雙合湯含藥血清促進BMSCs體外增殖的研究

段璋，周李學，李新建，李志敏，齊振熙

（1.福建中醫藥大學骨傷學院，福建福州350122；2.福建中醫藥大學中西醫結合學院，福建福州350122）

·實驗研究·

雙合湯含藥血清促進BMSCs體外增殖的研究

段璋1，周李學1，李新建1，李志敏1，齊振熙2

（1.福建中醫藥大學骨傷學院，福建福州350122；2.福建中醫藥大學中西醫結合學院，福建福州350122）

目的觀察雙合湯含藥血清對SD大鼠骨髓間充質干細胞（BMSCs）體外增殖的影響。方法采用全骨髓貼壁方法提取BMSCs，顯微鏡觀察形態，流式細胞儀檢測其表面標記物，計數法繪制其生長曲線，分別用低劑量、中劑量、高劑量10%雙合湯含藥血清代替胎牛血清（FBS）進行藥物干預。結果培養的細胞以梭形為主，呈漩渦狀生長；流式細胞儀檢測CD34陽性率為0.96%，CD90陽性率為93.51%；生長曲線似倒S型；給藥組的BMSCs增值速度比空白對照組均快，其中高劑量組增值速度最快。結論雙合湯含藥血清能促進BMSCs體外的增值速度，且高劑量雙合湯含藥血清促進BMSCs的增值速度最為明顯。

骨髓間充質干細胞；全骨髓貼壁法；脂質代謝紊亂；激素；骨壞死；骨質疏松

干細胞是一類原始未分化，具有自我復制更新、高度和多方向分化的功能細胞［1］，它又分為胚胎干細胞（embryonic stem cell，ESCs）和成體干細胞（adult stem cells，ASCs）。骨髓間充質干細胞（BMSCs）是ASCs的一種，是除造血干細胞以外的非造血干細胞［2］，主要存在于骨髓中，約占骨髓單核細胞0.001%～0.01%［3］。因其取材方便，體外增值能力強，具有向軟骨細胞、脂肪細胞等細胞分化能力［4-5］，為骨、脂肪等組織損傷的恢復提供細胞來源，又易轉染、表達外源基因，在細胞、基因治療中有著廣泛的應用前景［6］，因此BMSCs的有效擴增顯得意義重大。此次實驗以SD大鼠為研究動物，采取全骨髓貼壁方法提取BMSCs，觀察雙合湯含藥血清對BMSCs增值速度的影響。

1 材料

1.1 動物制備含藥血清：2月齡SPF級健康SD大鼠16只，雄性，體重（200±10）g，分為低劑量組、中劑量組、高劑量組、無含藥組，每組4只。分離提取BMSCs：3周齡SPF級健康SD大鼠2只，雄性，體重（110±15）g。本實驗動物均來自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號：SCXK（瀘）2012-0002。

1.2 藥物采用《中醫內科學》［7］治療痰瘀痹阻型痹癥的雙合湯：白芥子、姜半夏、陳皮、茯苓（去皮）、當歸、川芎、白芍、生地黃各3 g，甘草、紅花各0.9 g，桃仁（去皮）2.4 g，生姜3片。由北京康仁堂藥業有限公司提供顆粒劑，用生理鹽水自制成濃度為1 g·mL-1的制劑，密封保存備用。

1.3 試劑磷酸鹽緩沖液（PBS，美國Hyclone公司，批號：NAA1322）；低糖培養基（L-DMEM，美國Hyclone公司，批號：NAC1349）；0.25%胰酶（含0.02% EDTA，美國Invitrogen公司，批號：1686946）；胎牛血清（FBS，美國Invitrogen公司，批號：1715752）；mouse lgG1（美國Biolegend公司，批號：B184124）；CCK-8（碧云天生物技術有限公司，批號：08010315 08）；CD34（美國Santa Cruz公司，批號：#J1014）；CD90（美國Biolegend公司，批號：B200112）；Goat anti-mouse lgG（美國Biolegend公司，批號：B180747）；10%水合氯醛溶液（北京雷根生物技術有限公司，批號：0529A15）。

1.4 主要儀器流式細胞儀（美國Becton Dickinson公司，型號：BD FACSCaliburTM Flow Cytometer）；顯微鏡（德國Leica公司，型號：DMIL）；潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司，型號：SW-CJ-1FD）；低速臺式離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司，型號：TDZ4A-WS）；CO2培養箱（美國SHEL-LAB公司，型號：3111）；Countstar自動細胞計數儀（上海睿鈺生物科技有限公司，型號：IC 1000）。

2 方法

2.1 雙合湯含藥血清的制備根據人體與動物藥物等效劑量換算，按人體重60 kg，SD大鼠體重0.2 kg計算，3片生姜稱得約3 g，再根據體表面積法計算：

等效給藥劑量/g＝人體的劑量/（g·kg-1）×60 kg×S大鼠·S人-1≈0.62 g。

低劑量為3.1 g·kg-1，中劑量為6.2 g·kg-1，高劑量為12.4 g·kg-1。分別用低、中、高劑量雙合湯溶液灌胃，并設為低、中、高劑量組。另設無含藥組，用生理鹽水1 mL/100 g灌胃，每天2次，連續7 d。在最后一次灌胃1 h后，用10%水合氯醛3～4 mL·kg-1腹腔注射麻醉，腹主動脈采血，離心（3 000 r·min-1，15 min），吸出血清放入15 mL離心管中，置56℃恒溫水浴箱30 min（滅活處理），再過濾（0.22 μL過濾器）除菌，-80℃保存待用。

2.2 SD大鼠BMSCs分離、傳代培養及形態觀察采用全骨髓貼壁法。取健康SPF級SD大鼠2只，用頸椎脫臼法處死大鼠，將大鼠浸入75%的酒精中5 min，然后將其移置紫外線消毒好的操作臺中；取大鼠雙側股骨和脛骨并用手術刀刮除其表面的肌肉和骨膜，再放入PBS緩沖液中漂洗干凈；用手術剪剪斷兩側干垢端，用5 mL一次性注射器抽取5 mL含10%FBS的L-DMEM培養基反復沖洗骨髓腔，使沖洗液流至60 mm培養皿中，沖到骨髓腔發白；用移液槍緩慢吹打沖洗液數次并接種到2個25 cm2塑料培養瓶中，置入95%空氣、5%CO2、37℃的培養箱中培養；第1天后半量換液（吸走2.5 mL培養液，再加2.5 mL新的完全培養液），3 d后全量換液（盡量將沒貼壁細胞洗干凈）；以后每3 d換液一次，直至長到80%左右（約10 d），進行傳代；去培養液，PBS緩沖液洗2遍后每瓶加入1 mL預熱的0.25%的胰蛋白酶（含0.02%EDTA），室溫靜止消化；顯微鏡下見細胞變圓，少量細胞浮起時，立刻加入3 mL完全培養基終止消化，輕輕吹打瓶底，收集易消化的細胞懸液，離心（1 000 r·min-1，離心5 min）；倒掉上清液，加入完全培養基重懸，按1∶2接種到25 cm2塑料培養瓶中，每瓶接種4～6 mL，從培養到傳代過程都在倒置顯微鏡拍照，觀察細胞形態。

2.3 SD大鼠BMSCs的流式表型鑒定取生長良好的第3代BMSCs，待生長至90%融合時，用預冷的PBS緩沖液沖洗2遍，消化離心（1 000 r·min-1，5 min），棄清液，用預冷PBS清洗細胞1次；再離心，棄上清；用含0.1%BSA的PBS將細胞濃度調整為3×106mL-1，將細胞分裝至1.5 mL的EP管中，每管100 μL；再按量于各個樣品管內加入相對應異硫氰酸熒光素標記（fluorescein isothiocyanate，FITC）的一抗CD34、CD90，每組并設陰性對照組和同型對照組；陰性對照組不加任何抗體，同型對照組加FITC-mouse lgG1；小心吹打混勻，避光，室溫靜止30 min；往每樣品管內添加適量1.5 mL PBS，吹打數次混勻，離心（1 000 r·min-1，5 min），棄上清；PBS重懸洗滌1次，棄上清；往各樣品管內分別加入100 μL PBS，按量（參照抗體說明書）往各樣品管內分別加入對應的二抗FITC Goat anti-mouse lgG，吹打混勻；避光，室溫靜止30 min，往每樣品管內添加適量1.5 mL PBS，小心吹打混勻；離心（1 000 r·min-1，5 min），吸去上清液；最后往每管中加入300 μL PBS重懸細胞，裝入檢測管，通過流式細胞儀檢測BMSCs細胞表面標志性抗原CD34、CD90陽性率鑒定大鼠BMSCs。

2.4 SD大鼠BMSCs生長曲線測定選取生長狀態良好的第3代BMSCs細胞接種于24孔培養板，每孔1 mL，接種密度為1×1010mL-1，培養24 h后每日取3孔細胞消化計數，連續檢測7 d（間隔時間24 h，允許誤差5%）。7 d后用細胞計數儀自動繪制生長曲線。

2.5 不同藥物濃度對SD大鼠BMSCs體外增殖活性分析選取生長狀態良好的第3代BMSCs細胞，胰酶消化，重懸細胞，調整細胞密度，以2×103mL-1密度100 μL均勻接種于3塊96孔板培養，且設加無含藥血清的孔作為空白對照組，每組接種6個孔，進行培養（在37℃，5%CO2的條件下）6 h；向培養板中分別加入低、中、高劑量的雙合湯含藥血清與無含藥血清的培養基各10 μL刺激；將培養板在培養箱分別孵育24、48、72 h；每孔加入10 μL或用培養基稀釋1倍至20 μL CCK-8溶液（注意不要在孔中生成氣泡，會影響OD值的讀數，外圍一排孔加相應量PBS，并把培養板放在靠近培養箱水源的地方），在細胞培養箱內繼續孵育3 h。用酶標儀測定在450 nm處的吸光度，如無450 nm濾光片，可以使用420～480 nm的濾光片，作為參考波長進行雙波長測定。

2.6 統計學處理采用SPSS 16.0統計軟件分析。計量資料屬于正態分布的用單因素方差分析，非正態分布的用秩和檢驗；計數資料用卡方檢驗。

3 結果

3.1 BMSCs生長形態骨髓液剛接種于培養瓶時，懸浮著大小不一、圓型、折光性強的細胞于培養液中，如圖1。24 h換液后可見部分貼壁細胞，呈單個散在或多個聚在一起的短梭形、多角形或星形細胞，如圖2。9～10 d融合80%～90%，細胞呈典型的放射狀排列、同心圓狀集落生長，如圖3。消化傳代后，細胞24 h后完全貼壁，生長旺盛，2～3 d即可傳代，如圖4。繼續培養仍能保持細胞形態及增值能力，至少能傳10代。

3.2 流式細胞儀鑒定SD大鼠BMSCs表面標記物流式檢測結果顯示細胞均一性較好，表面抗原CD34陽性表達率為0.96%，見圖5。CD90陽性表達率為93.51%，見圖6。同型對照組的mouse lgG1陽性表達率均為1.17%。說明培養的SD大鼠細胞為BMSCs且純度較高。

3.3 SD大鼠BMSCs生長曲線經過24 h的貼壁后，從圖7可見，其生長似倒S型，前4 d為對數生長期，增值速度加快，第5 d開始進入平臺期，增值速度減慢。

3.4 雙合湯含藥血清對BMSCs體外增殖活性的影響由表1可知，通過24 h、48 h、72 h的干預觀察發現雙合湯能促進BMSCs的增值且高劑量組促進BMSCs的增值最為明顯。

4 討論

分離獲取BMSCs目前有多種方法可選［8-9］：全骨髓貼壁法操作過程簡單，培養初期一定程度上保留了體內其生長環境，得到的細胞分化潛能較好，但細胞成分較復雜，均一性較差并且破碎的紅細胞碎片可能對BMSCs生長有一定影響；密度梯度離心法操作過程較復雜，易引起細胞污染，但分離的細胞純度較高；流式細胞儀分選法和免疫磁珠分選法過程復雜，實驗條件要求高，骨髓量需求大，價格昂貴，對細胞損傷大，再加上未發現特異性很強的表面標記物，因此其應用受到限制［10］。林楚偉等［11］實驗研究發現全骨髓貼壁培養法比密度梯度離心法所分離得到的細胞，其活力、增殖能力有明顯提高，更適合下面的實驗。本研究采用全骨髓貼壁培養法分離純化的SD大鼠BMSCs呈長梭形、集落樣、漩渦狀生長，均勻地表達BMSCs表面標記抗原CD90，而不表達造血前體細胞標記抗原CD34，符合BMSCs的生物學特性，可以用于BMSCs相關研究。

表1 不同濃度雙合湯含藥血清對BMSCs體外增殖活性的影響

表1 不同濃度雙合湯含藥血清對BMSCs體外增殖活性的影響

注：與空白對照組比較，1）P＜0.01；與高劑量組比較，2）P＜0.05。

組別空白對照組低劑量組中劑量組高劑量組n 6 6 6 6 OD值24 h 0.3147±0.002 0.3310±0.0041）2）0.3430±0.0031）2）0.3645±0.0031）48 h 0.3717±0.004 0.3860±0.0041）2）0.3918±0.0021）2）0.4077±0.0071）72 h 0.6122±0.004 0.6423±0.0031）2）0.6650±0.0031）2）0.6952±0.0031）

BMSCs具有多種表面標志分子，如間充質、成纖維細胞及內皮細胞的表面標志分子，目前還無獨有的標志分子，如表達表面抗原CD90、CD166及黏附分子CD44（HCAM）、CD54（ICAM-1），不表達CD34、CD45等造血干/祖細胞的標志物［12-13］。

雙合湯是治療痰瘀痹阻型痹癥的經典方，臨床療效肯定。近年來，有關雙合湯對BMSCs增值的影響尚未見報道。目前，影響BMSCs體外增殖的資料顯示［10］：10%的FBS有助于其穩定生長，高濃度或低濃度的FBS均不利于其生長，低濃度FBS營養物質不夠，高濃度FBS含有大量促進其分化的因子，加快細胞老化；傳代密度按1∶2接種到25 cm2的塑料培養瓶比較合適，這可能和細胞間的相互接觸抑制有關；細胞因子對BMSCs的促增殖影響，如堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）等。本實驗選擇10% FBS培養基，1∶2比例傳到第3代進行體外擴增實驗，結果表明雙合湯含藥血清能促進BMSCs的增長，這可能和化痰活血藥物對細胞因子的作用有關。

QuanCui等［14］認為長期使用激素會使脂肪細胞肥大及造血細胞變少，促進BMSCs向脂肪細胞分化，激素誘導的骨母細胞向脂肪細胞形成和脂質代謝紊亂在激素性骨壞死和骨質疏松中起主要作用。脂質代謝紊亂即高脂血癥，中醫學又稱為“痰濁”。Boss等［15］又認為高脂血癥會引起骨內微血管中出現脂肪栓子、血管內皮細胞發生損害、血流障礙、血管內凝血系統紊亂，中醫學里又稱之為“血瘀”證。采用雙合湯即為臨床解決BMSCs增值數量又可以針對“痰瘀”的癥狀治療。對于本方治療長期應用激素導致BMSCs成脂分化即脂質代謝紊亂的骨壞死和骨質疏松，其作用機制以及中藥藥理作用有待于深入研究，這為我們中藥治療激素性骨壞死和骨質疏松的新藥研發奠定了基礎。

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R285.5

：A

：1000-338X（2016）06-0036-04

2016-09-10

國家自然科學基金面上項目（81473705）

段璋（1988—），男，碩士研究生，研究方向：股骨頭壞死的基礎與臨床研究。

齊振熙（1957—），男，博士，教授。E-mail：zxqi@fjtcm.edu.cn