絞股藍總苷對PCSK9基因表達及辛伐他汀降血脂作用的影響*

吳柳松， 錢民章

(遵義醫學院 1生物化學教研室， 2附屬醫院小兒內二科，貴州 遵義 563004)

?

絞股藍總苷對PCSK9基因表達及辛伐他汀降血脂作用的影響*

吳柳松1,2， 錢民章1△

(遵義醫學院1生物化學教研室，2附屬醫院小兒內二科，貴州 遵義 563004)

目的： 探討絞股藍總苷(gypenosides， GPs)對大鼠肝臟前蛋白轉化酶枯草溶菌素9(PCSK9)基因表達及辛伐他汀的降血脂作用的影響。方法: 采用高脂飼料喂飼建立大鼠高脂血癥模型。60只健康雄性SD大鼠隨機分為正常對照組(control組)、高脂模型組(model組)、辛伐他汀組(simvastatin組)、GPs組和GPs與辛伐他汀聯合用藥組(combined組)。除正常對照組喂食普通飼料外，其余3組大鼠均喂食高脂飼料。將GPs溶于0.3%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液中，用灌胃方式給藥。Control組和model組灌0.3% CMC-Na(1 mL/100 g)，GPs組灌GPs 160 mg·kg-1·d-1，simvastatin組灌辛伐他汀5 mg·kg-1·d-1，combined組灌兩者聯合劑量。實驗8周后，處死大鼠。取腹腔動脈血，測定血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)；稱大鼠體重及肝臟組織濕重，測定肝指數；取肝臟用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，HE染色作常規形態學檢測；另取肝臟提取總RNA，real-time PCR測定PCSK9和低密度脂蛋白受體(LDLR)的mRNA表達；提取肝臟總蛋白，Western blot測定PCSK9和LDLR蛋白的表達。結果: 成功建立高脂血癥大鼠模型。與model組大鼠比較，simvastatin組、GPs組以及combined組TC、TG和LDL-C水平均明顯下降(P<0.05)，各組HDLC水平有不同程度的上升(P<0.05)。與model組大鼠比較，simvastatin組、GPs組以及combined組肝指數均明顯下降(P<0.05)。肝組織病理結果顯示，高脂血癥性大鼠出現脂肪肝病變；simvastatin組、GPs組以及combined組大鼠肝細胞脂肪變性程度有不同程度減輕，尤以combined組效果顯著。與model組比較，simvastatin組PCSK9和LDLR的mRNA表達均明顯升高，GPs組以及combined組PCSK9 的mRNA表達明顯降低(P<0.05)，GPs組LDLR的mRNA表達變化不明顯，combined組LDLR的mRNA表達明顯升高(P<0.05)。與model組比較，simvastatin組PCSK9和LDLR的蛋白表達均明顯升高；GPs組和combined組的PCSK9 蛋白表達明顯降低，LDLR 蛋白表達明顯升高(P<0.05)。結論: GPs能抑制肝臟PCSK9表達，增加LDLR表達量；與辛伐他汀聯用可增強其降血脂和減輕肝臟脂肪病變的效果。

絞股藍總苷； 高脂血癥；PCSK9 基因； 低密度脂蛋白受體； 辛伐他汀

高脂血癥(hyperlipidemia，HL)是指血脂高于正常參考值的上限的現象，是由多種原因導致脂蛋白合成與清除平衡紊亂所致。越來越多的研究發現，一些基因缺陷或表達失衡，使參與脂蛋白合成、轉運和代謝的受體、酶或載脂蛋白異常，導致血脂升高[1]。高脂血癥是引起動脈粥樣硬化、腦中風等心腦血管疾病的重要原因，利用藥物控制血脂水平，可以減少心腦血管疾病的發病率，具有重要的臨床意義[2]。2003年，Seidah等[3]發現一個新基因——前蛋白轉化酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisin/kexin 9，PCSK9)基因，該基因編碼一種前蛋白轉化酶，名為神經細胞凋亡調節轉化酶1(neural apoptosis-regulated convertase 1，NARC-1)，可介導低密度脂蛋白受體(low-density lipoprotein receptor，LDLR)降解，升高血漿中低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)的水平，該基因的各種突變會導致異常膽固醇血癥。他汀類是目前臨床上最常用的降脂藥物，降脂效果得到認可，但也存在部分副作用[4]。新近的研究發現，他汀類藥物在降脂的同時，能增強PCSK9表達，從而增強LDLR降解，使他汀類藥物降脂效果受到抑制[5]。

絞股藍是葫蘆科絞股藍屬的多年生草質藤本植物，其主要藥效成分為絞股藍總苷(gypenosides，GPs)。動物實驗發現，GP及GPs均能明顯降低實驗性高脂大鼠總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、LDL-C、極低密度脂蛋白(very-low-density lipoprotein，VLDL)和過氧化磷脂，同時升高高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)，使高脂血癥得到明顯改善[6-8]。臨床試驗也證實，GPs可顯著降低血脂水平，有調節血脂代謝的作用[9-10]。GPs是否能通過影響PCSK9的表達發揮降脂效應以及與辛伐他汀聯用能否拮抗辛伐他汀對PCSK9的誘導作用而增強其降脂效果，未見報道。為此，本實驗建立了高脂血癥大鼠模型，對上述問題進行了研究。

材 料 和 方 法

1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠60 只，體重(200±20) g，購自第三軍醫大學大坪醫院實驗動物中心，合格證號為SCXK(渝)2012-0005。分籠喂養于室溫下明暗各12 h的動物飼養室內，飲水不限。

2 主要實驗材料

絞股藍總苷(純度98.06%)購自西安賽邦醫藥科技有限公司;辛伐他汀分散片(廣州南新制藥有限公司)；TRIzol(Invitrogen)；PCSK9、LDLR和GAPDH引物(上海生工生物工程公司)；RT-PCR試劑盒(TaKaRa)；兔抗人抗PCSK9和LDLR抗體(Abcam);兔抗人抗β-actin抗體(北京博奧森生物技術有限公司)；辣根過氧化物酶標記山羊 II 抗(北京博奧森生物技術有限公司)；PMSF/RIPA裂解液(碧云天生物技術研究所)；丙烯酰胺(Solarbio)；PVDF膜(Millipore)；Tris(Solarbio)。

3 主要儀器設備

核酸蛋白分析儀(Thermo)；普通PCR儀(Eppendorf)；實時熒光定量PCR儀(CFX96)、酶標儀、凝膠成像系統、垂直電泳-轉膜裝置(Bio-Rad)；超低溫冰箱(海爾公司)；超純水系統(Millipore)；電子天平(Tokyo)；高速冷凍離心機(Eppendorf)。

4 主要方法

4.1 實驗分組及模型建立 大鼠適應性喂養(喂食普通飼料)1周后，隨機分為空白對照組(control組)、高脂模型組(model組)、辛伐他汀組(simvastatin組)、絞股藍總苷組(GPs組)和絞股藍總苷與辛伐他汀聯合用藥組(combined組)5組。Control組以基礎飼料喂養，其余各組均以高脂飼料(配方為：10%豬油、2%膽固醇、5%蔗糖、0.5%膽鹽、0.2%丙硫氧嘧啶和82.3%基礎飼料)喂養。根據人體實驗劑量和成人與大鼠的體重折算系數折算成大鼠用藥量。造模同時灌胃給GPs和辛伐他汀，GPs劑量為每天160 mg/kg，辛伐他汀劑量為每天5 mg/kg，combined組以兩者聯合劑量給藥；control組和model組每天灌服0.3%的CMC-Na，每周稱重1次用以調整灌胃量，連續給藥8周。

4.2 動物處置及標本采集 實驗末次給藥后，禁食12 h，不禁水，稱體重，7%水合氯醛皮下麻醉，腹主動脈采血5 mL。將大鼠處死后，迅速剝取其全部肝臟，用預冷4 ℃的生理鹽水反復沖洗，直到未見淤血，用濾紙吸干，做好標記并稱重、拍照。標本采集完后，所剩動物尸體按有關要求進行處置。

4.3 大鼠血脂的測定 將采集的大鼠血液4 ℃、3 000 r/min離心15 min，分離血清，全自動生化分析儀測定TC、TG、HDL-C和LDL-C。

4.4 大鼠肝指數的測定 按肝指數(%)=肝臟濕重/大鼠體重×100%，計算各組大鼠肝指數。

4.5 大鼠肝臟病理學檢測 取部分肝臟組織4%多聚甲醛固定24 h，梯度乙醇脫水透明后，石蠟包埋，切片經梯度乙醇脫蠟至水合，常規HE染色，顯微鏡下觀察肝臟病理學變化。

4.6 Real-time PCR檢測大鼠肝臟PCSK9和LDLR的mRNA表達 在冰上將肝臟組織用TRIzol試劑勻漿至無明顯組織顆粒，并按TRIzol試劑盒操作要求提取肝臟總RNA，按RT-PCR試劑盒操作進行反轉錄。擴增的cDNA加入至20μL的反應體系中。PCSK9的上游引物序列為5’-GCACTGGAGAACCACACAGG-3’，下游引物序列為 5’-TGGCTGCATGACATTGCTTCTC-3’；LDLR的上游引物序列為5’-CCTCAGCTACCAGCACCTCT-3’，下游引物序列為5’-AGCCATGTCACCTTGGACTT-3’；GAPDH的上游引物序列為5’-GGCATTGCTCTCAATGACAA-3’，下游引物序列為5’-ATGTAGGCCATGAGGTCCAC-3’。逆轉錄條件為：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。Real-time PCR的反應條件為:95 ℃ 3 min；95 ℃ 5 s，59.5 ℃ 30 s，39 個循環。以GAPDH作為內參照，目的基因PCSK9和LDLR的表達根據經real-time PCR儀器檢測的Ct值，通過公式2-ΔΔCt計算相對表達量。

4.7 Western blot法檢測大鼠肝臟PCSK9和LDLR蛋白的表達 在冰上將肝臟組織用細胞裂解液勻漿至無明顯組織顆粒，靜置充分裂解，離心后取上清，用BCA法測定蛋白濃度，蛋白定量120 μg，煮沸5 min，上樣于10% SDS-PAGE膠電泳1.5 h，全濕式電轉將分離膠上的蛋白轉移到PVDF膜上。室溫下用含5%脫脂奶粉封閉1 h。加入I抗(兔抗鼠PCSK9和LDLR多克隆抗體，1∶1 000；兔抗鼠β-actin抗體,1∶5 000)及 II 抗(1∶5 000)，化學發光檢測目的條帶，在凝膠成像系統上觀察分析并拍照。用目的蛋白與內參蛋白的灰度值之比計算蛋白的相對表達量。

5 統計學處理

實驗數據以均值±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS 17.0軟件進行統計分析，資料經正態性及方差齊性檢驗后，進行單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗法，以P<0．05表示差異有統計學顯著性。

結 果

1 GPs對高血脂模型大鼠血清血脂水平的影響

各組大鼠血清經全自動生化分析儀檢測其血脂水平，結果顯示與正常對照組比較，模型組大鼠血清TC、TG和LDL-C水平均明顯升高，差異有統計學顯著性(P<0．05)，HDL-C水平則明顯下降，差異也具有統計學顯著性(P<0．05)。與模型組大鼠比較，辛伐他汀組、GPs組以及聯合用藥組TC、TG和LDL-C水平均明顯下降，差異有統計學顯著性(P<0．05)，其HDL-C水平均明顯升高，差異也具有統計學顯著性(P<0．05)。辛伐他汀組與GPs組比較，以上指標差異均無統計學顯著性；而與兩者單獨用藥比較，聯合用藥組大鼠血清TC、TG和LDL-C水平均明顯降低(P<0．05)，HDL-C水平明顯升高(P<0．05)，見圖1。

2 GPs對高血脂模型大鼠肝指數變化的影響

各組大鼠肝指數測定結果顯示，與正常對照組大鼠比較，模型組大鼠肝指數明顯升高，差異有統計學顯著性(P<0．05)。與模型組大鼠比較，辛伐他汀組、GPs組以及聯合用藥組肝指數均明顯下降，差異均有統計學顯著性(P<0．05)，辛伐他汀組與GPs組肝指數差異無統計學顯著性，而與兩者單獨用藥比較，聯合用藥組大鼠肝指數則明顯下降，差異有統計學顯著性(P<0．05),見圖2。

Figure 1. The levels of blood lipids in different groups of the rats. Mean±SD.n=12.*P<0．05vscontrol group;▲P<0．05vsmodel group;★P<0．05vscombined group.

圖1 各組大鼠血清的血脂水平

3 GPs對高血脂模型大鼠肝臟病理學變化的影響

3.1 肉眼觀察 Control組大鼠肝臟均無明顯異常，顏色紅潤，質地柔軟，富有彈性；model組大鼠肝臟呈灰白色脂肪病變,體積呈彌漫性增大，邊緣鈍而厚實，質地變硬，指壓可出現凹陷，切面有油膩感；辛伐他汀組、GPs組以及聯合用藥組脂肪病變明顯減輕，呈淡紅色，色澤較暗，質地、彈性及切面油膩感等介于control組與model組之間，但此3組之間肉眼觀察變化不太明顯，見圖3。

Figure 2.The change of liver index in different group of the rats. Mean±SD.n=12.*P<0．05vscontrol group;▲P<0．05vsmodel group;★P<0．05vscombined group.

圖2 各組大鼠肝指數的變化

Figure 3.The macroscopic observation of the liver in different groups of the rats.

圖3 各組大鼠肝臟肉眼觀察

3.2 鏡下病理學觀察 Control組的肝細胞索排列較整齊，以中央靜脈居中，肝竇正常不增寬，胞核清晰，肝小葉輪廓不明顯，未見結締組織，肝細胞內僅可見少量細小脂滴。 模型組的肝細胞嚴重腫脹，病變仍以中央靜脈為中心，可見大量脂肪空泡，脂滴大小不等，部分融合為大泡性脂肪變性，肝竇狹窄或消失，部分區域見有點狀壞死、脂肪變性的細胞布滿視野，肝細胞排列松散。辛伐他汀組的病變程度較模型組明顯減輕，可見少量小脂滴，肝細胞腫脹較模型組也較輕，胞漿疏松化，可見到正常的肝細胞。GPs組也可見肝細胞脂肪變性，但較model組明顯減輕，肝細胞腫脹較model組也較輕，與辛伐他汀組比較區別不明顯。聯合用藥組可見脂肪病變程度較model組、辛伐他汀組及GPs組明顯減輕，細胞空泡變明顯減少致未見，脂滴少而小，接近正常組，肝細胞核結構基本正常，偶見少數無核肝細胞。細胞腫脹程度較模型組腫脹顯著減少，略重于正常組，見圖4。

Figure 4.The pathological observation of the liver in different groups of the rats (HE staining, ×200).

圖4 各組大鼠肝臟的病理學觀察

4 GPs對高血脂模型大鼠肝臟PCSK9和LDLR的mRNA表達的影響

Real-time PCR檢測各組大鼠肝臟PCSK9和LDLR的mRNA表達，結果顯示與正常對照組比較，高脂模型組PCSK9的mRNA表達明顯升高，LDLR的mRNA表達明顯降低，差異均有統計學顯著性(P<0.05)。與高脂模型組比較，辛伐他汀組PCSK9和LDLR的mRNA表達升高，差異有統計學顯著性(P<0.05)；GPs 組PCSK9的mRNA表達明顯降低，差異有統計學顯著性(P<0.05)，LDLR的mRNA表達差異則無統計學顯著性；combined組PCSK9的mRNA表達同樣明顯降低，LDLR的mRNA表達則明顯升高，差異均有統計學顯著性(P<0.05)。與GPs組及simvastatin組比較，combined組PCSK9和LDLR的mRNA表達均介乎單獨兩組之間，且差異均有統計學顯著性(P<0.05)，見圖5。

Figure 5.The mRNA expression of PCSK9 and LDLR in the rat liver of different groups. Mean±SD.n=12.*P<0.05vscontrol group;▲P<0.05vsmodel group;★P<0.05vscombined group.

圖5 各組大鼠肝臟PCSK9和LDLR mRNA的表達

5 GPs對高血脂模型大鼠肝臟PCSK9和LDLR 蛋白表達的影響

Western blot法檢測各組大鼠肝臟PCSK9和LDLR蛋白的表達，結果顯示與正常對照組比較，高脂模型組PCSK9的蛋白表達明顯升高，LDLR的蛋白表達明顯降低，差異有統計學顯著性(P<0.05)。與高脂模型組比較，simvastatin組的PCSK9和LDLR 蛋白表達均明顯升高，差異有統計學顯著性(P<0.05)；GPs組的PCSK9蛋白表達明顯降低，LDLR蛋白表達明顯升高，差異均有統計學顯著性(P<0.05)；combined組的PCSK9蛋白表達明顯降低，LDLR蛋白表達明顯升高，差異均有統計學顯著性(P<0.05)。與GPs組及simvastatin組比較，combined組的PCSK9蛋白表達均低于單獨兩組各自的蛋白表達值，差異有統計學顯著性(P<0.05)，combined組的LDLR蛋白表達則均高于單獨兩組各自的蛋白表達值，差異也有統計學顯著性(P<0.05)，見圖6。

Figure 6.The protein expression of PCSK9 and LDLR in the rat liver of different groups. Mean±SD.n=12.*P<0.05vscontrol group;▲P<0.05vsmodel group;★P<0.05vscombined group.

圖6 各組大鼠肝臟PCSK9和LDLR 蛋白的表達

討 論

本實驗通過喂飼高脂飲食建立大鼠高脂血癥模型，結果顯示與空白對照組比較，模型組大鼠TG、TC和LDL-C水平明顯升高。此外，模型組大鼠肝指數與空白對照組比較也明顯升高；病理學檢查也證實肝臟具有明顯脂肪病變，這些結果說明大鼠高脂血癥模型構建成功。

實驗結果表明，與模型組比較，GPs組的TC、TG和LDL-C水平均明顯下降，肝指數明顯降低，肝臟脂肪病變較模型組也有明顯減緩和改善。這些結果與既往文獻報道相符，進一步證實了絞股藍總苷具有降低血脂、減輕肝脂肪變性的作用。

PCSK9不同類型的突變，對血漿膽固醇水平有不同的調節作用[11-12]。基于以PCSK9為靶點的降脂藥物研發已受到關注[11,13-14]。本實驗中，與模型組比較，GPs組大鼠肝臟PCSK9 mRNA及蛋白的表達均明顯下降，LDLR蛋白水平較模型組則明顯升高，提示GPs能抑制PCSK9的表達，減少LDLR的降解，從而增加LDL-C的清除，是其降脂的機理之一。另外，與模型組比較，GPs組大鼠肝臟LDLR mRNA的變化不明顯，說明GPs對LDLR的轉錄沒有影響。這提示PCSK9對LDLR轉錄也沒有影響，其對LDLR表達調控是發生在蛋白水平，屬轉錄后水平調控，與Wang等[15]和Fisher等[16]報道一致。

辛伐他汀是目前最強效和最常用的降脂藥物之一，該藥是膽固醇合成的關鍵酶HMG-CoA還原酶的抑制劑，可抑制內源性膽固醇合成[17]。本實驗設置辛伐他汀組作為陽性對照，并設置了辛伐他汀與GPs兩者聯合用藥組，目的是觀察GPs對辛伐他汀降脂效應的影響。結果表明辛伐他汀組大鼠血清中TC、TG和LDL-C水平較模型組大鼠均明顯下降，雖然其下降的幅度大于GPs組，但兩組之間比較差異沒有統計學顯著性，尚不能確定辛伐他汀降血脂作用是否強于GPs；combined組大鼠血清中的TC、TG和LDL-C水平較模型組大鼠也明顯下降，且均強于單獨用藥組，差異也具有統計學顯著性，提示辛伐他汀和GPs在降血脂效應上具有協同作用。

新近的研究發現，他汀類藥物在降脂的同時，能增強PCSK9表達，從而增加LDLR降解，使他汀類藥物降脂效果受到抑制[5]。而在PCSK9基因敲除鼠中，使用他汀類藥時，其LDLR的量明顯高于野生型鼠，血脂對降脂藥的敏感性增高[18]。本實驗結果顯示，辛伐他汀組PCSK9和LDLR 的mRNA及蛋白表達與模型組比較均明顯升高，說明辛伐他汀能增強LDLR 的表達，從而可降低LDL-C水平，起到降血脂作用。然而在本實驗中，辛伐他汀也同時增強了PCSK9基因的表達，這與文獻報道一致[5]。Combined組與model組比較PCSK9蛋白表達明顯降低，LDLR蛋白表達明顯升高；與GPs組及simvastatin組單獨用藥組比較，combined組PCSK9蛋白表達均低于單獨兩組的PCSK9蛋白表達值，差異具有統計學顯著性，combined組的LDLR蛋白表達則均高于單獨兩組的LDLR蛋白表達值，差異也具有統計學顯著性，表明二者聯用后，可能由于GPs抑制了辛伐他汀單獨治療導致的PCSK9表達增加，減少了LDLR的降解，故降脂效果明顯優于單用。這提示GPs有可能作為他汀類降脂治療的補充，增強和改善他汀類藥物降脂的療效。本研究為GPs的降脂治療提供了新的實驗依據和思路。

[1] Mandel’shtam MIu, Vasil’ev VB. Monogenic hypercholesterolemias: new genes, new drug targets[J]. Genetika, 2008, 44(10):1309-1316.

[2] 李小玲，李 菁，朱偉杰，等. 絲瓜絡對高脂血癥小鼠LDL-R基因表達的影響[J].中國病理生理雜志, 2009,25(6)：1156-1159.

[3] Seidah NG, Benjannet S, Wickham L, et al. The secretory proprotein convertase neural apoptosis-regulated convertase 1 (NARC-1): liver regeneration and neuronal differentiation [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2003, 100(3):928-933.

[4] Dopazo C, Bilbao I, Lázaro JL, et al. Severe rhabdomyo-lysis and acute renal failure secondary to concomitant use of simvastatin with rapamycin plus tacrolimus in liver transplant patient[J]. Transplant Proc, 2009, 41(3):1021-1024.

[5] Dubuc G, Chamberland A, Wassef H, et al. Statins upregulate PCSK9, the gene encoding the proprotein convertase neural apoptosis-regulated convertase-1 implicated in familial hypercholesterolemia[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2004，24(8):1454-1459.

[6] 張煒平，馬玉亭，許 華. 絞股藍滴丸對實驗型高血脂大鼠的降血脂作用研究[J].內蒙古中醫藥, 2004, 2(1):25-26.

[7] 王樹桂，潘 瑩. 復方絞股藍膠囊對高脂血癥小鼠血脂的影響[J]. 廣西中醫藥, 2005, 28(3):54-55.

[8] 譚華炳. 絞股藍對兔高脂血癥與血液流變學影響的研究[J]. 第三軍醫大學學報, 2007, 29(15):1497-1499.

[9] 彭世志，寧賢基，鄧燕藝，等. 絞股藍治療高脂血癥55例[J].實用中醫藥雜志，2005，21(4):209.

[10]史建萍，李 威. 絞股藍治療高脂血癥的臨床觀察[J]. 白求恩醫科大學學報, 2001, 27(4): 343-347.

[11]Basak A， Palmer-Smith H， Mishra P. Proprotein convertase subtilisin kexin9 (PCSK9): a novel target for cholesterol regulation[J]. Protein Pept Lett， 2012， 19(6):575-585.

[12]Baass A， Dubuc G， Tremblay M， et al. Plasma PCSK9 is associated with age, sex, and multiple metabolic markers in a population-based sample of children and adolescents[J]. Clin Chem, 2009, 55(9):1637-1645.

[13]Chan JC, Piper DE, Cao Q, et al. A proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 neutralizing antibody reduces serum cholesterol in mice and nonhuman primates[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2009, 106(23):9820-9825.

[14]Do RQ, Vogel RA, Schwartz GG. PCSK9 inhibitors: potential in cardiovascular therapeutics[J]. Curr Cardiol Rep, 2013, 15(3):345-349.

[15]Wang Y, Huang Y, Hobbs HH, et al. Molecular characterization of proprotein convertase subtilisin/kexin type 9-mediated degradation of the LDLR[J]. J Lipid Res, 2012, 53(9):1932-1943．

[16]Fisher TS，Lo Surdo P，Pandit S，et al. Effects of pH and low density lipoprotein (LDL) on PCSK9-dependent LDL receptor regulation[J]. J Biol Chem, 2007, 282(28):20502-20512.

[17]王忠磊，鄧 悅，岳新新，等. 辛伐他汀對骨合成代謝的影響及機制的研究進展[J]. 廣東醫學, 2015, 36(1):156-158.

[18]Rashid S, Curtis DE, Garuti R, et al. Decreased plasma cholesterol and hypersensitivity to statins in mice lackingPcsk9[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2005, 102(15):5374-5379.

(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

Effects of gypenosides on PCSK9 gene expression and blood lipids lowered by simvastatin

WU Liu-song1,2, QIAN Min-zhang1

(1DepartmentofBiochemistry,2TheSecondDepartment,Pediatrics,AffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege,Zunyi563004,China.E-mail:qian_mzh@hotmail.com)

AIM: To explore the effect of gypenosides (GPs) onPCSK9 gene expression in hyperlipidemic rat liver and the blood lipids lowered by simvastatin.METHODS: Healthy male SD rats (n=60) were randomized into 5 groups: normal control group, hyperlipidemic model group, simvastatin group, GPs group and GPs combined with simvastatin group (combined group). The rats in all groups were fed high-fat diet except normal control group which were fed with ordinary diet. The rats in control group and hyperlipidemic model group were gavaged with 0.3% CMC-Na every day. The rats in GPs group were gavaged with GPs at 160 mg·kg-1·d-1. The rats in simvastatin group were gavaged with simvastatin at 5 mg·kg-1·d-1. The rats in combined group were gavaged with GPs and simvastatin. The experiment lasted for 8 weeks. The rats were anesthetized with chloral hydrate, and abdominal arterial blood samples were collected to detect the total cholesterol (TC), triglyceride (TG), low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C) and high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C). The body weight and the wet weight of the livers were measured, and the liver index was calculated. The pathological changes of the livers were observed under microscope with HE staining. The expression of PCSK9 and low-density lipoprotein receptor (LDLR) at mRNA and protein levels was determined by real-time PCR and Western blot. RESULTS: The model of hyperlipidemia rats was established successfully. Compared with model group, the levels of TC, TG and LDL-C in simvastatin group, GPs group and combined group were obviously decreased (P<0.05), and the HDL-C levels were obviously upregulated (P<0.05). Compared with model group, the liver indexes in simvastatin group, GPs group and combined group were obviously decreased (P<0.05). The pathological changes of the liver tissues showed that hepatic adipose appeared in model group, and that in simvastatin group and GPs group had different degrees of relief, especially in combined group. Compared with model group, the mRNA expression levels of PCSK9 and LDLR in simvastatin group were obviously increased, while the mRNA expression levels of PCSK9 in GPs group and combined group were obviously decreased (P<0.05), and the mRNA expression of LDLR in combined group was obviously increased (P<0.05). Compared with model group, the protein expression of PCSK9 and LDLR in simvastatin group was obviously increased, while the protein expression levels of PCSK9 in GPs group and combined group were obviously reduced, and the LDLR protein levels were obviously increased (P<0.05). CONCLUSION: Gypenosides inhibit the expression of PCSK9 and increase the expression of LDLR in the liver. The combination of gypenosides and simvastatin promotes the lipid-lowering effect of simvastatin and attenuates hepatic steatosis, which may be related to inhibiting the expression of PCSK9 in the liver.

Gypenosides; Hyperlipidemia;PCSK9 gene; Low-density lipoprotein receptor; Simvastatin

1000- 4718(2017)01- 0079- 07

2016- 01- 28

2016- 08- 09

貴州省科技廳基金資助項目(黔科合J字【2009】2-178號)

R543.5

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.01.013

雜志網址： http://www.cjpp.net

△通訊作者 Tel: 0851-28609792； E-mail: qian_mzh@hotmail.com