川芎嗪對血管緊張素Ⅱ誘導大鼠心臟成纖維細胞纖維化的影響

常煜胤，路 明，盧太苓，丁 潔

川芎嗪對血管緊張素Ⅱ誘導大鼠心臟成纖維細胞纖維化的影響

常煜胤，路 明，盧太苓，丁 潔

目的 探討川芎嗪(ligustrazine)對血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導心臟成纖維細胞纖維化的機制及影響。方法 體外培養SD大鼠乳鼠CFs，實驗分為5組，A組(對照組)：培養時不加干預藥物；B組(AngⅡ組)：加AngⅡ10-6mol/L；C組(川芎嗪低劑量組)：AngⅡ10-6mol/L+川芎嗪5 mg/L；D組(川芎嗪中劑量組)AngⅡ10-6mol/L+川芎嗪 10 mg/L；E組(川芎嗪高劑量組)AngⅡ10-6mol/L+川芎嗪 20 mg/L，干預48 h后，采用RT-PCR法測定α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)及鈣調神經磷酸酶催化亞基Aβ亞型(CnAβ)mRNA的表達情況；Western Blot法檢測α-SMA及活化T細胞核因子3(NFAT3)的蛋白表達情況。結果 與A組比較，B組α-SMAmRNA、CnAβmRNA表達均顯著增高，差異有統計學意義(P<0.05)，α-SMA、NFAT3蛋白的表達也顯著增加，差異有統計學意義(P<0.05)；與B組比較，C組α-SMAmRNA、CnAβmRNA表達差異無統計學意義(P>0.05)，α-SMA、NFAT3蛋白表達無統計學意義(P>0.05)，D組和E組α-SMA、CnAβ的mRNA表達均顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)，α-SMA、NFAT3蛋白表達顯著減少，差異有統計學意義(P<0.05)。結論 在一定濃度范圍，川芎嗪以劑量依賴方式抑制AngⅡ誘導的SD大鼠CFs心肌纖維化過程，其機制可能與心臟成纖組細胞纖組化川芎嗪抑制CFs的鈣調神經磷酸酶(CaN)信號通路有關。

心臟成纖維細胞纖維化；川芎嗪；血管緊張素Ⅱ；α-平滑肌肌動蛋白；鈣調神經磷酸酶催化亞基Aβ亞型；鈣調神經磷酸酶信號通路；活化T細胞核因子3；SD大鼠

腎素-血管緊張素-醛固酮系統(RAAS)激活是誘發及引起心肌發生纖維化的主要發病機制，其中血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)是重要的活性成分，能誘發一系列生理病理過程，最終導致心肌纖維化[1]。川芎嗪(ligustrazine)是中藥川芎的主要成分，是我國臨床廣泛應用的中藥，具有鈣離子拮抗、抗血小板聚集、改善微循環和活血化瘀等作用，臨床已廣泛用于急性心腦損傷、脊髓損傷等治療[2-3]。但其在心肌纖維化過程中的作用研究相對較少。本實驗觀察川芎嗪對AngⅡ誘導的心臟成纖維細胞(CFs)心肌纖維化的影響，并探討其可能的作用機制，以期對臨床中西醫結合改善心功能、預防及治療心肌纖維化等方面提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料及實驗動物 實驗用SD大鼠乳鼠購買于徐州醫學院動物中心。試劑和藥物：鹽酸川芎嗪(哈爾濱三聯藥業有限公司)；高糖DMEM培養基含雙抗(南京凱基生物有限公司)；胰酶細胞消化液(碧云天生物科技研究所)；胎牛血清(杭州四季青公司)；兔抗大鼠波形蛋白單克隆抗體(武漢博奧森公司)；血管緊張素Ⅱ(美國sigma公司)；總RNA提取試劑(Trizol)(美國Invitrogen公司)；反轉錄試劑盒(北京天根生物科技有限公司)；Rabbit Anti-NFAT3(北京博奧森公司)，Rabbit Anti-alpha smooth muscle Actin(北京博奧森公司)。

1.2 方法

1.2.1 CFs培養與鑒定

1.2.1.1 CFs的分離、培養 取1 d～3 d鼠齡的SD大鼠乳鼠，在無菌條件下開胸剪取心臟，剪去大血管，去心包膜，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗數次，剪碎。0.125%胰蛋白酶在37 ℃水浴下反復消化(每5 min收集一次細胞懸液)，1 200 r/min離心5 min，將所得細胞置于含10%胎牛血清的細胞培養液(DMEM)培養基中，在37 ℃、5%CO2培養箱內培養90 min。采用差速貼壁法去除心肌細胞，每48 h后更換一次培養基，待細胞生長至融合狀態時，以1∶2傳代，采用第2代～4代細胞。

1.2.1.2 CFs的鑒定 待細胞生長至80%融合狀態時，無菌條件下，棄去培養瓶中的培養基，然后用PBS反復沖洗細胞3次，最后在培養瓶中加入2 mL PBS，用顯微鏡觀察及獲取照片，免疫熒光波形蛋白染色鑒定CFs。

1.2.2 實驗分組與樣品培養液制備 待第4代細胞生長之亞融合狀態后，換用含5%新生牛血清的DMEM無酚紅培養液預適應24 h后棄掉培養基，實驗分為5組，A組(正常對照組)：培養時不加干預藥物；B組(Ang組)：加入AngⅡ10-6mol/L；C組(AngⅡ+川芎嗪低劑量組)：加入AngⅡ 10-6mol/L+川芎嗪5 mg/L；D組(AngⅡ+川芎嗪中劑量組)：加入AngⅡ 10-6mol/L+川芎嗪10 mg/L；E組(AngⅡ+川芎嗪高劑量組)：加入AngⅡ 10-6mol/L+川芎嗪20 mg/L。分別放入培養箱孵育48 h后觀察各個指標變化情況，觀察各組在實驗特定時間相應指標的變化情況。

1.2.3 α-平清肌肌動蛋白(α-SMA)及鈣調神經磷酸酶催化亞基Aβ亞型(CnAβ)mRNA表達的檢測 RT-PCR試劑盒購買于天根生化科技有限公司。各分組細胞培育48 h后，收集細胞，用Trizol提取細胞中總RNA，使用反轉錄酶將RNA轉錄為cDNA，轉錄產物各2 μL，分別加入各自上下游引物，進行PCR反應，反應溫度設置為94 ℃ 2 min，94 ℃ 40 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，如此循環35次，然后72 ℃延伸10 min，4 ℃保溫，以GAPDH作為內參，內參上游引物為：5’-AGG CCG GTG CTG AGT ATG TC-3’，下游引物為5’-TGC CTG CTT CAC CAC CTT CT-3’，產物大小為530 bp；α-SMA上游引物為5’-GGG AGT AAT GGT TGG AAT-3’，下游引物為5’-TCA AAC ATA ATC TGG GTC A-3’，產物大小為252 bp，CnAβ上游引物5’-ACG GCA GAC CCT ACA AAG-3’，下游引物為5’-CCC TCA AAG CCT CCA TCC-3’，產物大小為391 bp。將PCR產物進行瓊脂糖電泳，紫外燈下拍照。

1.2.4 α-SMA及T細胞核因子(NFAT3)蛋白表達的檢測 Western Blot各種試劑盒購于碧云天生物科技研究所。各分組細胞培育48 h后，收集細胞，加入蛋白裂解液，冰上裂解30 min，后將細胞碎片和裂解液移到1.5 mL離心管中，4 ℃，12 000 r/min，離心25 min，取上清，酶標儀測定蛋白濃度，根據標準曲線計算樣本濃度，配平濃度后，加上樣緩沖液，煮沸5 min，裝入EP管中-80 ℃保存。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳：經電泳分離蛋白后，將蛋白轉移至NC膜上，封閉液封閉2 h，一抗孵育4 ℃過夜。復溫后，洗膜每次10 min，共3次，二抗室溫孵育2 h，洗膜每次10 min，共3次，用堿性磷酸酯酶顯色試劑盒顯色，采集圖像。

2 結 果

2.1 CFs鑒定 倒置顯微鏡下，培養的細胞呈梭形或多角形，胞體及細胞核較大，呈橢圓形，細胞之間排列緊密，但不易聚集成團，無自發搏動，形態特征，詳見圖1?？共ㄐ缘鞍讍慰寺】贵w免疫熒光染色為陽性，其中紅色為波形蛋白，藍色為DAPI標記細胞核，詳見圖2。

圖1 分離培養的CFs光鏡細胞形態(×200)

圖2 CFs波形蛋白免疫熒光染色(×400)

2.2 各組α-SMAmRNA及CnAβ mRNA表達比較 以GAPDH為內參對照，結果以α-SMA/GAPDH、CnAβ/GAPDH條帶灰度值比值表示。RT-PCR結果顯示，與A組比較，B組α-SMAmRNA、CnAβmRNA表達均顯著增高，差異有統計學意義(P<0.05)；與B組比較，C組α-SMAmRNA、CnAβmRNA表達，差異無統計學意義(P>0.05)，D組和E組α-SMA、CnAβ的mRNA的表達均顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。詳見表1、圖3。

表1 各組α-SMAmRNA及CnAβ mRNA表達比較

圖3 α-SMA及CnAβ mRNA的表達

2.3 各組α-SMA及NFAT3蛋白表達比較 以GAPDH為內參對照，結果以α-SMA/GAPDH、NFAT3/GAPDH條帶灰度值的比值表示。Western Blot結果顯示，A組比較，B組α-SMA、NFAT3蛋白表達顯著增高，差異有統計學意義(P<0.05)；與B組比較，C組α-SMA、NFAT3蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)，D組和E組α-SMA、NFAT3蛋白表達均顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。詳見表2、圖4。

表2 各組α-SMA 及NFAT3蛋白表達量比較

圖4 各組α-SMA 及NFAT3蛋白表達量的變化

3 討 論

心肌纖維化是心功能衰竭、心律失常的重要病理基礎。CFs是心肌纖維化的主要效應細胞，其可支持心肌細胞作用，還有自分泌及旁分泌功能，能分泌多種生物活性物質影響心臟的結構及功能[5-6]。在細胞水平上，已經證明CFs向心臟肌成纖維細胞表型轉化是啟動心肌纖維化的核心[7]，其標志是α-SMA表達明顯增加，同時通過自分泌、旁分泌活性因子促進基質合成，促進心肌纖維化進程[8-10]。因此α-SMA可作為心肌纖維化進程中可靠的標志性抗原。典型的CFs形態呈梭形或多角形，胞體及細胞核較大，呈橢圓形，胞質透明，細胞之間排列緊密，但不易聚集成團，無自發搏動，本實驗通過酶消化差速貼壁法獲得CFs形態典型，通過免疫熒光染色鑒定，純度較高，均質性好，適合用于實驗。

已知多種細胞因子能誘導成纖維細胞的纖維化，表達其特異性的標記物α-SMA，從而促進心肌纖維化，如轉化生長因子β(TGF-β)、白細胞介素(IL)-4、IL-13等。在眾多致心肌纖維化的因素中，RAAS過度激活在心肌纖維化中發揮的重要作用已得到公認，AngⅡ是其主要的效應分子[11]。鈣調神經磷酸酶(CaN)是體內唯一的 Ca2+/鈣調素依賴的絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶，介導Ca2+依賴的細胞增殖、肥大、凋亡、分泌等多種功能的信號通路。近年來發現鈣調神經磷酸酶信號通路是調控心室肥大的重要通路[12-13]。NFAT是CaN重要的下游靶點，活化的NFAT3在心肌纖維化中起著重要的作用，同時其還可與其他因子結合參與調節心房利鈉因子(AVF)和心肌肌球蛋白重鏈(MHC)等基因的表達，從而影響心肌功能[14]。本實驗應用AngⅡ在體外作用于心臟CFs，避免其他生物活性物質和血流動力學的影響，在干預CFs 48 h后，發現α-SMA表達明顯增加，提示AngⅡ可直接作用于CFs，促進其纖維化的發生發展，進一步證實AngⅡ參與心肌纖維化發病過程，與以前文獻研究相一致。本實驗還發現，用AngⅡ干預CFs 48 h后，在α-SMA表達明顯升高的同時，CnAβ mRNA及下游活化信號分子NFAT3蛋白的表達均明顯增加，提示AngⅡ促CFs表型轉化作用可能與CaN信號通路有關。

川芎嗪是活血化瘀中藥川芎的主要成分，具有抑制炎癥細胞激活、減少促炎癥反應細胞因子產物、抗氧化、抗凋亡等作用，臨床已廣泛用于急性心腦損傷、脊髓損傷等治療[15-17]。在心血管疾病治療中，川芎嗪被證實具有抗缺血-再灌注損傷及抗氧化等保護作用[18-19]。川芎嗪對心肌成纖維細胞表型轉化作用的研究相對較少，本實驗應用不同濃度川芎嗪+特定濃度AngⅡ刺激CFs，與單純用相同濃度AngⅡ刺激組比較發現，在特定濃度范圍內川芎嗪可按劑量依賴方式抑制AngⅡ誘導的CFs α-SMA的表達，提示其可直接作用于CFs，具有抑制CFs的心肌纖維化作用。本實驗還觀察到加用川芎嗪后，在抑制CFs纖維化進程的同時，對UⅡ誘導的CFs CnAβ mRNA及下游活化信號分子NFAT3蛋白的表達也受到抑制，這提示川芎嗪抑制CFs纖維化進程的機制可能與其阻滯CaN信號通路有關。這為川芎嗪在臨床預防治療心肌纖維化的進展，改善心功能等方面提供有力的實驗證據。

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(本文編輯薛妮)

The Influence of Ligustrazine on Cardiac Fibroblasts Fibrosis Induced by Angiotensin Ⅱin Rats

Chang Yuyin,Lu Ming,Lu Tailing,Ding Jie

The Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College,Xuzhou 221000,Jiangsu,China

Objective To observe the effect of ligustrazine on angiotensinⅡ(AngⅡ)-induced cardiac fibroblasts(CFs) fibrosis and its mechanisms.Methods The CFs of neonatal Sprague-Dawley (SD) rats were isolated with the method of trypsin digestion and differential anchoring velocity,then cultured in vitro.The generation 2-4 of CFs were used for the experiment and randomly divided into 5 groups which were control group cultured without AngⅡ or ligustrazine(group A) ,AngⅡ group cultured with AngⅡ 10-6mol/L(group B),and ligustrazine groups(group C,group D,group E) cultured with AngⅡ 10-6mol/L and ligustrazine 5,10,20 mg/L,respectively.CFs were cultured for 48 h and the smooth muscle alpha-actin (α-SMA),beta isoform of calcineurin (CnAβ) mRNA expression were examined by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR),the α-SMA,nuclear factor of activated T-lymphocyte-3 (NFAT3) protein expression by western blot analyses.Results Compared with group A,the expressions of α-SMA,CnAβ mRNA and α-SMA,NFAT3 protein were upregulated in group B(allP<0.05).Compared with group B,the expressions of α-SMA,CnAβ mRNA and α-SMA,NFAT3 protein in group D and group E were obviously decreased(allP<0.05).Conclusion Within a given concentration range,ligustrazine can inhibit the expression of α-SMA in a dose-dependent manner to delay the differentiation of CFs induced by AngⅡ.Ligustrazine can inhibit the expression of CaN and downstream signaling molecules NFAT3,which indicates that the inhibition of CFs fibrosis process may be related to the CaN signaling pathway.

ligustrazine； angiotensinⅡ；smooth muscle alpha-actin；beta isoform of calcineurin；CaN signaling pathway；nuclear factor of activated T-lymphocyte-3；cardiac fibroblasts； Sprague-Dawley rats

徐州醫學院(江蘇徐州 221000)，E-mail：787013497@qq.com

引用信息：常煜胤，路明，盧太苓，等.川芎嗪對血管緊張素Ⅱ誘導大鼠心臟成纖維細胞纖維化的影響[J].中西醫結合心腦血管病雜志，2016，14(23)：2758-2761.

R322.1 R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2016.23.012

1672-1349(2016)23-2758-04

2016-04-28)