牙周膜成纖維細胞多種培養法的研究

吳憂 張軍梅

(貴州醫科大學，貴州 貴陽 550004)

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牙周膜成纖維細胞多種培養法的研究

吳憂 張軍梅△

(貴州醫科大學，貴州 貴陽 550004)

目的 提高人牙周膜成纖維細胞原代培養的成功率，提高組織塊貼壁率，縮短培養時間，加快細胞增殖。方法 以高血清結合改良組織塊培養法培養原代HPDLCs與傳統組織塊法及改良組織塊培養法作比較。通過免疫組化方法鑒定細胞的來源，繪制細胞的生長曲線，對三種方式的培養成功率、組織塊貼壁率及細胞增殖速度進行比較。結果 三種方法所培養的原代細胞生長均趨于正常，細胞呈長梭形或多角形，波形蛋白鑒定呈陽性，角蛋白鑒定呈陰性，符合正常HPDLCs的正常形態及生物學特點。高血清結合改良組織塊培養法的成功率為86.67%，明顯高于其他兩種方法(P<0.01)。結論 高血清結合改良組織塊培養法明顯提高了HPDLCs原代培養的成功率，適合在臨床上運用。

原代培養； 提高培養成功率； 人牙周膜成纖維細胞

牙周膜成纖維細胞是牙周結締組織中最為主要的一種間充質細胞，不僅具有更新與自我修復的能力[1]，同時還能夠分泌牙周組織中的間充質以及在口腔正畸過程中促進成骨與破骨過程的各種酶、生長因子等。離體培養的HPDLCs對研究牙周生物學、藥物學、正畸力學都具有重要意義, 為近年來正畸生物力學的研究進展發揮了巨大作用[2]。 成纖維細胞體外培養的方法主要可以分為組織塊法和酶消化法。酶消化法雖可縮短培養時間，但因為其操作步驟復雜，對細胞損傷大，所以很難掌握。組織塊法因培養時間過長，所得細胞量也相對較少。本實驗使用高血清培養基，結合改良組織塊培養法共同培養HPDLCs，并將這種方法與傳統組織塊培養法、改良組織塊培養法做比較。

1 器材與方法

1.1 主要試劑及器材 DMEM 低糖培養基(Gibco 公司，美國)、胎牛血清(FBS，Hyclone 公司，美國)、Ⅰ型膠原酶(Sigma 公司，美國)、60 mm培養皿 、24孔細胞培養板、25 mm培養瓶(NEST公司)、100 U/mL 青霉素和100 U/mL 鏈霉素(Hyclone公司，美國)、兔抗人波形蛋白(北京中杉金橋公司)、鼠抗人角蛋白(北京中杉金橋公司)、生物安全柜(美國THORMO)、Heraus 28 RS 低溫高速 離心機 (Heraus 公司，德國)、Hereaus HERA 3180F CO2培養 箱 (Hereaus 公司， 德國)、DMIRB 倒置相差顯微鏡 (Leica 公司，德國)、細胞粒度分析及計數儀 (Beck-man Coulter 公司，美國)。

1.2 方法

1.2.1 HPDLCs的原代培養 我院門診部拔除的健康正畸前磨牙，患者年齡12～16歲。拔除后立刻放入預先預冷含100 U/mL 青霉素和100 U/mL 鏈霉素的DMEM低糖培養基中，快速移至超凈臺中，將牙冠放入乙醇侵泡約1 min后，使用PBS液反復沖洗離體牙根面去除污物及冠方乙醇，并使用預先配置的含10%FBS及雙抗的低糖DMEM培養基潤濕根面，使用手術刀刮取根中1/3牙周膜放置于培養皿中，將刮取得到的牙周膜組織剪成約1 mm的小塊待使用。(1)HPDLCs傳統培養法：本法使用含15%FBS及 100 U/mL 青霉素和100 U/mL 鏈霉素的低糖DMEM培養基對組織塊進行培養。首先在60 mm的培養皿中加入1～2 mL完全培養基潤濕皿底，進而將預先預備好的組織塊平鋪于皿底，組織塊間的間隔約4 mm。將培養皿放入CO2培養箱中約4h后，再加入完全培養基4 mL繼續培養，每3 d換液一次；(2)HPDLCs改良組織塊培養法：首先將預備好的組織塊放入15 mL的離心管中，隨后向離心管中加入2 mL 0.2%的Ⅰ型膠原酶，將離心管放入CO2培養箱中30 min，每5 min將離心管拿出搖晃使組織塊與酶均勻接觸，隨后離心機離心800 rpm/min,3 min，將沉淀物取出均勻平鋪于60 mm的培養皿中，加入1～2mL含15%及100 U/mL 青霉素和100 U/mL 鏈霉素的低糖DMEM培養基，再放入CO2培養箱中約4 h后，再加入完全培養基4 mL繼續培養，每3 d換液一次；(3)HPDLCs改良組織塊培養結合高血清培養法：本法使用含40%FBS及100 U/mL 青霉素和100 U/mL 鏈霉素的低糖DMEM培養基對組織塊進行培養。其培養方式與改良組織法相同。

1.2.2 HPDLCs的傳代 使用倒置顯微鏡觀察細胞，待組織塊周圍的細胞到達融合狀態時，使用探針將組織塊勾除，并向皿中加入4 mL含EDTA(0.02%)的0.25%胰蛋白酶，37 ℃培養箱中消化4～5 min后加入雙倍的完全培養基終止消化(沿用原代培養時使用的血清濃度)，使用移液槍吹打皿底使細胞脫落后收集于15 mL的離心管中，離心機1 000 rmp/min，5 min，棄去上清液，再向離心管中加入5 mL完全培養基(除高血清法需使用含25%FBS的完全培養基外，其余兩種培養法均使用含10%FBS的完全培養基)，將細胞吹打至重懸后接種于培養瓶中繼續培養，4～5 d換液一次。

1.2.3 細胞的純化及鑒定 牙周膜成纖維細胞的純化即是將其與其中的上皮細胞分離，使用含EDTA(0.02%)的0.25%胰蛋白酶對細胞進行消化傳代，一般4～5 min，利用HPDLCs與上皮細胞對胰酶的耐受度不同這一性質，再傳到至4～5代時，HPDLCs可完全純化。牙周膜成纖維細胞是來自于上皮中胚層的細胞，其與上皮細胞相區別的特異性蛋白即波形蛋白，本實驗即鑒定細胞中是否存在波形蛋白及角蛋白，由此來鑒定細胞的來源。

1.2.4 HPDLCs細胞生長曲線 取生長至第4代的HPDLCs，使用0.25%的胰蛋白酶消化，離心后棄去上清液，加入含20%FBS的培養基后重懸細胞，以2×105個/mL的量接種于24孔板中，放入培養箱中進行培養，每2 d對細胞進行一次換液，后每24 h消化3孔對細胞進行計數，取3孔細胞計數的平均值進行計算，連續計數7 d，根據得到的7 d細胞計數繪制出細胞生長曲線圖，其中以細胞數量作為縱軸，以細胞培養天數作為橫軸。

1.3 細胞形態學觀察 使用倒置顯微鏡觀察細胞的形態及變化。

1.4 統計學方法 通過統計學χ2檢驗比較3種實驗中細胞培養的成功率，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 三種實驗方法的比較 均取15例健康牙周膜進行分析。高血清結合改良組織塊培養法的組織塊貼壁率為92%，從倒置顯微鏡下觀察可見組織塊呈淡黃色，邊緣處略顯透亮，4～7 d約90%可見細胞從組織塊邊緣爬出，呈放射聚集性生長，細胞形態為長梭形或多角形。去除組織塊繼續培養，3～4 d后細胞可生長達到融合狀態。15例中有13例培養成功，成功率為86.67%。傳統組織塊培養法的組織塊貼壁率約為45.33%，倒置顯微鏡下觀察組織塊呈褐黑色，15～20 d約50%可見細胞爬出，呈小聚落放射生長，細胞形態呈長梭形或多角形。去除組織塊后繼續培養，8～10 d后細胞可達到融合狀態。15例中4例培養成功，成功率為26.67%。改良組織塊培養法的貼壁率約54.67%,倒置顯微鏡下組織塊呈現半透明狀，10～12 d約60%有細胞爬出，細胞大部分呈正常長梭形狀，小部分細胞較正常形態更為細長；在細胞的增殖過程中，有15%的細胞崩解凋亡，約8 d細胞基本達到80%融合狀態，基本可以傳代。15例中8例培養成功，成功率為53.33%。高血清結合改良組織塊培養法的成功率明顯高于其他兩種培養法，且差異具有統計學意義(P<0.01)，見圖1。

注：A.高血清結合改良法組5 d，大量細胞從組織塊邊緣爬出；B.改良法組12 d， 細胞爬出組織塊并生長增殖；C.傳統法組16 d，少量細 胞從組織塊邊緣爬出；D.高血清組細胞爬出4 d后，周圍細胞生長至融合狀態(10×倒置顯微鏡拍攝)。圖1 HPDOCs三種培養方式的比較

2.2 細胞鑒定免疫組化染色 對第4代細胞免疫組化染色，鑒定抗波形蛋白呈陽性，細胞內可見大量棕黃色顆粒，即可知細胞來源于上皮組織中胚層；鑒定抗角蛋白呈陰性，細胞內無陽性顆粒反應，經蘇木素染色呈淡藍，由此可判斷此細胞為牙周膜成纖維細胞，見圖2。

注：A.HPDLCs免疫組化染色，抗波形蛋白呈陽性(40×)； B.HPDLCs免疫組化染色，抗角蛋白呈陰性(40×)。圖2 HPDLCs鑒別

2.3 HPDLCs生長曲線 HPDLCs的生長可分為3期，既緩慢期，對數生長期和平臺期。接種后經24 h后消化細胞進行計數，因細胞剛經過胰蛋白酶消化刺激，細胞數量較平時生長速度明顯減慢，數量減少，隨后逐漸增加。從第3天開始細胞的增殖速度明顯加快，進入到對數生長期，到第7天細胞的數量達到頂峰。此后因細胞已長滿培養皿，相互之間出現接觸抵觸，生長受到抑制，細胞不在進行分裂、增殖，細胞生長進入到平臺期。本實驗的三種培養方式中，細胞的增殖速度相似，是呈緩慢期-對數增長期-平臺停滯期的形式，見圖3。

圖3 HPDLCs生長曲線

3 討 論

牙周膜細胞的培養方法一般分為組織塊培養法及消化法兩種。傳統的組織塊培養法在操作上較為簡易，不容易發生污染，成纖維細胞的同源性較高，且相較于消化法所需要的組織量也較少。但其缺點在于培養時間過長，從細胞爬出到細胞接近融合狀態需要2～4周，在本實驗中組織塊貼壁率只達到約40%，這直接影響了細胞培養的成功率，15例的實驗組中僅有4例成功培養出細胞，效率只達到約26.6%，這與文獻[3]報道的數據相符合。

研究[4]認為傳統組織塊培養法更容易掌握，所以此法得到廣泛的運用。但因為傳統的培養法獲得的細胞量少且培養時長過久，使得效率降低，有學者對其進行了改良，即是將原有消化法中的“雙酶”改為了只用Ⅰ型膠原酶消化牙周膜組織，使得組織連接部分分離，這樣可以將原有消化法中兩種酶對細胞的損傷盡量降低，同時也可以使細胞更快地從已經過“半消化”的組織塊中分離出來，所以此方法是目前運用最廣泛的培養法。從本實驗的結果來看，改良組織塊培養法的培養周期雖相對縮短，但組織塊的貼壁率只達到約60%，這對原代細胞培養的成功率也出現了直接的影響，如無法提高組織塊的貼壁率，但就改良消化的方式來說并不能真正的提高原代細胞培養的效率。

現已有研究[5]表明，含有高濃度血清的培養基有助于組織塊貼壁效率，可以為細胞提供充足的營養物質。胎牛血清(FBS)的作用：(1)提供對維持細胞指數生長的激素，基礎培養基中沒有或量很少的營養物，以及主要的低分子營養物；(2)提供結合蛋白，能識別維生素、脂類、金屬和其他激素等，能結合或調變它們所結合物的活力；(3)有些情況下結合蛋白質能與有毒金屬和熱原質結合，起到解毒作用；(4)是細胞貼壁、鋪展在塑料培養基質上所需因子來源；(5)起酸堿度緩沖液作用；(6)提供蛋白酶抑制劑，使在細胞傳代時使剩余胰蛋白酶失活，保護細胞不受傷害[6]。

對于細胞培養的血清濃度問題目前國內外學者均無明確答案，不同類型的細胞其差異很大，因血清成分復雜，過多應用血清易引起實驗結果不可靠，且血清是酸性，對也細胞生長不利。在大部分的原代細胞培養實驗中，大多使用15%～20%的FBS，傳代后使用10%的FBS繼續培養。本實驗中的高血清培養法將FBS含量提高至40%，傳代后使用20%的FBS繼續培養。15例中有13例培養成功，效率可達到86.7% ，明顯比另外兩種培養法的成功效率高。因此，40%的FBS提供了豐富的結合蛋白和促進組織塊貼壁的黏附因子，與另外兩種培養法相比較，其組織塊貼壁率達到90%，明顯高于另外兩種，說明此血清濃度可以很好地促進組織塊貼壁。本實驗中4～7 d約90%可見細胞從組織塊邊緣爬出，呈放射聚集性生長，細胞形態為長梭形或多角形。去除組織塊繼續培養后，因為血清提供了較高的養分，細胞生長旺盛、均勻，使得3～4 d后細胞可生長達到融合狀態，速率明顯高于另兩種培養方式。本實驗采取的高血清結合改良組織塊培養法，將兩種方法結合不僅僅可以降低消化酶對細胞的損傷，同時運用高血清濃度提高組織塊貼壁率這一效果，使得原代細胞培養的速率及效率都得到了提高。同時，本實驗運用的FBS濃度是常用濃度的2倍，從倒置顯微鏡觀察細胞的形態及增值狀況，顯示都趨于正常，這說明高濃度的血清并不影響細胞的形態及生長。

通過本實驗的三種培養方式，我們認為高血清結合改良組織塊培養法的成功率較高、操作較已掌握、不容易發生污染，同時縮短了培養時間，獲得相對較大數量的細胞，是一種較為適用、高效的HPDLCs的原代培養方式。

[1] 侯睿,陳新民,巢永烈,等.體外不同動態力學應變對人牙周膜成纖維細胞增殖和功能活性的影響[J].南方醫科大學學報,2010,30(2):252-256.

[2] Zaman KU , Sugaya T , Kato H. Effect of recombinant human plate let derived growth factor and bone mophogenctic protein 2 application Demineralized dentinon early periodon cell retalligment[J].Response J Periodontal Res，1999，34 (5)∶244- 250.

[3] 司徒鎮強,陳建元.體外培養的人牙齦牙周膜牙髓纖維細胞生長及形態特點[J].實用口腔醫學雜志,1993,64(8):1026-1030.

[4] 張明珠，雷雅燕，劉曉，等.原代人牙周膜成纖維細胞的培養及培養方法的改進[J].昆明醫學院學報，2004，25(1)：53-56.

[5] 季鐘涅,紀念研制牛血清白蛋白合格產品40周年 [J]生命的化學,2004,24(5):1.

[6] Adams AM, Soames JV, Seral RF. Cultural and morphological characteristics of human periodontal ligament cells in vitro [J].Arch Oral Biol, 1993,38(8):657-662.

Study on the various culture methods of periodontal ligament fibroblast cell

WuYou，ZhangJunmei△.

GuizhouMedcialUniversity,Guiyang550004,China.

Objective To improve the successful rate of primary culture of periodontal fibroblast cells and tissue block adherence rate, reduce culture time and increase cell production. Methods Culture primary HPDLCs by combining high serum and improved tissue block, which was compared with traditional tissue block method and improved block method. Recognize the source of cell by immunity group, draw the growing curve of cell, and make comparison of successful rate, adherence rate and production rate of three methods. Results The primary cells cultured by three methods are all normal. The cells look like fusiform and multi-angle shape, vimentin positive, Keratin negative, which conform of normal morphology of HPDLCs and biological characteristics. The successful rate of improved tissue block with high serum totals 86.7%, obviously higher than that of other two groups (P<0.01). Conclusion The method of high serum improved tissue block obviously is increased the successful rate of primary cultivation, which shall be applied in clinical cases.

Primary culture； Improve the successful rate of primary culture； Human periodontal ligament cells

R781

A

1000-744X(2016)05-0469-03

2015-10-25)

△通信作者，E-mail:zjm46688@126.com