丹參酮ⅡA磺酸鈉對慢性阻塞性肺疾病氣道重塑大鼠PPARγ、NF-κB的影響研究

李春陵 朱靜雯 王里

(貴州省人民醫院干醫科，貴州 貴陽 550002)

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丹參酮ⅡA磺酸鈉對慢性阻塞性肺疾病氣道重塑大鼠PPARγ、NF-κB的影響研究

李春陵 朱靜雯 王里

(貴州省人民醫院干醫科，貴州 貴陽 550002)

目的 探討丹參酮ⅡA磺酸鈉對慢性阻塞性肺疾病(COPD)氣道重塑大鼠過氧化物酶體增殖物活化受體γ(PPARγ)、核因子-κB的影響。方法 通過氣管內注射脂多糖及吸煙建立COPD氣道重塑大鼠模型。健康Wistar大鼠40只，隨機分為四組:正常組(n=10)、模型組(n=10)、丹參酮ⅡA磺酸鈉治療組(n=10)、地塞米松治療組(n=10)，應用酶聯免疫吸附(ELISA)法檢測金屬基質蛋白酶-2(MMP-2)、金屬基質蛋白酶-9(MMP-9)、金屬基質蛋白酶抑制物-1(TIMP-1)、金屬基質蛋白酶抑制物-2(TIMP-2)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)的含量，以逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)法以及蛋白免疫印記法(Western-blot法)檢測PPARγ、NF-κB mRNA及蛋白質表達水平。結果 與正常組比較，模型組血清MMP-2、MMP-9、 TNF-α、IL-6的含量明顯升高，TIMP-1、TIMP-2則明顯降低，而且模型組氣管組織PPARγmRNA和蛋白質表達水平明顯降低，NF-κB mRNA和蛋白質表達水平則明顯升高，差異有顯著性(均P<0.05)，經予丹參酮ⅡA磺酸鈉治療后，血清MMP-2、MMP-9、 TNF-α、IL-6的含量明顯降低，TIMP-1、TIMP-2則明顯升高，且模型組氣管組織PPARγmRNA和蛋白質表達水平明顯升高，NF-κB mRNA和蛋白質表達水平則明顯降低，丹參酮ⅡA磺酸鈉治療組與正常組及地塞米松組比較差異無顯著性(均P>0.05)。結論 丹參酮ⅡA磺酸鈉通過調節PPARγ、NF-κB mRNA及蛋白質的表達水平，抑制氣道重塑因子MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2、 TNF-α、IL-6水平，防止氣道重塑。

丹參酮ⅡA磺酸鈉； 慢性阻塞性肺疾病； 氣道重塑； 過氧化物酶體增殖物活化受體γ； 核因子-κB

慢性阻塞性肺疾病(COPD)以不完全可逆性氣流受限為特征， 其病理基礎為氣道壁和肺實質的慢性炎癥及結構破壞，最終導致管腔狹窄、 肺氣腫形成和進行性氣流阻力增加，這一過程稱為氣道重塑[1]。丹參酮ⅡA磺酸鈉是從丹參中分離出二萜醌類化合物丹參酮后經磺化得到的水溶性物質，具有多種藥理作用，如抗氧化，抗菌抗炎，降低血液黏度以抑制凝血 、促進纖溶 、抑制血小板聚集 、延長血栓形成及促進血栓溶解作用[2]，是否能抑制COPD氣道重塑目前尚不清楚。本研究通過觀察丹參酮ⅡA磺酸鈉對COPD氣道重塑大鼠PPARγ、NF-κB的調節以及相關氣道重塑因子的影響研究，為COPD氣道重塑的治療進一步提供新的作用靶點，同時明確丹參酮ⅡA的作用機制，為臨床應用提供科學理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康Wistar雄性大鼠40只，清潔級，鼠齡5～6個月，體質量(250±10) g，由貴陽醫學院實驗動物學部提供，合格證號：SYSK(黔)2002-0001。

1.1.2 藥物、試劑及儀器 丹參酮ⅡA磺酸鈉(上海第一生化有限公司，批號：H31022558)，地塞米松(國藥集團容生制藥有限公司，批號：H41020036)，MMP-2、MMP-9，TIMP-1、TIMP-2、TNF-α、IL-6 ELISA檢測試劑盒(santa cruz公司)， Trizol(Invitroge公司)， Rnasin(Promega公司)，M-MLV(Promega公司)，引物由上海生物工程公司合成，小鼠抗NF-κB p65 mcAb(Santa Crus公司)，小鼠抗PPARγ(Santa Crus公司)，ECL顯影試劑盒(Santa Cruz 公司)，制膠、電泳及轉膜儀(Bio-Rad公司)，PCR儀(Eppendorf 公司)，酶標儀(Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 COPD 氣道重塑模型制備 采用兩次氣管內注射小劑量脂多糖及被動吸煙的復合刺激法建立大鼠COPD氣道重塑模型：分別于實驗第1天和第14天于氣管內注入脂多糖200 μg ，第2～28天(第14天除外)將大鼠置于80 cm×60 cm×50 cm大小的有機玻璃熏箱內被動吸煙，每日熏煙2次，每次20支香煙，時間持續1 h，兩次熏煙時間間隔4 h。

1.2.2 動物分組及治療 選用Wistar雄性大鼠40只，隨機分組為a.正常組，b.對照組，c.丹參酮ⅡA磺酸鈉治療組(中藥組)，d.地塞米松治療組(西藥組)，每組10只。b、c、d組按照上述方法造模，模型成功后， c組予腹腔注射丹參酮ⅡA 32 mg/kg.d治療(丹參酮ⅡA加生理鹽水總量至1 mL)，d組予腹腔注射地塞米松0.5 mg/(kg·d)治療(地塞米松加生理鹽水總量至1 mL)，正常組及對照組以生理鹽水1 mL腹腔注射，共治療14 d。

1.2.3 檢測標本獲取 實驗結束后，將大鼠股動脈放血處死，所收血液置于無菌帶塞試管中，不抗凝，3 000 r/min離心10 min，分離血清，處理后貯藏于-30 ℃ 低溫冰箱保存；取實驗動物左、右主支氣管分叉以上約5 mm 的氣管組織，貯藏于-70 ℃ 超低溫冰箱保存。

1.2.4 氣道重塑相關因子含量檢測 采用ELISA法測定MMP-2、MMP-9，TIMP-1、TIMP-2、TNF-α、IL-6的含量，操作過程參照試劑盒說明進行。

1.2.5 氣管組織PPARγ、NF-κB mRNA的表達 PPARγ引物：sense5’ TCAAGGGTGC CAGTTTCG 3’，antisense5’CAGCAGGTTGTCTTGGATGT 3’，產物大小397 bp。NF-κB引物：sense5’ TTGTCCCGCCCCTTAGCC 3’，antisense5’ TCCTCCCTTTCCTTGTCC 3’，產物大小401 bp。內參基因(GAPDH)：sense 5’ TCATGTTTGAGACCTTCAA 3’，antisense 5’GTCTTTGCGGATGTCCACG 3’， 產物大小512 bp。按TRIZOL試劑說明書提取氣管組織總RNA，參照第一鏈cDNA合成試劑盒說明書進行逆轉錄反應，然后進行PCR反應。取PCR產物5 μL進行瓊脂糖凝膠電泳、照相，利用UVP凝膠掃描儀測定條帶的吸光度(A)值，以目的基因與GAPDH條帶的吸光度(A)值的比值代表其表達的相對量。

1.2.6 氣管組織PPARγ、NF-κB蛋白質的表達 提取氣管組織蛋白質，制備聚丙烯酰胺凝膠、蛋白電泳、轉膜。一抗濃度均為1∶1 000，二抗濃度為1∶2 000，化學發光試劑法曝光、顯影和定影，凝膠成像分析系統進行密度掃描并分析。

2 結 果

2.1 氣道重塑相關因子含量檢測 與正常組比較，模型組血清MMP-2、MMP-9、 TNF-α、IL-6含量與正常組比較明顯升高，TIMP-1、TIMP-2含量則明顯降低(P<0.05)；丹參酮 ⅡA磺酸鈉治療組、地塞米松治療組上述指標與正常組比較，差異無統計學意義(P>0.05)；丹參酮 ⅡA磺酸鈉治療組上述指標與地塞米松治療組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組氣道重塑相關因子含量檢測

注:與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05。

2.2 氣管組織PPARγ、NF-κB mRNA和蛋白質表達水平的檢測 與正常組比較，模型組氣管組織PPARγmRNA和蛋白質表達水平明顯降低，NF-κB mRNA和蛋白質表達水平則明顯升高，有顯著性差異(均P<0.05)；丹參酮 ⅡA磺酸鈉治療組、地塞米松治療組上述指標與正常組比較，無顯著性差異(均P>0.05)；丹參酮 ⅡA磺酸鈉治療組上述指標與地塞米松治療組比較，無顯著性差異(均P>0.05)。結果見表2，氣管組織PPARγ、NF-κB mRNA 表達的瓊脂糖電泳圖和聚丙烯酰胺凝膠蛋白質電泳圖，見圖1～4。

表2 各組氣管PPARγ、NF-κB mRNA和蛋白質的表達水平相對量]

注:與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05。

3 討 論

PPARγ是一種配體活化的轉錄因子，配體與之結合后調節靶基因的轉錄，調控多種細胞功能和病理生理過程[3]。PPARγ除表達于脂肪細胞、血管壁外， 還廣泛分布于氣道上皮、ASMC、支氣管黏膜下層、肺上皮細胞、免疫細胞( 如單核細胞、巨噬細胞、T 細胞、B 細胞、樹突狀細胞、中性粒細胞等)4]。近年來研究[5-6]發現，PPARγ可通過NF-κB、活化蛋白1(AP-1)、信號轉導和轉錄活化因子(STAT)信號通路抑制IL-6、內皮素-1、一氧化氮合酶、基質金屬蛋白酶(MMP)9、粘附分子表達，抑制氣道炎性反應、氣道重塑。

本研究發現，模型組血清MMP-2、MMP-9、 TNF-α、IL-6的含量與正常組比較明顯升高，TIMP-1、TIMP-2則明顯降低，而且模型組氣管組織PPARγmRNA和蛋白質表達水平明顯降低，NF-κB mRNA和蛋白質表達水平則明顯升高。提示PPARγ和NF-κB通過影響氣道重塑因子MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2、 TNF-α、IL-6的含量參與COPD氣道重塑形成。目前干預氣道重塑的病理生理過程，腎上腺皮質激素具有一定效果，但長期應用激素治療COPD一直存在著較大爭議，對于激素治療后COPD患者的氣道和肺的病理改變仍在進一步研究中，特別是老年患者存在多種基礎疾病，不適宜長期使用激素治療。本研究發現，予丹參酮ⅡA磺酸鈉治療后，氣道重塑大鼠血清MMP-2、MMP-9、 TNF-α、IL-6的含量與正常組比較明顯降低，TIMP-1、TIMP-2則明顯升高，且模型組氣管組織PPARγmRNA和蛋白質表達水平明顯升高，NF-κB mRNA和蛋白質表達水平則明顯降低，與正常組及地塞米松組比較差異無顯著性。

丹參為唇形科鼠尾草屬植物，其根入藥，入心肝二經，中醫認為丹參具有行氣、益氣、活血、養血之功。丹參酮ⅡA磺酸鈉是從丹參中分離出二萜醌類化合物丹參酮后經磺化得到的水溶性物質，能夠抑制人臍靜脈內皮細胞遷移及血管形成，其機制可能與丹參酮 ⅡA 劑量依賴性降低內皮細胞 MMP-2活性、促使血管內皮細胞MMP-2的分泌減少、TIMP分泌增多有關[7]，丹參酮 ⅡA 還能夠抑制TGF-β1 誘導的細胞增殖及分泌Ⅰ型膠原，防止腎纖維化[8]，在抑制組織重塑、凋亡、血管新生等方面具有一定作用[9]。綜上所述，丹參酮ⅡA磺酸鈉通過上調PPARγmRNA及蛋白質的表達水平，下調NF-κB mRNA和蛋白質表達水平，抑制氣道重塑因子MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2、 TNF-α、IL-6水平，防止氣道重塑，為進一步臨床應用提供理論依據。

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Study on influence of Tanshione ⅡA on PPARγ and NF-κB in the airway remodeling of rat with COPD

LiChunling,ZhuJingwen,WangLi.

DepartmentofMedicineforCadre,GuizhouProvincialPeople'sHospital,Guiyang550002,China.

Objective To investigate the influence of Tanshione ⅡA on PPARγ and NF-κB in the airway remodeling of rat with COPD. Methods The model of airway remodeling of rat with COPD was established by intratracheal injection of lipopolysaccharide combined with cigarette smoking. 40 healthy Wistar rats were randomly separated into 4 groups which were normal control group, model control group, Tanshione ⅡA treatment group and dexamethasone treatment group (10 rats in each group). Levels of MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2, TNF-α and IL-6 were measured by ELISA, mRNA and protein levels of PPARγ and NF-κB were evaluated with RT-PCR and western-blot (WB) respectively. Results In model control group, levels of MMP-2, MMP-9, TNF-α and IL-6 were significantly higher, also mRNA and protein levels of NF-κB up-regulated, but levels of TIMP-1, TIMP-2 and mRNA and protein levels of PPARγ were significantly lower than those in normal control group, and there were no statistical significantly differences (allP<0.05). But these change could be attenuated by Tanshione ⅡA treatment group, compared with normal control group and dexamethasone treatment group, there were no statistical significantly differences in Tanshione ⅡA treatment group (allP>0.05). Conclusion Tanshione ⅡA may reverse the airway remodeling through PPARγ and NF-κB regulating MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2, TNF-α and IL-6.

Tanshione ⅡA； COPD； Airway remodeling； PPARγ； NF-κB

貴州省中醫藥管理局、民族醫藥科學技術研究課題(編號：QZYY2013-84)

R-332,R563

A

1000-744X(2016)05-0466-03

2015-12-21)