不同癲癇發作類型發作間期和發作后血清ATP ADP及AMP水解率的動態變化

吳艷芝 喬 芳 趙美英 李海靜 張雪蓮 滕軍放(通訊作者)

1)鄭州大學附屬中心醫院 鄭州 450042 2)鄭州大學第一附屬醫院 鄭州 450000

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不同癲癇發作類型發作間期和發作后血清ATP ADP及AMP水解率的動態變化

吳艷芝1)喬 芳1)趙美英1)李海靜1)張雪蓮1)滕軍放2)(通訊作者)

1)鄭州大學附屬中心醫院 鄭州 450042 2)鄭州大學第一附屬醫院 鄭州 450000

目的 探討不同癲癇發作類型發作間期和發作后血清ATP、ADP和AMP水解率的變化。方法 選擇2014-03—2015-12我院神經內科收治的癲癇患者65例(全面性發作組33例，復雜部分性發作組32例)，收集同期在我院門診進行常規體檢的正常人員35例為健康對照組，采用紫外線吸收分光光度法，觀察病例組癲癇發作后5、10、20、30、60 min和10 h時的ATP、ADP和AMP水解率變化情況，并與健康對照組比較；觀察全面性發作組和復雜部分性發作組癲癇發作后5、10、20、30、60 min和10 h時的ATP、ADP和AMP水解率變化情況，并進行比較；采用SPSS 21.0 版本統計學軟件進行數據處理。結果 病例組發作間期ATP水解率、ADP水解率、AMP水解率與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)；發作后5min時ATP水解率、ADP水解率、AMP水解率均明顯升高，其中ATP水解率在發作后20 min達峰值，之后逐漸下降，至發作后10 h恢復至發作間期水平；ADP水解率、AMP水解率在發作后5 min達峰值，隨后逐漸下降，至發作后60 min即恢復至發作間期水平；全面性發作組和部分性發作組相比，癲癇發作后5 min，20 min血清ATP水解率、ADP水解率、AMP水解率升高更為顯著(P<0.05)。結論 癲癇發作后腺苷酸水解率明顯升高，全面性發作患者與部分性發作患者相比，腺苷酸水解率升高更為明顯。

癲癇發作；三磷酸腺苷二磷酸水解酶；胞外三磷酸腺苷酶；5’-核苷酸磷酸二酯酶；胞外-5’-核苷酸酶

癲癇是所有神經系統疾病中的五大難治性疾病之一，全世界有數千萬癲癇患者，如果得不到有效控制，癲癇反復發作給患者和家庭、社會帶來沉重的心理負擔和經濟負擔。大腦神經元異常放電是各種癲癇發作的病理基礎，任何引起腦神經元異常放電的因素都可誘發癲癇發作[1]。近期，許多學者對癲癇病因、發病機制及病理改變和治療方法進行了研究，并取得了較大進展。目前普遍認為，癲癇發生與突觸重塑、神經遞質受體、神經膠質細胞、離子通道、遺傳因素、苔蘚纖維發芽等多方面均密切相關[2]。但癲癇發作的詳細機制尚未明確，癲癇每次的發作是如何開始和如何終止的，具體的機制也未見明確闡明。

近期研究表明，腺苷系統是腦組織中十分重要的抗癲癇和腦保護系統。腺苷系統主要通過腺苷與G蛋白偶聯腺苷受體結合發揮作用來抑制腦組織內的神經元活性，急性癲癇發作后早期腺苷水平顯著升高，發作后一段時間腺苷恢復原有水平，因而，該系統被視為“內源性抗癲癇系統”。人血循環中存在可溶性核苷酸，這是血清具有水解腺苷酸作用的基礎，特別是ATP在可溶性磷酸二酯酶作用下生成AMP和無機焦磷酸，ADP在三磷酸腺苷二磷酸水解酶(NTPDase)作用下生成AMP和無機磷酸，而AMP在可溶性5’-核苷酸酶作用下水解生成腺苷[3]。目前，癲癇發作后，患者血清ATP、ADP及AMP水解率改變的相關報道比較少見。不同癲癇發作類型的血清ATP、ADP及AMP水解率改變是否相同未見報道。本研究通過測定不同癲癇發作類型發作前后不同時間點血清ATP、ADP及AMP水解情況，以探討腺苷酸酶活性與癲癇發作的關系。

1 資料與方法

1．1 一般資料 收集2014-03—2015-12我院神經內科收治的癲癇患者65例，男40例，女25例；年齡12～69(30.5±10.4)歲；病程2～35(9.1±2.8)a；特發性癲癇5例，癥狀性癲癇28例，隱源性癲癇32例；全面性發作33例，部分性發作32例(包括簡單部分性發作19和復雜部分性發作13例)，其中全面性發作主要指全面性強直陣攣發作，不包括失神發作、肌陣攣發作等；抗癲癇藥物單藥治療24例，聯合治療41例。所有患者進行24 h動態腦電圖檢查，監測癲癇發作的電生理特征，同時行頭顱MRI檢查。排除有傳染病或炎癥性疾病、肝腎功能不全、腎上腺皮質或下丘腦垂體異常疾病、代謝性疾病、心血管疾病、急性嚴重的神經疾病；排除偏頭痛、暈厥、熱性驚厥、短暫性腦缺血以及不能確定為癲癇的其它發作性事件。另外收集同期在我院門診進行常規體檢的正常人員35例為健康對照組，均無癲癇、神經系統疾病、心腦血管疾病等，其中男21例，女14例，年齡13～68歲(25.6±7.82)歲。各組性別、年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1．2 診斷標準 根據國際抗癲癇聯盟(ILAE)2005年提出的癲癇診斷標準：癲癇是一種中樞神經系統疾病，是腦組織存在持續的引起癲癇反復發作的易患性因素，及因這種發作而產生神經生物、認知、心理和社會的后果，癲癇確診需癲癇發作≥2次，而且結合病史、腦電圖、影像學等由癲癇專科醫師診斷。

1．3 方法

1．3．1 試驗試劑和試驗儀器：ATP(上海鼓臣生物技術有限公司)，ADP(上海鼓臣生物技術有限公司)，AMP(上海鼓臣生物技術有限公司)，三羥甲基氨基甲烷(上海純優生物科技有限公司)，三氯醋酸(上海江萊生物技術有限公司)，分光光度計(上海精密儀器儀表有限公司)，PH計(上海精密儀器儀表有限公司)。

1．3．2 標本采集：待測者均在早晨晨起抽取空腹肘部靜脈血5 mL，抽血前安靜休息 60 min。癲癇患者在肘部靜脈處留置靜脈針，第一次采血前12 h無癲癇發作，癲癇發作后5、10、20、30、60 min和10 h分別采集血樣5 mL。并用標簽標記好每個血樣試管。將血樣置于室溫下30～60 min后，4℃離心15 min(3 000 r/min)，獲得上層血清加入Eppendorf管，置于70℃冰箱內保存備用。

1．3．3 ATP、ADP和AMP水解率的測定：根據相關文獻資料提出的ATP、ADP、AMP水解率測定法(紫外吸收分光光度法)測定。即將內含5 mmol/L 二氯化鈣和44 mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸溶液175 μL，調節pH值至8.0，加入血清5μl，在37℃下培育10 min。加入ATP或ADP或AMP(測定AMP時調節pH至7.2)10 μL，使其濃度為1.0 mmol/L，在37℃下培育10 min，加入10%三氯醋酸200 μL終止反應，放置于630 nm波長處測定吸光度，每個血樣均測定3次，計算每1 mL血清每分鐘釋放的無機磷酸鹽(nmol)量即為酶活性。

2 結果

2．1 腦電圖檢測情況 65例癲癇患者均行24 h動態腦電圖檢測，其中48例可見癲癇樣放電波，包括棘波、尖波、尖慢綜合波、多棘波、棘慢綜合波、多棘慢綜合波，余下17例無癲癇樣放電波。顱腦MRI檢查有26例發現異常，其中7例腦內軟化灶，12例腦萎縮，4例海馬硬化，其他顱內病變3例。65例癲癇患者中，顱腦外傷史7例，顱腦手術史2例，腦血管史4例，顱內感染史7例。

2．2 全面性發作組不同時間點ATP水解率、ADP水解率、AMP水解率變化與部分性發作組ATP水解率、ADP水解率、AMP水解率比較情況 全面性發作組在發作間期ATP水解率、ADP水解率、AMP水解率與部分性發作組比較無統計學差異(P>0.05)；發作后5min全面性發作組較部分性發作組ATP水解率、ADP水解率、AMP水解率均明顯升高，其中ATP水解率在發作后20 min達峰值，之后逐漸下降，至發作后10 h恢復至發作間期水平；ADP水解率、AMP水解率在發作后5min達峰值，隨后逐漸下降，至發作后60 min即恢復至發作間期水平。見表1、圖1、圖2、圖3。

表1 2組不同時間點ATP水解率、ADP水解率、 AMP水解率變化比較

注：與部分性發作組比較，▲P<0.05

圖1 全面性發作和部分性發作后ATP水解率不同時間點變化情況比較(nmol/mL·min)

患者發作后5 min，ATP水解率明顯升高，發作后20 min達峰值，發作后60min時仍高于發作間期，發作后10 h恢復至發作間期水平。全面性發作組癲癇發作后ATP水解率明顯高于部分性發作組(P<0.05)。

圖2 全面性發作和部分性發作后ADP水解率在不同時間點變化情況(nmol/mL·min)

患者發作后5 min，ADP水解率明顯升高且達峰值，隨后逐漸降低，發作后60 min 時恢復至發作間期水平；全面性發作組癲癇發作后ADP水解率明顯高于部分性發作組(P<0.05)。

圖3 全面性發作和部分性發作后AMP水解率在不同時間點變化情況(nmol/mL·min)

患者發作后5 min，AMP水解率明顯升高且達峰值，隨后逐漸降低，發作后60 min 時恢復至發作間期水平；全面性發作組發作后AMP水解率明顯高于部分性發作組。

3 討論

腺苷酸如ATP、ADP、AMP及其衍生物腺苷(ADO)在某些生理和病理過程中均為重要的信號分子。據報道，腺苷既是一種有效的抗驚厥劑，又有一定的神經保護作用。單嶠等[4]對用致驚厥藥誘導的癲癇發作間期和發作時的大鼠進行研究發現，發作早期海馬內腺苷水平明顯增高，提示癲癇可引起大鼠海馬對腺苷的釋放增加，且進一步研究發現，腺苷A1受體激動劑和腺苷可有效保護急性注射戊四氮誘發癲癇發作的大鼠，防止其癲癇發作。以上研究結果均提示內源性腺苷可能有抗驚厥和保護神經作用。實驗表明，癲癇發作可使腦組織腺苷濃度增加，在大多數病理條件下，和人體血循環中腺苷濃度急速增加相關[5]。一項實驗研究發現，癲癇大鼠海馬和腦皮質突觸小體內出現ATP二磷酸水解酶和5’-核苷酸酶活性增強[6]。腺苷還可通過突觸前A1受體抑制各種神經遞質的釋放，特別是興奮性谷氨酸的釋放，來抑制神經元的活性，這是其抑制神經活性的第2個途徑[7]。

根據本研究結果，癲癇患者發作后血清ATP、ADP、AMP水解率明顯升高，推測可能是通過增加具有抗驚厥作用的腺苷含量而使癲癇發作終止，由于目前大多數癲癇發作無法被醫生所預見，且暈厥、假性癲癇發作與癲癇發作難以鑒別，故通過測定患者血清ATP、ADP、AMP水解率可能利于臨床癲癇發作的診斷和鑒別診斷。本研究還發現，全面性發作組和復雜部分性發作組患者相比，ATP、ADP和AMP的水解率均顯著升高；進一步推測作用于腺苷酸酶靶點的藥物可能對全面性發作更為有效。

[1] 王學峰．難治性癲癇的發病機制[M]．上海：上海科學技術出版社，2002：27-30．

[2] Canafoglia L，Franceschetti S，Antozzi C．Epileptic phenotypes associated with mitochondrial disorders[J]．Neurology，2001，56(10)：1 340-1 346．

[3] Williams-Karnesky RL，SandauUS，Lusardi TA．Epigenetic changes induced by adenosine augmentation therapy prevent epileptogenesis[J]．J Clin l Invest，2013，71(8)：3 552-3 563．

[4] 單嶠，王世勛，李培棟．老年癲癇發作患者腺苷及腺苷酸酶動態表達[J]．中國老年學雜志，2013，61(22)：5 517-5 519．

[5] L?scher W，Brandt C．Prevention or modification of epileptogenesis after brain insults：experimental approaches and translational research[J]．Pharmacol Rev，2010，62(4)：668-700．

[6] Perea G，Navarrete M，Araque A．Tripartite synapses：Astrocytes process and control synaptic information[J]．Trends Neurosci，2009，32(8)：421-431．

[7] 付艷平．王雪瑩．付立波，等．腺苷對正常家兔頸總動脈血壓的影響及機制[J]．山東醫藥，2012，44(1)：61-62．

(收稿2016-07-11)

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