下封閉1 h后，在 4 ℃ 孵育Ⅰ抗(鼠抗人Bcl-2及Bax稀釋比例為1∶2 000,兔抗人beclin-1及LC3B-II稀釋比例為1∶3 000)；5%脫脂牛奶常溫下封閉Ⅱ抗(羊抗兔辣根過氧化物酶IgG 和羊抗小鼠辣根過氧化物酶IgG 稀釋比例為 1∶5 000，5% 脫脂牛奶配制)，ECL 顯影顯示目的條帶和內(nèi)參照，用ImageJ軟件分析吸光度值，代表蛋白表達(dá)的相對水平。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 不同OGD處理時間對SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響

MTT法檢測結(jié)果以O(shè)GD處理0 h組細(xì)胞存活率為100.0%，則OGD處理3 h、6 h、9 h、12 h和24 h組存活率分別為96.2%、84.8%、74.5%、52.3%和26.8%；與0 h組比較,6 h、9 h、12 h和24 h組的存活率均顯著降低(P<0.05)，見圖1。后續(xù)實驗采用OGD處理12 h建立模型。

Figure 1.The effect of treatment with OGD for different time periods on the viability of SH-SY5Y cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 h group.

圖1 不同OGD處理時間對SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響

2 不同濃度Rapa處理組SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)的觀察

倒置相差光學(xué)顯微鏡下觀察SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)的變化，正常SH-SY5Y 細(xì)胞大部分呈梭形、三角形，少數(shù)呈多邊形，胞漿飽滿，多數(shù)可見細(xì)胞突起，折光性好，貼壁能力強；Rapa處理后，隨著濃度增加，細(xì)胞貼壁數(shù)量明顯減少，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，體積皺縮，突起減少或消失，折光性減弱，脫壁的細(xì)胞增加，見圖2。

Figure 2.The effect of Rapa at different concentrations on the morphological changes of SH-SY5Y cells (×100).

圖2 不同濃度Rapa對SH-SY5Y 細(xì)胞形態(tài)的影響

3 Rapa作用的最適濃度選擇

MTT法檢測結(jié)果以空白對照組細(xì)胞存活率為100.0%，則50、40、30、20、10和5 mg/L Rapa作用24 h的存活率分別為28.7%、34.2%、40.5%、54.3%、97.1%和98.2%；后2個濃度Rapa組與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性(P>0.05)，見圖3。 后續(xù)實驗選擇10 mg/L為Rapa作用的最適濃度。

4 不同處理因素對SH-SY5Y 細(xì)胞形態(tài)的影響

倒置相差光學(xué)顯微鏡下觀察SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)的變化，可見正常SH-SY5Y 細(xì)胞大部分呈梭形、三角形，少數(shù)呈多邊形，胞漿飽滿，多數(shù)可見細(xì)胞突起，折光性好，貼壁能力強；OGD處理后，細(xì)胞貼壁數(shù)量明顯減少，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，體積皺縮，突起減少或消失，折光性減弱，脫壁的細(xì)胞增加；Rapa+OGD組細(xì)胞的缺氧缺糖損傷明顯減輕，提示自噬激動劑Rapa能減輕 OGD引起的細(xì)胞損傷，見圖4。

Figure 3.Effect of different concentrations of Rapa on the viabi-lity of SH-SY5Y cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖3 不同濃度Rapa對SH-SY5Y 細(xì)胞存活率的影響

5 不同處理因素對SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響

MTT法檢測結(jié)果以空白對照組細(xì)胞存活率為100.0%，則Rapa、OGD和Rapa+OGD組存活率分別為98.6%、53.8%和79.5%；OGD和Rapa+OGD組與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)；OGD組與Rapa+OGD組比較差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)，見表1。

Figure 4.The effect of different treatment factors on the morphological changes of SH-SY5Y cells (×100).

圖4 不同處理因素對SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)的影響

6 不同處理因素對SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH漏出量的影響

LDH釋放是細(xì)胞膜完整性的重要指標(biāo)， LDH活性檢測結(jié)果顯示OGD組和Rapa+OGD組培養(yǎng)上清液中的LDH活性明顯高于正常對照組(P<0.05)；Rapa+OGD 組的LDH活性明顯低于OGD組(P<0.05)，見表1。

表1 Rapa對氧糖剝奪損傷 SH-SY5Y細(xì)胞的存活率和LDH漏出量的影響
Table 1.The effects of Rapa on the viability and leakage of LDH in the SH-SY5Y cells injured by OGD (Mean±SD.n=3)

GroupCellviability(%)LDH(U/L)Control100．0±0．066．2±5．8Rapa98．6±2．370．6±5．5OGD53．8±2．5?803．3±5．4?Rapa+OGD79．5±2．7#708．7±5．6#

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsOGD group.

7 不同處理因素對SH-SY5Y細(xì)胞caspase-3酶活性的影響

Caspase-3活性檢測試劑盒檢測結(jié)果以空白對照組細(xì)胞的caspase-3酶活性為1，則Rapa、OGD和Rapa+OGD組的caspase-3酶活性分別為1.08、3.16和2.63。OGD組和Rapa+OGD組與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)；Rapa+OGD組與OGD組比較差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)，見圖5。

Figure 5.The caspase-3 activity in the SH-SY5Y cells with different treatments. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsOGD group.

圖5 各組細(xì)胞caspase-3酶活性的比較

8 TUNEL法熒光染色檢測細(xì)胞凋亡率

TUNEL 熒光染色可見control組和Rapa組陽性凋亡細(xì)胞數(shù)較少； OGD組和Rapa+OGD組陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多,Rapa+OGD組明顯低于OGD組(P<0.05)，見圖6。

Figure 6.The TUNEL staining and apoptotic rate in the SH-SY5Y cells with different treatments (×200). Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsOGD group.

圖 6 各組細(xì)胞的TUNEL熒光染色及凋亡率比較

9 Western blot法檢測 Bcl-2、Bax、beclin-1和LC3B-Ⅱ蛋白水平的變化

Western blot分析結(jié)果顯示，與正常對照組比較，OGD組和Rapa+OGD組的Bax蛋白表達(dá)量均明顯增加(P<0.05)；而Bcl-2表達(dá)明顯減低(P<0.05)。Rapa+OGD組Bax蛋白表達(dá)明顯低于OGD組(P<0.05)；Rapa+OGD組的Bcl-2蛋白表達(dá)明顯高于OGD組(P<0.05)。與正常對照組比較，Rapa組和Rapa+OGD組的beclin-1和LC3B-Ⅱ蛋白表達(dá)量均明顯增加(P<0.05)；且Rapa+OGD組beclin-1和LC3B-Ⅱ蛋白表達(dá)明顯高于OGD組(P<0.05)，見圖7。

Figure 7.The protein levels of Bcl-2, Bax, beclin-1 and LC3B-Ⅱ in the SH-SY5Y cells with different treatments. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsOGD group.

圖7 各組SH-SY5Y細(xì)胞Bcl-2、Bax、beclin-1及LC3B-Ⅱ蛋白水平的比較

討 論

自噬是指細(xì)胞在自噬相關(guān)基因(autophagy-rela-ted gene，Atg)的調(diào)控下，清除細(xì)胞內(nèi)少量受損的細(xì)胞器(如線粒體等)和生物大分子(如蛋白質(zhì)等)，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境自身穩(wěn)定的一種溶酶體依賴的降解途徑[9]。自噬廣泛存在于真核細(xì)胞中，參與了如神經(jīng)退行性改變、精神分裂、腦損傷等多種疾病的發(fā)病過程[10]。目前，大多數(shù)研究證實自噬具有腦保護作用[11-12]，提示一定程度自噬的增強對維持神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定意義重大。自噬過程包括自噬的誘導(dǎo)；自噬體組裝成形；自噬體的運輸、與溶酶體融合；自噬體的降解。微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3/Atg8)即是自噬體膜上的標(biāo)記蛋白。LC3 蛋白在合成后其C端即被Atg4蛋白酶切割變成 LC3-Ⅰ，LC3-Ⅰ散在分布于細(xì)胞漿內(nèi)。當(dāng)自噬體形成后，LC3-Ⅰ和磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)偶聯(lián)形成 LC3-Ⅱ，并定位于自噬體內(nèi)膜和外膜，而且LC3-Ⅱ始終穩(wěn)定地保留在自噬體膜上直到與溶酶體融合，因此被用來作為自噬體的標(biāo)記，且 LC3-Ⅱ的水平在某種程度上反映了自噬體的數(shù)量[13]。Beclin-1是自噬過程中一個重要的正性調(diào)節(jié)因子。哺乳動物自噬基因beclin-1是酵母apg6/vps30基因的同源物。Beclin-1 對自噬的調(diào)節(jié)不是孤立的，相反，它能與多種分子相互作用，形成不同復(fù)合體而發(fā)揮作用。Beclin-1既可以與Bcl-2、Bcl-xL結(jié)合調(diào)控凋亡，又與PI3KC3形成復(fù)合物在自噬過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，是凋亡與自噬途徑相互交流和協(xié)調(diào)的重要蛋白質(zhì)[14]。

雷帕霉素是一類新型免疫抑制劑，它通過抑制mTOR的蛋白激酶活性發(fā)揮作用。在很多哺乳動物細(xì)胞證實具有自噬誘導(dǎo)效應(yīng)[15]，如人類乳腺癌細(xì)胞、 肺癌細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞等。目前研究發(fā)現(xiàn)，Rapa通過激活自噬系統(tǒng)，減少大鼠脊髓損傷后神經(jīng)元凋亡[16]；Rapa干預(yù)自噬可減輕高糖對系膜細(xì)胞的氧化損傷[17]；Rapa能夠增強自噬,減少足細(xì)胞凋亡[18],提示Rapa可增強自噬,具有細(xì)胞保護作用。本研究擬以SH-SY5Y細(xì)胞為對象，通過建立氧糖剝奪模型來研究Rapa對于SH-SY5Y 細(xì)胞損傷的影響，進(jìn)一步探討自噬在神經(jīng)元缺血缺氧過程中的作用， 探索新的治療靶點。

本研究結(jié)果提示OGD對SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響存在時間依賴性，選取OGD處理12 h為合適細(xì)胞模型；Rapa對SH-SY5Y細(xì)胞存活率存在劑量依賴性，高濃度Rapa明顯降低細(xì)胞存活率，選擇10 mg/L Rapa為最適作用濃度，進(jìn)行后續(xù)實驗；Rapa明顯增加OGD導(dǎo)致的SH-SY5Y細(xì)胞存活率，降低了LDH漏出量，明顯降低OGD導(dǎo)致的SH-SY5Y細(xì)胞caspase-3酶活性的升高，明顯降低了OGD導(dǎo)致的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡率，提示Rapa對神經(jīng)細(xì)胞缺氧缺血具有保護作用，與相關(guān)研究結(jié)果基本相符[19-21]。進(jìn)一步通過Western blot法對凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax及自噬相關(guān)蛋白LC3、beclin-1的表達(dá)進(jìn)行檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Rapa+OGD組Bax蛋白表達(dá)量明顯低于OGD組；而Bcl-2、LC3B-Ⅱ、beclin-1蛋白表達(dá)明顯高于OGD組。提示Rapa提高OGD損傷耐受性的機制可能與上調(diào)beclin-1、維持Bcl-2表達(dá)、抑制Bax表達(dá)從而減少細(xì)胞凋亡有關(guān)。因此, 我們推測Rapa通過上調(diào)beclin-1來誘導(dǎo)細(xì)胞自噬[22]，自噬的激活為細(xì)胞提供營養(yǎng)物質(zhì)，可對抗神經(jīng)元的氧糖剝奪損傷；自噬與凋亡存在負(fù)相關(guān)，對細(xì)胞的存活起一定的保護作用。

自噬是細(xì)胞內(nèi)的一種“自食(Self-eating)”現(xiàn)象，凋亡是“自殺(self-killing)”現(xiàn)象。兩者之間存在復(fù)雜聯(lián)系，在一定條件下自噬是細(xì)胞對應(yīng)激的適應(yīng)性反應(yīng)，可避免發(fā)生死亡；而在其它環(huán)境中，自噬可能是細(xì)胞死亡的替代途徑。 Bcl-2家族成員在細(xì)胞凋亡與自噬過程中發(fā)揮著交叉性作用。Beclin-1有1個 BH3 結(jié)構(gòu)域，Bcl-2、Bcl-xL 等可以通過這個BH3結(jié)構(gòu)域與 beclin-1 結(jié)合而影響其活性。抗凋亡 Bcl-2家族蛋白和 beclin-1的表達(dá)水平、磷酸化、分子的亞細(xì)胞定位以及BH3-only 蛋白等，均可調(diào)節(jié) beclin-1 蛋白和 Bcl-2 家族蛋白結(jié)合水平，進(jìn)而調(diào)控自噬的發(fā)生，并可能對細(xì)胞最終走向自噬還是凋亡起著關(guān)鍵作用[14]。自噬和凋亡有共用相同的刺激因素和調(diào)節(jié)蛋白，但是誘發(fā)閾值和門檻不同，如何轉(zhuǎn)換和協(xié)調(diào)目前還不清楚[23]。自噬在腦損傷中的作用仍需進(jìn)行后續(xù)的探討來加以驗證，為腦缺血的防治開辟新的途徑。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

Rapamycin reduces SH-SY5Y cell damage induced by oxygen-glucose deprivation

LU Na, WEI Lin-yu, WANG Bao-ying, LI Lu, YANG Kun-li, LI Dong-liang

(DepartmentofPhysiologyandNeurobiology,XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang453003,China.E-mail: 13462225817@163.com)

AIM: To observe the effect of rapamycin (Rapa) on human neuroblastoma SH-SY5Y cell injury induced by oxygen-glucose deprivation (OGD), and to explore the role of autophagy in this process. METHODS: The SH-SY5Y cells were randomly divided into 4 groups: normal control group: the cells were cultured without OGD treatment; Rapa group: the cells were pretreated with Rapa for 1 h; OGD group: the culture medium was replaced by glucose-free medium and the cells were transferred to a humidified incubation chamber flushed by a gas mixture of 1% O2, 94% N2and 5% CO2for 12 h; Rapa+OGD group: the cultured cells were treated with Rapa for 1 h, and then were given the same treatments as those in OGD group. The cell viability was assessed by MTT assay. The degree of the cell damage was evaluated by determining the leakage of lactate dehydrogenase (LDH). The enzyme activity of caspase-3 was detected. TUNEL staining were used to detect the variation of cell apoptosis. The protein levels of apoptosis-related proteins Bax and Bcl-2, autophagy-related protein beclin-1 and autophagy marker protein LC3B were determined by Western blot. RESULTS: Compared with OGD group, the viability of the SH-SY5Y cells was significantly increased, and the activity of caspase-3 was significantly reduced in Rapa+OGD group (P<0.05). The SH-SY5Y cell injury was apparent after OGD with a great increase in the apoptotic rate (P<0.05). Compared with OGD group, the apoptotic rate significantly decreased in Rapa+OGD group (P<0.05). Compared with control group, the protein level of Bcl-2 was significantly decreased (P<0.05) and the protein level of Bax was significantly increased in OGD group. Compared with OGD group, the levels of Bcl-2, beclin-1 and LC3B-Ⅱ were significantly increased and the protein level of Bax was significantly increased in Rapa+OGD group (P<0.05). CONCLUSION: Rapamycin has a protective effect oninvitrocultured SH-SY5Y cells injured by OGD. The mechanism may be related to the promotion of autophagy．

Rapamycin; SH-SY5Y cells; Oxygen-glucose deprivation; Autophagy

1000- 4718(2017)01- 0104- 06

2016- 04- 08

2016- 11- 30

河南省教育廳科學(xué)技術(shù)重點研究項目(No. 14A310009；No. 14A310019)

R363.21

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.01.017

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