miRNA-181a對多發性骨髓瘤細胞增殖和遷移的作用*

嚴 笑， 張艷麗， 歐陽桂芳， 牧啟田， 盛立霞

(寧波市第一醫院血液科， 浙江 寧波 315000)

?

miRNA-181a對多發性骨髓瘤細胞增殖和遷移的作用*

嚴 笑， 張艷麗△， 歐陽桂芳， 牧啟田， 盛立霞

(寧波市第一醫院血液科， 浙江 寧波 315000)

目的： 通過沉默人多發性骨髓瘤細胞株RPMI8226中miRNA-181a的表達，觀察RPMI8226細胞的增殖、遷移和細胞周期的變化，并探討其可能的作用機制。方法: 實時熒光定量PCR檢測多發性骨髓瘤患者和健康者血清標本中miRNA-181a的表達水平；轉染miRNA-181a inhibitor后，CCK-8法與集落形成實驗檢測細胞的增殖能力，劃痕實驗檢測細胞的遷移能力，流式細胞術檢測細胞的周期變化，Western blot法檢測cyclin D1、p-PI3K和p-Akt蛋白水平的變化。結果: 多發性骨髓瘤患者血清中miRNA-181a呈高表達，顯著高于正常人；轉染miRNA-181a inhibitor后，RPMI8226細胞的存活率和集落形成能力下降，遷移能力降低，G0/G1期細胞比例明顯減少，S期細胞比例增多，cyclin D1蛋白表達顯著低于正常對照組， PI3K和Akt的磷酸化水平明顯低于正常對照組。結論: 沉默miRNA-181a的表達能夠抑制RPMI8226細胞的增殖，并降低細胞的遷移能力，可能與細胞周期及PI3K/Akt信號通路有關。

miRNA-181a； 多發性骨髓瘤； 細胞周期

多發性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是一種來源于漿細胞的血液系統惡性腫瘤，患者的骨髓中克隆性漿細胞出現異常增生，臨床主要表現為貧血、腎功能損害，骨損傷以及反復感染等[1]。多發性骨髓瘤占所有腫瘤發生率的1%[2]，在全部血液系統惡性腫瘤中占12%～15%，并隨年齡增長而發病率逐漸增多，好發于60歲以上的老年人[3-4]。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類長度約22個堿基的非編碼RNA，根據靶基因的作用不同在調控腫瘤發生發展時具有癌基因或抑癌基因的作用。近年來研究表明，某些miRNA在小鼠和人的胎盤組織中呈高表達[5]。miRNA-181a是miRNA-181家族成員之一，研究發現其在腫瘤和自身免疫疾病方面的表達異常，引起細胞功能障礙[6]。本實驗擬通過沉默miRNA-181a對人多發性骨髓瘤細胞株RPMI8226增殖和遷移能力的影響，探討miRNA-181a的表達是否能為多發性骨髓瘤的臨床治療具有指導意義。

材 料 和 方 法

1 實驗材料

22例多發性骨髓瘤患者血清標本和26例健康者血清標本來自寧波市第一醫院血液科。人來源多發性骨髓瘤細胞株RPMI8226(中國醫學科學院腫瘤細胞庫)；胎牛血清(Gibco)；CCK-8試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；LipofectamineTM2000(Invitrogen)；miRNA-181a inhibitor(上海吉瑪制藥技術有限公司)；抗cyclin D1(Santa Cruz)、p-PI3K和p-Akt抗體(Cell Signaling Technology)。

2 方法

2.1 細胞復蘇與傳代 將人多發性骨髓瘤細胞株RPMI8226置于37 ℃水浴箱中快速融化，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液10 mL，800 r/min離心5 min，棄去上清，重懸后將細胞加入RPMI-1640培養基中，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，待細胞融合至約80%～90%時傳代。

2.2 實驗分組與細胞轉染 實驗隨機分為3組：正常對照(control)組、miRNA-181a inhibitor陰性對照組(NC inhibitor組)和轉染miRNA-181a inhibitor組。在轉染前1 d，用0.25%胰酶消化RPMI8226細胞，接種于48孔板中，培養24 h后，加入無血清培養液繼續培養1 h，按照LipofectamineTM2000轉染試劑盒說明書操作，轉染miRNA-181a inhibitor，4 h后更換新鮮含10%胎牛血清的培養液，繼續培養48 h。

2.3 實時熒光定量PCR檢測miRNA-181a的表達 嚴格按照TRIzol說明書進行操作，提取細胞總RNA，進行蛋白定量后，逆轉錄合成cDNA，用PCR儀擴增，反應條件為：92 ℃ 35 s, 63 ℃ 35 s, 72 ℃ 45 s，共32個循環；72 ℃ 10 min。miRNA-181a的上游引物為5’-GCGGTAACATTCAACGCTGTCG-3’，下游引物為5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；內參照U6的上游引物為5’-CGCTTCGGCAGCACATATA-3’，下游引物為5’-TTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。實驗結果在熒光定量操作系統中進行分析對比，采用2-ΔΔCt對miRNA-181a的表達進行相對定量。

2.4 CCK-8法和集落形成實驗檢測細胞的增殖能力 收集對數生長期的多發性骨髓瘤細胞RPMI8226，用無血清的RPMI-1640培養液重懸，調整密度約為每孔1×105個，接種于96孔板，放置在37 ℃、5% CO2培養箱孵育，并于12 h、24 h、36 h和48 h時分別取各時段的細胞，加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育3～4 h，于450 nm波長處用酶標儀測定的吸光度(A)值，計算細胞存活率。存活率(%)=實驗組A值/空白組A值×100%。

收集處于對數生長期的細胞集落形成實驗，重懸成單個細胞，調整細胞密度為1×108/L，接種于24孔板中繼續培養，每孔加入4 mL含20%胎牛血清的DMEM培養液，置于37 ℃、5% CO2培養箱繼續培養，出現肉眼可見的集落，棄去培養液，PBS洗滌，加入5 mL甲醇固定15 min，加入吉姆薩溶液染色20 min，自來水沖洗，晾干，計算集落形成率。集落形成率(%)=集落形成數/接種細胞數×100%。

2.5 劃痕實驗 收集各組細胞，以5×108/L密度接種于96孔板中，待細胞融合約90%，用槍頭沿著與皿底垂直方向劃痕，PBS洗細胞3次，加入無血清培養基，放置在37 ℃、5% CO2培養箱培養24 h后，觀察細胞遷移軌跡，拍照記錄。

2.6 細胞周期的測定 收集各組對數生長期細胞，用預冷PBS緩沖液洗滌2次，棄去PBS，用預冷70%乙醇溶液重懸細胞，4 ℃固定過夜，離心收集細胞，PBS洗滌2次，加入100 mg/L RNase A于37 ℃水浴30 min，加入含50 mg/L碘化丙啶溶液的PBS溶液500 μL，4 ℃避光孵育30 min，在流式細胞儀檢測細胞周期。

2.7 Western blot實驗 細胞處理48 h后，收集各組細胞，加入裂解液，收集蛋白并調整蛋白濃度，后加入上樣緩沖液，上樣并通過SDS-PAGE分離蛋白，轉膜，加入封閉液封閉1 h，分別孵育相應Ⅰ抗[cyclin D1(1∶1 000)、p-PI3K(1∶1 000)、PI3K(1∶4 000)、p-Akt(1∶1 000)和Akt(1∶1 000)]，4 ℃孵育過夜，洗滌3次，再次加入相應Ⅱ抗，室溫孵育30 min，化學發光法顯色，成像掃描分析系統保存圖像。灰度值采用ImageJ掃描并記錄。其中p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt后的相對變化量，表示磷酸化水平變化。

3 統計學處理

所有實驗結果采用SPSS 15.0統計軟件進行分析，實驗結果以均數±標準差(mean±SD)表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組定量數據符合方差齊性要求采用單因素方差分析,各組均數間均數的兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗， 以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 多發性骨髓瘤患者血清標本miRNA-181a的表達

多發性骨髓瘤患者血清中miRNA-181a的表達水平顯著高于正常血清標本(P<0.05)，提示mi-RNA-181a在多發性骨髓瘤患者血清中呈高表達。

Figure 1.The mRNA expression levels of miRNA-181a in serum from normal people (n=26) and multiple myeloma patients (n=22). Mean±SD.*P<0.05vsnormal people.

圖1 正常人與骨髓瘤患者血清中miRNA-181a的表達

2 沉默miRNA-181a對RPMI8226細胞增殖能力的影響

MTT實驗結果顯示，正常對照組的RPMI8226細胞隨時間增加存活率迅速增加；轉染miRNA-181a inhibitor后，RPMI8226細胞的存活率隨時間增加的幅度顯著低于正常對照組(P<0.05)；正常對照組與陰性對照組間差異無統計學顯著性，見圖2。平板集落形成實驗的結果顯示，與正常對照組相比，沉默miRNA-181a后，細胞的集落形成能力明顯降低，差異具有統計學意義(P<0.05),見圖3。

Figure 2. The effect of inhibition of miRNA-181a expression on the viability of RPMI8226 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol.

圖2 沉默miRNA-181a對細胞存活率的影響

3 沉默miRNA-181a對RPMI8226細胞遷移能力的影響

劃痕實驗結果顯示，與正常對照組相比，轉染miRNA-181a inhibitor后，RPMI8226細胞的遷移能力顯著降低(P<0.05)，而正常對照組與陰性對照組的差異無統計學顯著性，見圖4。

Figure 3.The effect of inhibition of miRNA-181a expression on the colony formation ability of RPMI8226 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol.

圖3 沉默miRNA-181a對RPMI8226細胞集落形成能力的影響

Figure 4. The effect of inhibition of miRNA-181a expression on the migratory ability of RPMI8226 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol.

圖4 沉默miRNA-181a對RPMI8226細胞遷移能力的影響

4 沉默miRNA-181a對RPMI8226細胞周期的影響

如圖5所示，轉染miRNA-181a inhibitor后，G0/G1期細胞的比例明顯減少，S期的細胞比例顯著大于正常對照組(P<0.05)，正常對照組與陰性對照組的細胞各周期比例無顯著差異。

Figure 5.The change of cell cycle in RPMI8226 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol.

圖5 沉默miRNA-181a對RPMI8226細胞周期變化的影響

5 沉默miRNA-181a對cyclin D1蛋白表達的影響

如圖6所示，與正常對照組相比，轉染miRNA-181a inhibitor后，RPMI8226細胞的cyclin D1蛋白表達顯著下降(P<0.05)，正常對照組與陰性對照組間的差異無統計學顯著性。

Figure 6.The effect of inhibition of miRNA-181a expression on the protein expression of cyclin D1 in RPMI8226 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol.

圖6 沉默miRNA-181a對RPMI8226細胞cyclin D1蛋白表達的影響

6 沉默miRNA-181a對PI3K和Akt磷酸化水平的影響

如圖7所示，與正常對照組相比，轉染miRNA-181a inhibitor后RPMI8226細胞p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt的水平均顯著降低，說明沉默miRNA-181a降低PI3K和Akt的磷酸化水平(P<0.05)，正常對照組與陰性對照組間的差異無統計學顯著性。

Figure 7.The effect of inhibition of miRNA-181a expression on the phosphorylation of PI3K and Akt. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol.

圖7 沉默miRNA-181a對RPMI8226細胞p-PI3K和p-Akt磷酸化水平的影響

討 論

細胞周期是細胞生命活動的基本過程，主要分為G0/G1期、S期、G2期和M期4個時相，其中S期是DNA合成期，G1期和G2期分別是合成前期與合成后期。Cyclin D是細胞周期進程的啟動因子，是調節細胞周期的因子之一，當cyclin D的活性被抑制后，細胞將不能進入細胞周期，導致細胞發生異常增殖或誘發腫瘤。研究發現，cyclin D1在腫瘤細胞的G1期表達增多，而在正常細胞中呈低表達或不表達[7]。另外，cyclin D1參與調控G1-S期的轉換以及S-G2期的轉換，研究發現cyclin D1在HeLa細胞株PRAD21整個細胞周期中呈高表達，提示cyclin D1在癌細胞增殖的過程中可能發揮重要的作用[8]。我們研究發現，可能是由于cyclin D1本來在RPMI8226細胞中表達較高，當沉默miRNA-181a后，并沒有引起多發性骨髓瘤細胞株RPMI8226 G1期的阻滯，而引起S期的阻滯，推測是沉默miRNA-181a引起了S-G2期轉換的障礙，DNA合成被抑制，從而抑制細胞的增殖。

PI3K/Akt信號通路在細胞周期的調控、血管生成和細胞代謝等方面具有重要作用[9]，Akt的磷酸化是PI3K/Akt信號通路在腫瘤發生的關鍵，射線、輻射和細胞毒性的藥物均可激活PI3K/Akt信號通路，使得腫瘤細胞產生應激調節。Akt處于PI3K/Akt信號通路的核心位置，通過激活下游底物，從而抑制細胞凋亡，調控細胞周期以及促進血管形成[10]。此外，研究發現使用PI3K/Akt抑制劑能夠抑制SDF-1α和bFGF誘導的間充質干細胞的遷移[11]。細胞遷移需要微管介導的細胞體收縮與伸展的一系列過程，PI3K/Akt信號通路影響多種腫瘤細胞的細胞結構，過表達PI3K/Akt信號通路下游分子核糖體蛋白S6激酶后，會促進卵巢癌細胞定向遷移[12]。我們研究發現，沉默miRNA-181a后，RPMI8226細胞p-PI3K和p-Akt的蛋白水平顯著下降，提示沉默miRNA-181a可能通過抑制PI3K/Akt信號通路，從而抑制細胞的增殖與遷移。

本研究表明，miRNA-181a的表達對多發性骨髓瘤的診斷具有提示作用，對于指導臨床治療方面具有參考意義。

[1] Palumbo A, Anderson K. Multiple myeloma[J]. N Engl J Med, 2011, 364(11):1046-1060.

[2] Siegel R, Ward E, Brawley O. Cancer statistics, 2011: the impact of eliminating socioeconomic and racial disparities on premature cancer deaths[J]. CA Cancer J Clin, 2011, 61(4):212-236.

[3] Kyle RA, Therneau TM, Rajkumar SV, et al. Incidence of multiple myeloma in Olmsted County, Minnesota: trend over 6 decades[J]. Cancer, 2004, 101(11):2667-2674.

[4] Spitzer TR, Sachs DH, Cosimi B. Multiple myeloma[J]. N Engl J Med, 2011, 364(24):2364.

[5] Seitz H, Royo H, Bortolin ML. A large imprinted microRNA gene cluster at the mouse Dlk1-Gtl2 domain[J]. Genome Res, 2004, 14(9):1741-1748.

[6] Lashine YA, Seoudi AM, Salah S, et al. Expression signature of microRNA-181-a reveals its crucial role in the pathogenesis of paediatric systemic lupus erythematosus[J]. Clin Exp Rheumatol, 2010, 29(2):351-357.

[7] 李 峰, 陳臨溪. 細胞周期蛋白D與細胞周期調控研究進展[J]. 國外醫學:生理、病理科學與臨床分冊，2005, 25(3):270-273.

[8] Li C, Li X, Chen W, et al. The different roles of cyclinD1-CDK4 in STP and mGluR-LTD during the postnatal development in mice hippocampus area CA1[J]. BMC Dev Biol, 2007, 7:57.

[9] 王和峰, 翟純剛, 龐文會, 等. PI3K/Akt/mTOR信號通路在巨噬細胞自噬及動脈粥樣硬化斑塊不穩定中的作用[J]. 中國病理生理雜志，2013,29(3)：390-397.

[10]Kang S, Dong SM, Kim BR, et al. Thioridazine induces apoptosis by targeting the PI3K/Akt/mTOR pathway in cervical and endometrial cancer cells[J]. Apoptosis, 2012, 17(9):989-997.

[11]Liu H, Xue W, Ge G, et al. Hypoxic preconditioning advances CXCR4 and CXCR7 expression by activating HIF-1α in MSCs[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2010, 401(4):509-515.

[12]Ip CK, Cheung AN, Ngan HY, et al. P70 S6 kinase in the control of actin cytoskeleton dynamics and directed migration of ovarian cancer cells[J]. Oncogene, 2011, 30(21):2420-2432.

(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Effects of miRNA-181a on proliferation and migration of multiple myeloma cells

YAN Xiao, ZHANG Yan-li, OUYANG Gui-fang, MU Qi-tian, SHENG Li-xia

(DepartmentofHematology,NingboFirstHospital,Ningbo315000,China.E-mail:zhangyanlimd@126.com)

AIM: To investigate the effect of miRNA-181a inhibition on the proliferation, migration and cell cycle of the human multiple myeloma cell line RPMI8226. METHODS: Real-time PCR was used to detect miRNA-181a expression in serum samples from multiple myeloma or healthy subjects. After transfection with miRNA-181a inhibitor, the cell viability was examined by CCK-8 assay and colony formation assay. The cell migration ability was analyzed by wound healing assay. The cell cycle was detected by flow cytometry. Moreover, the protein level of cyclin D1 and the phosphorylation of PI3K and Akt were determined by Western blot. RESULTS: The expression of miRNA-181a was significantly increased in the serum from multiple myeloma patients as compared with healthy group. Inhibition of miRNA-181a expression by transfection with miRNA-181a inhibitor remarkably decreased the cell viability, migratory ability, the population of G0/G1phase and cyclin D1 protein expression in the RPMI8226 cells. However, the population of S phase and the phosphory-lation of PI3K and Akt were reduced. CONCLUSION: Down-regulation of miRNA-181a inhibits the viability and migratory ability in the RPMI8226 cells via inhibition of cell cycle and PI3K/Akt signaling pathway.

miRNA-181a; Multiple myeloma; Cell cycle

1000- 4718(2017)01- 0033- 05

2016- 07- 18

2016- 11- 04

寧波市自然科學基金資助項目 (No. 2012A610202)

R363．1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.01.006

雜志網址： http://www.cjpp.net

△通訊作者 Tel： 0574-87085591; E-mail: zhangyanlimd@126.com