紅景天苷對(duì)腦缺血再灌注大鼠炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響

魏藝聰，洪海棉，應(yīng)雄，陳建雄，張小琴，洪桂祝

（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建福州350122）

紅景天苷對(duì)腦缺血再灌注大鼠炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響

魏藝聰，洪海棉，應(yīng)雄，陳建雄，張小琴，洪桂祝

（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建福州350122）

目的從炎癥反應(yīng)探討紅景天苷減輕腦缺血再灌注繼發(fā)損傷的早期保護(hù)機(jī)制。方法健康成年雄性SD大鼠36只，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型對(duì)照組、紅景天苷給藥組3組。通過(guò)線栓法制作大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型，采用Longa評(píng)分法對(duì)大鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分，給藥24 h后取材，RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)大鼠患側(cè)腦組織TNF-α、IL-6、IL-1β、MCP-1、MCP-5、MIP-1α與MIP-2等炎癥因子的mRNA表達(dá)，Western blot法檢測(cè)大鼠患側(cè)腦組織iNOS與COX-2蛋白的表達(dá)。結(jié)果與模型對(duì)照組比較，紅景天苷給藥組能明顯降低患側(cè)腦組織TNF-α、IL-6、IL-1β、MCP-1、MCP-5、MIP-1α與MIP-2等炎癥因子的mRNA表達(dá)（P＜0.01），同時(shí)降低iNOS與COX-2蛋白的表達(dá)（P＜0.05）。結(jié)論紅景天苷能夠降低腦缺血再灌注模型大鼠患側(cè)腦組織的炎癥反應(yīng)，并抑制iNOS／NO及COX-2／PGE2炎癥信號(hào)通路有關(guān)。

紅景天苷；腦缺血再灌注；炎性細(xì)胞因子；iNOS／NO；COX-2／PGE2；信號(hào)通路

腦缺血再灌注（MCAO）后引起的炎癥反應(yīng)在腦組織損傷過(guò)程中起重要作用，大量研究表明：腦缺血再灌注后釋放大量炎癥信號(hào)，促進(jìn)炎性細(xì)胞的聚集和炎性因子的釋放，引起腦組織水腫、血腦屏障破壞等，從而加重腦組織的損傷［1］，因此，炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是腦缺血再灌注后腦組織繼發(fā)性損傷的主要機(jī)制之一。有研究表明：iNOS/NO及COX-2/ PGE2信號(hào)通路參與TNF-α、IL-6、IL-1β等多種炎癥基因的調(diào)控，在腦卒中引發(fā)的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，并進(jìn)一步加重神經(jīng)損傷［2-4］。

紅景天苷對(duì)羥基苯乙基-β-D葡萄糖苷，是紅景天的主要活性成分［5］。紅景天是生長(zhǎng)于海拔3 500 m以上的天然植物，在我國(guó)具有悠久的藥用歷史。根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》（2015版），紅景天的功能與主治為“益氣活血，通脈平喘，用于氣虛血瘀，胸痹心痛，中風(fēng)偏癱，倦怠氣喘”。報(bào)道顯示其減少疲勞、提高精神等功效被西方國(guó)家包括瑞典、法國(guó)和德國(guó)等國(guó)家認(rèn)可，紅景天苷具有抗炎、抗氧化和抗凋亡等功能［5］。我們?cè)鴪?bào)道：動(dòng)物造模后連續(xù)6 d紅景天苷給藥后可顯著減少大鼠局灶性腦缺血再灌注大腦的梗死體積和降低腦缺血大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分，具有顯著神經(jīng)保護(hù)作用，而其早期的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制尚不清楚［6-7］。為進(jìn)一步闡明紅景天苷減輕繼發(fā)性損傷的早期神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制，本研究從炎癥反應(yīng)和iNOS/NO及COX-2/PGE2信號(hào)通路研究了紅景天苷減輕腦缺血再灌注繼發(fā)損傷的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康成年雄性SPF級(jí)SD大鼠36只，體質(zhì)量（280±20）g，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司（合格證號(hào)：2007000509960，許可證號(hào)：SCXK（滬）2007-0005），飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。

1.2 主要試劑與受試藥物總RNA提取試劑盒（德國(guó)Qiagen公司，批號(hào)：74106）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒RT試劑盒（美國(guó)Fermentas公司，批號(hào)：K1622）；熒光定量PCR Master Mix（美國(guó)Applied Biosystems公司，批號(hào)：R110 22），PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，TNF-α基因引物：上游序列5'-GCCACCACGCTCTTC-TGTC-3'；下游序列5'-GCTACGGGC TTGTCACTCG-3'，PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為149 bp。IL-6基因引物：上游序列5'-AGACTTCACAGAGGA TACCACCCAC-3'；下游序列5'-CAATCAGAATTGC CATTGCACAA-3'，PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為129 bp。IL-1β基因引物：上游序列5'-ACAAGGAGAGACA AGCAACGACAA-3'；下游序列5'-TTTCCATCTTCT TCTTTGGGTATTG-3'，PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為149 bp。MCP-1基因引物：上游序列5'-CAGGTGTCCCAAAGAAGCTGTAGTA-3'；下游序列5'-AGGTGCT GAAGTCCTTAG GGTTGAT-3'，PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為172 bp。MCP-5基因引物：上游序列5'-ACCAGATTCAGTGTTCACCCCAGT-3'；下游序列5'-GCT GCTTGTGATTTTCCT GTAGCTC-3'，PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為100 bp。MIP-1α基因引物：上游序列5'-GCAGACAGTGGCAGGGATT-3'；下游序列5'-CACCCTTTAGCATCTTTTGGAC-3'，PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為173 bp。MIP-2基因引物：上游序列5'-CAATGCCTGACGACCCTACC-3'；下游序列5'-TTG-GACGATCCTCTGAACC-3'，PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為100 bp。GAPDH引物上游序列5'-CAACGGGAAA CCCATCACCA-3'；下游序列5'-ACGCCA GTAGAC TC-CACGACAT-3'，PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為96 bp。紅景天苷由福建中醫(yī)藥大學(xué)生物醫(yī)藥研發(fā)中心提供，純度為99%；iNOS多克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz公司，批號(hào)：sc-651）、COX2多克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz公司，批號(hào)：sc-23984）、β-actin抗體（碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：H015）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 腦缺血再灌注動(dòng)物模型制作大鼠術(shù)前禁食12 h，自由飲水，腹腔注射10%的水合氯醛（300 mg·kg-1）麻醉，仰臥位固定，將尼龍單絲線栓從左頸總動(dòng)脈插入到大腦中動(dòng)脈的起始端，栓塞后2 h，將線栓拔出致血液再灌注，假手術(shù)組動(dòng)物不栓塞中腦動(dòng)脈。造模過(guò)程中，連續(xù)監(jiān)測(cè)動(dòng)物的溫度，并保持溫度在37℃。根據(jù)Longa［8］評(píng)定法對(duì)造模動(dòng)物進(jìn)行神經(jīng)功能損傷程度評(píng)價(jià)，評(píng)級(jí)達(dá)3～4為模型動(dòng)物，可用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 分組與給藥應(yīng)用隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)方法將36只大鼠分為假手術(shù)組、模型對(duì)照組和紅景天苷給藥組各12只。紅景天苷給藥組在造模成功后，立即腹腔注射紅景天苷（50 mg·kg-1），其余2組腹腔注射同容積的生理鹽水。24 h后，3組動(dòng)物斷頭取腦組織，用于分析。

2.3 神經(jīng)功能損傷評(píng)價(jià)根據(jù)Longa評(píng)定法［8］，0級(jí)：無(wú)缺陷；1級(jí)：不能伸展對(duì)側(cè)前肢；2級(jí)：對(duì)側(cè)前肢屈曲；3級(jí)：輕度向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；4級(jí)：嚴(yán)重的轉(zhuǎn)圈；5級(jí)：對(duì)側(cè)癱瘓。

2.4 TNF-α、IL-6、IL-1β、MCP-1、MCP-5、MIP-1α與MIP-2檢測(cè)按照QIAGEN RNeasyMini Kit試劑盒提取總RNA，用Fermentas的RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，建立qPCR體系為20 μL，反應(yīng)條件為50℃2 min，95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，退火58℃15 s，聚合72℃20 s 40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，以2-ΔΔCt法計(jì)算各組間mRNA的表達(dá)量。

2.5 Western blot檢測(cè)大鼠患側(cè)腦組織iNOS與COX-2的蛋白表達(dá)提取總蛋白，總蛋白經(jīng)SDSPAGE垂直板全濕法電泳法分離后，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用封閉液封閉2 h后加入稀釋的一抗（iNOS多克隆抗體1∶800，COX-2多克隆抗體1∶500，β-actin單克隆抗體1∶3 000），4℃下孵育過(guò)夜，次日TBS洗3遍，每次10 min，加入1∶1 000稀釋HRP標(biāo)記的第二抗體，室溫下孵育2 h后，TBS洗3遍，每次10 min。之后加ECL顯色劑經(jīng)凝膠成像分析系統(tǒng)檢測(cè)，分析目標(biāo)條帶的灰度值，以目標(biāo)蛋白與β-actin的灰度值比值作為目標(biāo)蛋白的相對(duì)量，并統(tǒng)計(jì)各組之間的差異。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以x±s表示，各組數(shù)據(jù)間的差別用ANOVA方法分析。

3 結(jié)果

3.13 組患側(cè)腦組織TNF-α、IL-6與IL-1β等炎癥細(xì)胞因子mRNA表達(dá)比較見(jiàn)圖1。

3.23 組患側(cè)腦組織MCP-1、MCP-5、MIP-1α與MIP-2等趨化細(xì)胞因子mRNA表達(dá)比較見(jiàn)圖2。

3.33 組患側(cè)腦組織iNOS與COX-2蛋白表達(dá)比較見(jiàn)圖3和圖4。

4 討論

缺血性腦卒中由于局部區(qū)域血流不足，引起興奮性毒性，氧化應(yīng)激，鈣超載等一系列早期事件，從而激活膠質(zhì)細(xì)胞分泌TNF-α、IL-6與IL-1β等促炎性細(xì)胞因子，MCP-1、MCP-5、MIP-1α與MIP-2等趨化因子等炎癥介質(zhì)，導(dǎo)致血液來(lái)源的炎性細(xì)胞，包括中性粒細(xì)胞、T細(xì)胞、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞等，滲透到腦缺血區(qū)域，浸潤(rùn)的白細(xì)胞進(jìn)一步釋放這些細(xì)胞因子和趨化因子，引起神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的進(jìn)一步活化，從而產(chǎn)生炎癥信號(hào)級(jí)聯(lián)擴(kuò)大反應(yīng)，釋放各種細(xì)胞毒性成分，破壞血腦屏障，進(jìn)一步加重免疫損傷和神經(jīng)元死亡等晚期事件。總之，TNF-α、IL-6、IL-1β、MCP-1、MCP-5、MIP-1α與MIP-2等炎癥介質(zhì)對(duì)腦卒中后炎性損傷具有重要作用［1-4］。因此，有效抑制腦卒中后TNF-α、IL-6與IL-1β等促炎性細(xì)胞因子，MCP-1、MCP-5、MIP-1α與MIP-2等趨化因子等炎癥介質(zhì)的表達(dá)，有助于抑制腦卒中后炎性損傷。我們的研究結(jié)果表明，腦缺血后紅景天苷具有抑制TNF-α、IL-6與IL-1β等促炎性細(xì)胞因子及MCP-1、MCP-5、MIP-1α與MIP-2等趨化因子表達(dá)的抗炎作用。

iNOS和COX-2與腦卒中炎性損傷關(guān)系密切。在腦缺氧/缺血，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）在浸潤(rùn)巨噬細(xì)胞和活化的小膠質(zhì)表達(dá)增加，導(dǎo)致缺血性損傷［2-4］，此外，PGE2是與炎癥有關(guān)的重要介質(zhì)。COX-2是PGE2生物合成的限速酶，這在大腦中的局部缺血后損傷中起關(guān)鍵作用。我們的研究結(jié)果表明，腦缺血后紅景天苷的抗炎作用與iNOS和COX-2表達(dá)的抑制有關(guān)。

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R285.6

：A

：1000-338X（2016）06-0046-03

2016-09-12

福建省衛(wèi)生廳課題（WZZY201305）

魏藝聰（1981—），講師，碩士，研究方向：中藥藥理研究。

洪桂祝（1966—），女，教授。E-mail：guizhuhong@yahoo. co.uk