高壓氧聯合依達拉奉對大鼠腦梗死區AQP9的影響

宋乃光 孫晶晶(通訊作者) 張耀龍 孫彩悅 薛 建 李海鵬 賀永貴 習瑾琨 張國彬

河北唐山市協和醫院 1)急診科 2)神經內科 3)B超室 唐山 063000 4)河北聯合大學培養辦公室 唐山 063000

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高壓氧聯合依達拉奉對大鼠腦梗死區AQP9的影響

宋乃光1)孫晶晶2)(通訊作者) 張耀龍1)孫彩悅2)薛 建2)李海鵬3)賀永貴4)習瑾琨4)張國彬4)

河北唐山市協和醫院 1)急診科 2)神經內科 3)B超室 唐山 063000 4)河北聯合大學培養辦公室 唐山 063000

目的 探討高壓氧聯合依達拉奉對腦梗死大鼠AQP9表達及腦水腫的影響。方法 建立老年SD大鼠大腦中動脈閉塞(MCAQ)模型，隨機分為4組：對照組、依達拉奉組、高壓氧組和聯合組，每組20只。對各組大鼠進行神經功能評分，檢測大鼠腦組織內AQP9基因及蛋白的表達、梗死腦組織的含水量，并進行HE染色，觀察病理學變化。結果 各組大鼠神經功能缺損評分比較顯示，聯合組明顯低于對照組、依達拉奉組及高壓氧組；RT-PCR及Western blot檢測表明，聯合組AQP9的mRNA蛋白表達及梗死區腦組織含水量明顯低于腦梗死組、依達拉奉組及高壓氧組(P<0.05)；HE染色結果顯示，高壓氧組、依達拉奉組較對照組炎性浸潤及水腫減輕，聯合組比高壓氧組、依達拉奉組又有明顯緩解。結論 高壓氧聯合依達拉奉治療可促進腦梗死大鼠神經功能的恢復。

腦梗死；高壓氧；依達拉奉；腦水腫；AQP9

腦梗死是嚴重威脅人們身體健康的一種腦血管疾病，多見于老年患者，近些年來發病率逐漸上升，發病年齡也逐漸年輕化[1-2]。目前醫學界對腦梗死的有效預防及治療仍是重要的研究課題。多項研究結果均表明，興奮性氨基酸、自由基、Ca2+超載等在腦組織的缺氧缺血損害中發揮著重要作用[3-5]。依達拉奉作為一種治療腦梗死的新型自由基清除劑，國內外大量實驗及臨床研究均證明了其治療腦梗死的安全性及有效性[6]。隨著科學技術的進步，高壓氧作為一門獨立學科，可對多種疾病產生治療作用，與其他方法聯合應用會具有更好的療效[7-9]。本實驗旨在探討高壓氧聯合依達拉奉對腦梗死老年SD大鼠AQP9表達及腦水腫的影響，現報道如下。

1 材料和方法

1．1 材料 (1)設計：隨機對照動物實驗。(2)時間及地點：2014-01—2015-02，于華北煤炭醫學院實驗室完成。(3)實驗動物：健康老年SD大鼠83只，鼠齡：24個月，雌雄不限，體質量250～600 g，于恒溫下飼養，自由飲水和進食，實驗前1 d禁食不禁水。本實驗中對動物模型的處置方法以動物倫理學為依據。83只老年SD大鼠購自華北煤炭醫學院動物實驗室，動物質量合格證號：SCXK﹙京﹚2009-0004。主要試劑、儀器及來源見表1。

1．2 實驗方法

1．2．1 動物模型的建立和分組：將83只老年SD大鼠以4%異氟醚吸入麻醉，均保留自主呼吸。取頸部正中作一縱行切口，逐層分開，游離右側的頸總及頸內、頸外動脈，于頸總動脈近端分叉處作一“V”字形切口，將多聚賴氨酸處理過的1.8#魚線經切口插入右頸內動脈[進線深度(18±0.5 mm)]，阻斷大腦中動脈起始段的所有血液供應，建立大鼠腦梗死模型。成功的模型標志為大鼠出現右側Horner征。分組：將83只大腦中動脈阻塞(MCAQ)大鼠模型按隨機區組設計分成4組：對照組、依達拉奉組、高壓氧組和聯合組，每組均為20只。于腦梗死組大鼠尾靜脈注射PBS；依達拉奉組靜滴依達拉奉30 mg，2次/d；高壓氧組進行高壓氧治療1次/d，壓力：0.22 MPa，時間：80 min；聯合組使用依達拉奉聯合高壓氧治療，共治療21 d。

1.2.2 大鼠mNSS神經行為學功能評分：本實驗采取改良神經功能缺損評分內容及標準(mNSS)：評分內容包括運動、感覺、反射和平衡4個部分的評分，總分共18分，正常大鼠評分0分，評分越低，說明大鼠的神經行為學功能越好，反之，神經功能障礙越嚴重。本實驗分別對各組大鼠在治療后的1周、2周及3周進行了mNSS評分，以分值為10～12分的大鼠進入實驗。

1．2．3 RT-PCR檢測：AQP9-mRNA 的表達：于治療后10 d分別在各組中隨機取5只大鼠的腦梗死組織50 mg，制備勻漿，應用Trizol試劑[10]提取腦梗死組織總的RNA ，應用紫外分光光度儀測定RNA含量，按照M-MLV 試劑盒中步驟，將RNA 反轉錄為cDNA，再將cDNA 進行PCR，AQP9(305 bp)引物序列：上游5′-CCAGCTGTGATTCCAAAACGGAC-3′，下游5′-TCTAGTCATACTGAAGACAATACCTC-3′；β-actin(175 bp)上游5′-CCATCATGAAGTGTGACGTTG-3′，下游5′-ACAGAGTACTTGCGCTCAGGA-3′。取PCR擴增產物進行電泳，采用凝膠圖像分析系統對電泳結果進行光密度分析，計算AQP9產物與β-actin產物的光密度積分比值，作為AQP9-mRNA 的表達。

表1 主要試劑、儀器及來源

1．2．4 Western Blot檢測：AQP9-蛋白的表達：于治療后10 d將上述RT-PCR的提取物離心30 min，取上清為粗體蛋白質，以Bradford法對AQP9-蛋白進行濃度測定。以5%濃縮膠40 V持續衡壓1 h，以10%分離膠60 V持續恒壓3.5 h，濕轉14 V持續恒壓14 h，于37 ℃下搖床封閉2 h，再進行3次10 min的洗膜，以1：200 比例將AQP9單克隆抗體稀釋溶于TBST 中，室溫下培育60 min；采用TBST洗滌緩沖液行3次10 min的洗膜后，置入1：500稀釋的辣根酶標記的兔抗鼠抗體。于室溫下培育60 min；用TBST行3次10 min的洗膜。通過TBS洗膜10 min后再行DAB顯色，以Bio-Rad 凝膠成像分析系統掃描吸光度值，應用Quantity One軟件分析，根據β-actin條帶與目的條帶的吸光面積比值測量蛋白的表達水平。

1．2．5 HE染色：腦梗死模型建立后3 d、10 d，在各組內隨機取5只大鼠，水合氯醛麻醉下處死，取梗死處腦組織置于10%多聚甲醛液中，室溫下固定24 h。用切片機進行腦組織標本皮層連續冠狀切片，片厚3～4 μm，置60 ℃烤箱內恒溫4～6 h，使切片緊密黏附，常規脫蠟后蒸餾水洗2 min，伊紅染色1～2 min，中性樹脂膠封片，于室溫下干燥，熒光顯微鏡觀察腦組織病理學形態變化，以證實恢復程度。

1．2．6 應用干濕比重法測量腦組織含水量：將梗死腦組織放置于稱重過的鋁箔上測得標本質量，用所測得質量減鋁箔質量即為腦質量，將以鋁箔包好的腦組織置于恒溫烤箱內烘干(恒溫烤箱溫度95 ℃，時間24 h)，烘干后取出腦組織，待其自然降溫恢復到室溫后所測得的質量即為腦干質量，按干濕比重法，求出腦組織含水量。腦組織含水量(%)=(腦濕質量-腦干質量)/腦濕質量×100%。

2 結果

2．1 大鼠神經行為學功能評分比較 于治療后3周，進行大鼠神經功能缺損評分比較，高壓氧組及依達拉奉組的神經功能缺損評分明顯低于對照組，而聯合組又明顯低于高壓氧組及依達拉奉組，各組間比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表2、圖1。

表2 各組大鼠不同時間點的神經功能評分±s)

注：聯合組的神經功能缺損評分明顯低于其余各組，P<0.05

圖1 各組大鼠不同時間點的神經功能評分

2．2 RT-PCR檢測結果 建立模型后10 d腦梗死周圍組織AQP9 mRNA的表達變化：高壓氧組、依達拉奉組明顯低于對照組，聯合組又明顯低于高壓氧組、依達拉奉組，各組間差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 AQP4-mRNA 的表達

2．3 Western blot檢測結果 建立模型后10 d腦梗死周圍組織AQP9蛋白的表達變化：高壓氧組、依達拉奉組明顯低于對照組，聯合組又明顯低于高壓氧組、依達拉奉組，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 AQP4-mRNA 電泳圖

2．4 HE染色觀察結果 HE染色后，鏡下觀察到：對照組病理切片：梗死灶可見許多蒼白球樣改變、可見開始增生的膠質細胞以及形成的膠質瘢痕，局部出現液化變軟病灶，水腫周圍腦組織有炎性細胞浸潤，腦組織水腫明顯。見圖4A。高壓氧組、依達拉奉組病理切片：水腫、炎性細胞浸潤減輕，增生的膠質細胞以及膠質瘢痕開始減輕，軟化灶和組織瘢痕小于腦梗死組，但大于聯合組。見圖4B、C。聯合組病理切片顯示：炎性細胞浸潤顯著減輕，膠質瘢痕進一步減少，軟化灶消失，蒼白球樣梗死灶明顯減輕，水腫幾乎消失。見圖4D。

圖4 A：可見增生的膠質細胞、膠質瘢痕，局部軟化病灶；B、C：增生的膠質細胞以及膠質瘢痕及水腫減輕；D：梗死灶明顯減輕，腦組織水腫幾乎消失

2．5 各組梗死腦組織的含水量比較 腦梗死組內的大鼠在各時間點的腦組織水腫程度比較，差異無統計學意義(P>0.05)，高壓氧組、依達拉奉組與對照組在不同時間點腦組織水腫程度比較有差異統計學意義(P<0.05)；聯合組在各時間點梗死區腦組織水腫程度明顯輕于對照組、依達拉奉組及高壓氧組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組在不同時間點大鼠腦組織水腫程度 比較，%)

注：組間比較，P<0.05

3 討論

腦梗死作為神經學科常見病，具有高病死率、高致殘率等特點[11-12]，早發現、早治療具有重要意義[13-16]。神經保護劑在腦梗死早期治療中是較為有效的一個手段，腦梗死發生后，過度產生的自由基擁有高度的氧化活性，能致使腦細胞發生氧化應激性反應而造成細胞損害甚至死亡[17-22]。依達拉奉作為腦梗死的一種較強的自由基清除劑和神經保護劑，可以通過清除各種自由基、減輕血管內皮細胞的損傷、抑制脂質過氧化、降低腦組織因缺氧及再灌注導致的損害等多種作用機制中發揮神經元保護作用。

高壓氧在多種疾病的治療中具有不同程度的治療效應，為各類疾病的治療開拓了廣闊的空間，近年報道較多[23-26]。研究表明[27-29]，高壓氧可通過促進溶栓、減輕炎性反應、提高腦組織氧張力、提高毛細血管間的氧分壓梯度、減輕腦梗死灶細胞凋亡、促進氧自由基的清除能力等以上多種途徑產生促使腦神經功能恢復的作用[30]。高壓氧以其特殊的、無可比擬的供氧形式，能夠促使缺氧腦組織的血氧含量迅速增加到正常情況的十幾倍，進而快速調整機體氧化-抗氧化系統的平衡。

本研究中將依達拉奉與高壓氧聯合應用，從對老年SD大鼠的治療效果中觀察到，聯合組大鼠神經功能學評分明顯優于對照組、依達拉奉組及高壓氧組，表明二者聯合應用效果大于單獨應用；RT-PCR及Western blot檢測結果顯示，聯合組中，AQP9的mRNA及其蛋白表達明顯低于腦梗死組、依達拉奉組及高壓氧組，表明依達拉奉和高壓氧均可降低梗死組織中AQP9的mRNA及蛋白的表達，二者的聯合應用使治療效果更佳；聯合組在各時間點梗死區腦組織含水量明顯低于對照組、依達拉奉組及高壓氧組，高壓氧組、依達拉奉組與對照組在不同時間點腦組織含水量比較均差異有統計學意義，提示聯合應用對減輕腦水腫的療效更明顯；HE染色結果觀察到，大鼠腦水腫周圍組織炎性細胞浸潤及水腫情況比較，高壓氧組、依達拉奉組較對照組減輕，聯合組又較高壓氧組、依達拉奉組有明顯緩解，表明依達拉奉和高壓氧對腦組織病理變化都可起到恢復作用，將二者聯合應用后其治療效果更為可觀。

綜上所述，依達拉奉作為一種新型的腦神經保護劑和自由基清除劑，對腦梗死的療效確切。高壓氧的早期應用能延長梗死灶神經細胞的生存能力，二者聯合應用可對老年SD大鼠腦梗死的綜合治療爭取時間，可明顯減輕腦梗死后的腦組織損害，亦能夠更好地促進梗死后腦神經功能的恢復。

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(收稿2016-02-24)

Effects of hyperbaric oxygen combined with edaravone on AQP9 expression andbrain edema in cerebral infarction rats

SongNaiguang*，SunJingjing，ZhangYaolong，SunCaiyue，XueJian，LiHaipeng，HeYonggui，XiJinkun，ZhangGuobin

*DepartmentofEmergency，theUnionHospitalofTangshanCity，Tangshan063000，China

Objective To investigate the effects of hyperbaric oxygen combined with edaravone on AQP9 expression and brain edema in cerebral infarction rats．Methods After establishing models of middle cerebral artery occlusion (MCAQ)in elder SD rats，we divided all rats into four groups：control group，edaravone group，hyperbaric oxygen group and combined group．The neurological functional scores before and after treatment were calculated in each group．The expressions of AQP9 gene and protein in brain tissues of modeled SD rats，and the water content of brain tissues were detecled．HE staining was used for the observation of pathology．Results In terms of the neurological functional scores，combined group showed less scores than control group，and edaravone group and hyperbaric oxygen group．The detections of RT-PCR and Western blotting indicated that the combined group held significantly lower levels of the expressions of AQP9 and less water contents at each time measured in brain tissues compared with the other three groups (P<0.05)．The results of HE staining showed that the combined group got more remission of brain edema and inflammatory cell infiltration than others．Conclusion Hyperbaric oxygen therapy combined with edaravone can promote the recovery of cerebral nerve function．

Cerebral infarction；Hyperbaric oxygen；Edaravone；Brain edema；AQP9

R-332

A

1673-5110(2016)24-0001-04