乳酸菌噬菌體及其PCR法檢測研究進展

朱良工，關松梅，劉海燕，王丹，張筠

（1.黑龍江省綠色食品科學研究院，哈爾濱150028；2.黑龍江東方學院，哈爾濱150086；3.新希望乳業股份有限公司技術中心，成都610016）

乳酸菌噬菌體及其PCR法檢測研究進展

朱良工1，關松梅2,3，劉海燕3，王丹1，張筠2

（1.黑龍江省綠色食品科學研究院，哈爾濱150028；2.黑龍江東方學院，哈爾濱150086；3.新希望乳業股份有限公司技術中心，成都610016）

簡述了乳酸菌噬菌體以及一些利用PCR技術檢測噬菌體的方法，旨在為相關研究人員提供參考，同時以期為乳制品行業開展監測噬菌體污染奠定基礎。

乳酸菌；噬菌體；PCR；檢測

0 引言

噬菌體無處不在，是當前地球上最主要的生物實體。科學家曾試圖利用噬菌體治療疾病，如痢疾或葡萄球菌感染等。噬菌體的關鍵角色之一是平衡每個共享環境的細菌數量。但是在乳制品發酵行業中，尤其在干酪生產的過程中，噬菌體是發酵異常的主要原因。

噬菌體污染問題廣泛存在于食品、化工、制藥、飼料、農藥產業，然而乳制品行業可能是感染噬菌體頻率最高的行業。在發酵乳與奶酪的生產中，都有噬菌體污染的可能性。統計發現，在奶酪生產中，60%～70%的生產中斷是由于噬菌體污染[1]。

在發酵工業中，原料奶一般為巴士殺菌，這提供了噬菌體生存的條件。車間中的設備、空氣、地板等都可能存在噬菌體，這是引發噬菌體經常性污染的原因[2]。乳酸菌在感染噬菌體后會延緩發酵甚至停止發酵，給企業造成巨大經濟損失。本文介紹了乳酸菌噬菌體，同時總結了目前的一些乳酸菌噬菌體的檢測方法。

1 乳酸菌及噬菌體簡介

1.1 乳酸菌

乳酸菌是真細菌綱真細菌目中的乳酸細菌科，能發酵碳水化合物產生乳酸，是一類無芽孢、不運動或很少運動的革蘭氏陽性菌總稱，按其細胞形狀可分為兩類，一類為呈球狀的鏈球菌族，一類為呈桿狀的乳酸桿菌族[3]。鏈球菌族分為五個屬，分別為雙球菌屬(Diplococ-cus)；鏈球菌屬(Streptococcus)；足球菌屬(Pe?dio-coccus)；明串珠菌屬(Leucomostoc)；消化鏈球菌屬(Peptostreptococcus)，對發酵行業最為重要的是鏈球菌屬。乳酸桿菌族分為五個屬：乳酸桿菌屬(Lactobacil?lus)；真細菌屬(Eubacterium)；鏈條桿菌屬(Catenabacteri?um)；假枝桿菌屬(Ramibacterium)；運動桿菌屬(Cillobacte?rium)[3]。其中，乳酸桿菌屬在發酵行業中應用最為廣泛。乳酸菌發酵根據其發酵產物可分為兩種類型，一種為同型乳酸發酵，代謝產物只有乳酸，另一種為異型乳酸發酵，代謝產物除乳酸外還可產生甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、醋酸、乙醇、二氧化碳和甘露醇等[4]，賦予發酵產品甜、香、維生素、胞外多糖和細菌素等使其具有健康和安全的特性[5]。近年來保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌經常用于乳酸菌發酵劑的使用。

1.2 噬菌體

噬菌體能侵染細菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物細胞，是一類主要由核酸和蛋白質組成的病毒，噬菌體的遺傳物質是核酸，為DNA或RNA[6]，多為DNA，衣殼和尾部由蛋白質構成。噬菌體有兩種類型，一種為烈性噬菌體，另一種為溫和噬菌體，烈性噬菌體可導致宿主菌裂解。

在1896年英國科學家Ernest Hankin初次提出了微生物中存在某種抗菌活性物質的現象。1898年，Niko?lay Gamaleya在枯草芽孢桿菌中發現了類似現象[7]。

英國科學家Frederick wort在1915年培養金黃色葡萄球菌的過程中，第一次發現菌落上出現透明斑，并將該現象解釋為病毒感染[8]。1917年，巴黎巴斯德研究所的法裔加拿大微生物學家Felix d’Herelle將這些抗菌活性物質解釋為由寄生在細菌中的病毒所引起,并正式命名為“噬菌體”[9]。1944年Baylor等[10]利用電子顯微鏡觀察噬菌體，為噬菌體的研究奠定了基礎。

1.3 乳酸菌噬菌體

20世紀30年代首次報道了感染噬菌體會影響牛乳發酵，這給乳品發酵行業帶來了巨大的經濟損失。乳酸菌在被噬菌體侵染后，其菌株的產酸能力和蛋白水解能力減弱而導致產酸下降，延緩發酵甚至終止發酵，使乳制品質量（例如，營養價值、味道、質地等等）下降[11-12]。乳酸菌類型復雜，致使乳酸菌噬菌體種類繁多。

1.3.1 乳酸菌噬菌體分類

在噬菌體研究初期根據其宿主范圍、形態進行和侵染途徑進行分類，據其侵染途徑可分為烈性噬菌體和溫和噬菌體，烈性噬菌體可在短時間內可完成一系列侵染過程實現噬菌體對乳酸菌的裂解增殖，而溫和噬菌體在侵入宿主菌后，只將噬菌體DNA整合到宿主菌染色體上，一般不對宿主菌產生裂解作用[5]。乳酸菌噬菌體根據其形態可以分為有尾噬菌體和無尾噬菌體，其中大部分都被歸為有尾病毒目，有尾噬菌體又可以分為長尾噬菌體、肌尾噬菌體、短尾噬菌，乳酸菌噬菌體中頭等長，具有長而非收縮性的尾是最常見的形態[13]。隨著對噬菌體研究的深入，可根據噬菌體的基因相關性和同源性把噬菌體分成12類，在發酵乳制品中分離出的噬菌體大多為長尾噬菌體科的圓頭狀936型、長頭狀c2型和圓頭狀p335型[14-15]。其中936型和c2型具有較強的裂解性和較為廣泛的宿主范圍。

1.3.2 乳酸菌噬菌體侵染機制

乳酸菌噬菌體作用于乳酸菌的過程較快。如當一個乳酸菌噬菌體感染了一個乳酸菌，經20～40 min后，就能感染15～100個。噬菌體侵染細菌時，通常分為潛伏期和裂殖期，前期表現緩慢。當噬菌體數量少時，對發酵劑無影響，但到達裂殖后，乳酸菌發酵劑中的細菌在短時間內就會被破壞[16]。

乳酸菌被噬菌體侵染的過程可分為四個階段，首先噬菌體與乳酸菌表面發生非特異性吸附，該過程有可逆性，受外界條件的影響，如pH值和溫度；然后噬菌體尾部與細菌表面受體發生特異性共價結合，這一過程不可逆，決定噬菌體宿主的特異性[17]。吸附結束后，經過擠壓將DNA注入宿主細胞，其外殼多留在細菌表面。在噬菌體DNA進入宿主細胞后，DNA通過控制宿主細胞基因的復制而轉錄噬菌體基因，并翻譯噬菌體蛋白，使子代噬菌體裝配完整。在宿主細胞完成大量子代噬菌體裝配后，噬菌體產生的溶菌素酶溶解細胞，從而釋放噬菌體。

1.3.3 乳酸菌噬菌體基因組概況

由于噬菌體基因組小，較易測序，在基因組測序中表明，大多數噬菌體含有前噬菌體，噬菌體基因組學對研究抗噬菌體菌株以及噬菌體檢測都具有重要意義，基因組序列信息逐年呈上升趨勢。乳球菌噬菌體全基因組序列占已知乳酸菌噬菌體序列較大部分，目前已公布于GenBank中的乳酸菌噬菌體基因組共131個，其中34個乳桿菌噬菌體基因組，87個乳球菌噬菌體基因組，10個前噬菌體[1]。乳酸菌噬菌體均為有尾雙鏈DNA噬菌體，基因組大小在18～55 kb之間，鳥嘌呤（G）和胞嘧啶（C）所占的比例從37%～48%，與宿主基因組相當。嗜熱鏈球菌噬菌體都是長尾噬菌體，且所有已知的嗜熱鏈球菌具有DNA同源性，而乳桿菌噬菌體全基因序列研究較少，已知噬菌體基因組均為雙鏈線性DNA分子。

2 PCR方法檢測乳酸菌噬菌體

西班牙、阿根廷、白俄羅斯等國家都對重要的乳制品菌株的噬菌體進行了研究[10,18-19]。在這些研究中，主要研究了乳球菌、乳桿菌噬菌體的應用過程。目前檢測乳酸菌噬菌體的方法多使用雙層瓊脂平板法和通量血細胞計數[13,20-21]。雙層瓊脂平板法原理是使單個噬菌體侵入處于生長繁殖階段宿主細胞,經過若干代生長繁殖后才能形成肉眼能判斷的溶菌斑，同溶菌斑周圍的宿主細胞也要經若干代生長繁殖才能顯出較高密度把溶菌斑襯托出來，這個過程需要8～12 h以上。此種方法操作簡單，但是需要使用相應的敏感菌株，在噬菌體感染初期無法顯示噬菌斑，并且所需時間較長。通量血細胞計數法操作簡單，但是結果不夠準確，且耗時較長。

聚合酶鏈式反應是一種在生物體外用于特殊DNA復制的分子生物學技術，可以放大并擴增特定DNA片段。PCR方法主要是能夠使微量DNA大幅擴增。美國Mullis在1983年最初提出假想，在1985年完成了聚合酶鏈反應的發明，這標志著PCR技術的誕生。如今，PCR已發展到第三代技術。臺籍科學家錢嘉韻在1973年發現了穩定的Taq DNA聚合酶，將PCR技術的基礎性研究帶到了一個新的高度。DNA提取的質量和濃度是PCR檢測的關鍵，提取方法是實驗能否成功的一個關鍵性因素[22]。目前，PCR方法已成功應用于噬菌體的檢測。

2.1 普通PCR

2006年，廖威等使用PCR方法檢測蘇云金桿菌的溶原性噬菌體根據蘇云金桿菌(Bacillus thuringiensis, B.t)溶原性噬菌體GIL01(GenBank Accession Number: AJ536703)的同源序列設計出一對引物，將35株生產菌株MZ1(血清型H3a3b)和B.t標準菌株活化后作模板，其中16株菌株包括MZ1擴增出約750 bp的預期產物[23]，通過噬菌斑實驗，證明這16株菌株中的生產菌株MZ1為溶原菌噬菌體。從而證明PCR方法鑒定蘇云金桿菌溶原性的可行性。

通過對指示菌法、直接電鏡法和DNA鑒定法的比較，證明PCR方法檢測噬菌體靈敏度更高，且快速簡潔。目前，利用PCR方法已經成功檢出牛奶或乳清中的乳球菌屬、乳桿菌屬、鏈球菌屬噬菌體，最低檢出限為103PFU/mL，普通PCR方法檢出限為104～107PFU/mL[24-29]。

目前選育的乳酸菌益生菌菌株種類繁多，益生菌逐漸受到大眾的喜愛和認可，但是這種益生菌菌株較普通菌株感染噬菌體的風險大大增加，這嚴重影響了益生菌酸奶的生產[30]。尤其是烈性噬菌體的存在，可以快速裂解益生菌菌株，所以，PCR方法以其快速準確的特點而成功應用于益生菌菌株噬菌體的檢測。AnaG.Binetti等利用聚合酶鏈式反應即PCR方法檢測干酪乳桿菌和副干酪乳桿菌噬菌體[31]。在基因數據庫中只有φA2和φAT3的全基因序列，所以選取特異性基因片段設計引物。該方法的最低檢測限位104PFU/mL，可以檢測原料乳、發酵乳以及奶酪乳清中干酪和副干酪菌株噬菌體的存在。這種方法可以用于工業生產中的批量檢測，在污染初期即可以檢測到噬菌體的存在，對益生菌發酵行業有意義。

2.2 RT-PCR

病毒的核酸多為RNA，噬菌體是病毒的一種，利用PCR技術檢測遺傳物質為RNA的病原體，需要將RNA反轉錄成cDNA，再以此為模板進行擴增，即RT-PCR[32]。代小英等比較了實時熒光RT-PCR和普通RT-PCR檢測噬菌體MS2的差異[33]，將噬菌體MS2復制酶基因和衣殼蛋白基因利用實時熒光一步RT-PCR法和普通的兩步RT-PCR法分別進行檢測，從而對兩種方法的檢測靈敏度和特異性進行比較。結果表明，普通的兩步RT-PCR法特異性強于熒光一步RT-PCR法，但后者的靈敏度比前者高104倍。RT-PCR應用于RNA類型的病毒檢測，該方法靈敏度高，特異性強。由于大部分乳酸菌噬菌體遺傳物質為DNA，所以PT-PCR應用到乳酸菌噬菌體的檢測尚未見報道。

2.3 熒光定量PCR

Daniel C.Edelman利用熒光定量PCR檢測和量化在溶菌產物DNA純化之前的噬菌體[34-36]。首先在噬菌體下面發現了一個點狀單元，檢測純化DNA樣本，至少有89種病毒。使用熒光定量PCR對未知濃度的噬菌體制劑進行評估，靈敏度和精密度大大提高。Mai Huong在2011年利用熒光定量PCR的方法定量檢測乳清中的噬菌體c2,936和P335[37]。采集法國三個農場的山羊奶樣本，在普通PCR的基礎上將各項反應條件進行優化。實時定量PCR的一個難點是原料乳中DNA提取的優化，需提取出最大量病毒基因組和消除壓抑PCR反應，引物PCR條件的選擇也很重要。使用非特異性綠色熒光染料SYBR直接檢測和量化三組噬菌體。設計特異性引物，然后建立熒光PCR標準曲線，定量測定樣品中的噬菌體濃度，得出的Ct值對應于標準曲線[38]。該方法可以對乳酸菌噬菌體進行定量檢測，從而可以更有效的殺滅噬菌體，但是該方法成本較高，需要專業的操作人員，不能區分噬菌體是否滅活，難以應用于實際生產中的檢測，可將傳統方法與該方法結合，從而降低成本，并達到定量檢測的要求。

2.4 多重PCR

多重PCR的原理是同時將多對特異性引物加入反應體系中，同時擴增出多條大小存在明顯差異的目的DNA片段，根據產物的片段大小或利用分子雜交實現多病原的同時檢測[39]。

S Labrie在2000年利用多重PCR檢測乳酸菌噬菌體936、c2和P33，在一個反應中選取三段特異性片段，分別設計引物[40]。BD Rio在2007年利用多重PCR監測發酵乳生產過程，檢測德式乳桿菌噬菌體3種、乳鏈球菌噬菌體和乳酸菌噬菌體，用噬菌體基因組序列和守恒的區域來設計五對引物[41]，分別對應上面的噬菌體，引物設計生成特定片段的大小取決于基因的特異性。該方法可以檢測到在未經發酵牛奶中的噬菌體，根據所設計的引物可以檢測多個噬菌體，是PCR方法應用于噬菌體檢測的一大進步。

3 結論

迄今為止，在乳制品行業中，噬菌體感染乳酸菌仍然是一個嚴重的問題，相關人員一直在竭盡所能的進行防治、檢測和治理噬菌體污染問題，已經取得一定的成果，但是仍然有噬菌體污染情況偶有發生，尤其是我國無論是生產環境還是檢測方法都較國外存在一定差距。目前，我國檢測噬菌體的方法大多停留在傳統噬菌斑法，檢測時間較長，而分子生物學方法檢測時間短，效率高，是噬菌體檢測行業的福音，但是該方法成本相對較高，并不適用于工廠中的批量檢測，如何降低檢測成本，使之適合于實際生產中的檢測，是接下來的研究重點。

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Research progress on Lactic acid bacteria phage and its PCR detection

ZHU Lianggong1,GUAN Songmei2,3,LIU Haiyan3,WANG Dan1,ZHANG Yun2
（1.Green Food Science Research Institute of Heilongjiang,Harbin 150028,China;2.East College of Heilongjiang Har?bin 150086,China;3.Technology Center,New Hope Dairy Co.,Ltd.,Chengdu 610016)

This paper describes some methods of detecting phage using PCR technology,which aims to provide reference for relevant re?searchers and lay the foundation for monitoring phage pollution in dairy industry.

Lactic acid bacteria;phage;molecular biology;detection

TS252.7

：B

：1001-2230（2017）06-0035-04

2016-12-24

朱良工(1961-),男,研究員級高級工程師,從事乳品加工方面的研究。

張筠