骨碎補總黃酮對牙周炎大鼠齦溝液骨鈣素及牙槽骨骨密度的影響

曾輝 趙許兵 李子夏 周芳 唐成芳△

(1.西安醫(yī)學院口腔醫(yī)學系，陜西 西安 710021；2.西安交通大學口腔醫(yī)學院急特診科，陜西 西安 710004)

?

骨碎補總黃酮對牙周炎大鼠齦溝液骨鈣素及牙槽骨骨密度的影響

曾輝1趙許兵2李子夏1周芳1唐成芳1△

(1.西安醫(yī)學院口腔醫(yī)學系，陜西 西安 710021；2.西安交通大學口腔醫(yī)學院急特診科，陜西 西安 710004)

目的 觀察骨碎補總黃酮對牙周炎大鼠齦溝液骨鈣素(OC)和牙槽骨骨密度的影響,探討其治療牙周炎的機制。方法 成功建立SD大鼠牙周炎模型之后,使用完全隨機分組方法將大鼠分為正常組、牙周炎組、骨碎補總黃酮組,每組18只。建模4周后分別灌服生理鹽水和骨碎補總黃酮240 mg/(kg·d)。各組大鼠分別在建模后第4，6，8周各處死6只。放射免疫分析法測定齦溝液OC水平,顯微CT測定大鼠牙槽骨骨密度。結(jié)果 牙周炎組齦溝液OC水平顯著高于正常組和骨碎補總黃酮組(P<0.05);骨碎補總黃酮組齦溝液OC水平在6周和8周時顯著低于牙周炎組(P<0.05),8周時與正常組齦溝液OC水平相比差異無統(tǒng)計學意義 (P>0.05)。牙周炎組牙槽骨骨密度顯著低于正常組和骨碎補總黃酮組(P<0.05);骨碎補總黃酮組牙槽骨骨密度在6和8周時顯著高于牙周炎組(P<0.05)。結(jié)論 骨碎補總黃酮可降低牙周炎大鼠齦溝液骨鈣素水平,增加牙槽骨骨密度,對大鼠牙周炎具有一定治療作用。

牙周炎； 骨鈣素； 骨密度； 骨碎補總黃酮

牙周炎已被醫(yī)學界定論為繼癌癥和心腦血管疾病之后，威脅人類身體健康的第3號殺手，而牙周炎引起的牙槽骨吸收又是致使人類牙齒松動、脫落的重要原因。骨碎補總黃酮是從中藥骨碎補中提取出來的最主要的一種黃酮成分。目前，動物實驗已證實骨碎補總黃酮能提高去勢大鼠的骨密度[1]，顯著降低骨質(zhì)疏松小鼠血清骨鈣素水平[2]。有研究[3-4]顯示，特定位點齦溝液骨鈣素的水平可以反映局部牙槽骨的變化，可作為牙周炎局部病變代謝變化的標志。本實驗在成功建立大鼠牙周炎模型的基礎(chǔ)上，灌服骨碎補總黃酮，比較治療前后大鼠齦溝液骨鈣素水平(OC)以及牙槽骨骨密度的變化。探討骨碎補總黃酮對牙周炎大鼠牙槽骨骨代謝影響的機制，為臨床進一步運用其治療牙周炎提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 采用清潔級雄性 SD大鼠54只，體質(zhì)量250 g左右，購于西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心。于標準環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后實驗。

1.2 實驗試劑 骨碎補總黃酮(四川中藥研究所研制，批號961214)，使用時加滅菌水制成一定濃度溶液(0.36 g/L)灌胃，水合氯醛(國藥集團化學試劑有限公司)，骨鈣素放免藥盒(解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心，批號20060728)。

1.3 器械與設(shè)備 顯微持針器、眼科剪、平鑷、灌胃器、4-0號醫(yī)用編織線(上海浦東金環(huán)醫(yī)療用品有限公司)，全自動高溫高壓滅菌鍋(HV-50)，顯微CT(Inveon，Siemens，Germany)，SN-6105γ放射免疫計數(shù)器(上海核所日環(huán)光電儀器有限公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物模型建立 54只雄性SD大鼠標號后，隨機選擇18只大鼠作為正常組不加干預(yù)，正常飼養(yǎng)。余下36只適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，建立牙周炎模型。10%水合氯醛按0.38 mL/100 g體質(zhì)量，腹腔注射麻醉。四肢及頭部固定于木板上，開口器牽開口角，用4-0號絲線結(jié)扎雙側(cè)上頜第二磨牙頸部(頰側(cè)打結(jié)，并盡量壓入齦溝內(nèi))，從結(jié)扎當天起飼軟食、高糖水(葡萄糖100 g/L)，從大鼠上頜第二磨牙結(jié)扎絲線日起計算，建模時間共計4周。

1.4.2 實驗動物分組 大鼠牙周炎模型建立成功后去除結(jié)扎絲線，采用完全隨機分組方法將建模成功大鼠分為牙周炎組和骨碎補總黃酮組，與正常組大鼠一致，每組18只。從第5周開始，骨碎補總黃酮組灌胃骨碎補總黃酮240 mg/(kg·d)，正常組、牙周炎組均灌以相同體積的生理鹽水。各組分別在建模后第4，6，8周取實驗牙齦溝液后處死大鼠，截取雙側(cè)上頜骨，行顯微CT掃描，每組各時間點處死的動物均為6只。

1.5 觀察指標及檢測方法

1.5.1 齦溝液內(nèi)骨鈣素水平測定 將剪好的3個WhatmanⅠ號濾紙條(4 mm×1 mm)放入1個微離心管中高壓滅菌后稱重備用。取齦溝液時，將濾紙條分別輕輕插入實驗牙的近腭、腭、遠腭的牙周袋內(nèi)，遇阻力停滯30 s后取出。每顆受試牙的齦溝液(GCF) 總量為三者相加之和，按齦溝液密度=1計算體積，稱重后的樣本放回離心管，-70 ℃保存。測定前將樣本和試劑盒中各試劑取出，室溫下30 min解凍。每個微離心管管內(nèi)加入150 μL pH7.4的磷酸鹽緩沖液，浸泡并震蕩1 h后，12 000 r/min 4 ℃離心10 min，取上清液，用放射免疫分析法測定齦溝液OC水平，具體檢測步驟按骨鈣素放免藥盒使用說明進行。

1.5.2 牙槽骨骨密度測定 顯微CT掃描方式360°旋轉(zhuǎn)，電壓80 kV，電流80 μA。圖片分辨率1024×1024，層距20 μm，曝光時間2 960 ms。采用Micro-View系統(tǒng)對掃描所獲影像進行三維重建，CT值高于1 000定義為硬組織。選用三維興趣區(qū)間(3D ROI)工具，將大鼠上頜第二磨牙牙根內(nèi)側(cè)邊緣連接成一個四邊形，各線與根分叉區(qū)牙槽骨交叉邊界線即作為平面定選區(qū)域；以平面定選區(qū)域為起始，垂直于牙體長軸由根尖區(qū)范圍向根分叉處平移掃描，每20 μm為一個層面，垂直距離為1 200 μm，待所有層面完成后即形成一個三維興趣區(qū)。對各組大鼠上頜第二磨牙的三維興趣區(qū)進行掃描之后，獲取大鼠實驗牙牙槽骨的骨密度值。

2 結(jié) 果

2.1 齦溝液內(nèi)骨鈣素水平變化 正常組在整個實驗期間，骨鈣素水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；牙周炎組和骨碎補總黃酮組在建模4周后齦溝液OC水平顯著上升(P<0.05)；治療同時期內(nèi)，牙周炎組齦溝液OC水平明顯高于正常組和骨碎補總黃酮組(P<0.05)；8周時，骨碎補總黃酮組OC水平與正常組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組大鼠齦溝液中骨鈣素水平

注:與正常組相比，*P<0.05；與牙周炎組相比，#P<0.05。

2.2 牙槽骨骨密度變化 建模4周后大鼠牙槽骨骨密度與正常組相比顯著下降(P<0.05)。治療同時期內(nèi)，牙周炎組牙槽骨骨密度明顯低于正常組和骨碎補總黃酮組(P<0.05)；6周和8周時，骨碎補總黃酮組大鼠牙槽骨骨密度明顯高于牙周炎組(P<0.05)，但與正常組大鼠牙槽骨骨密度值尚有一定差別(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠牙槽骨骨密度變化

注:與正常組相比，*P<0.05；與牙周炎組相比，#P<0.05。

3 討 論

OC屬于γ-羧谷氨酸蛋白類，由成骨細胞合成分泌，不受骨吸收因素的影響。其能反映成骨細胞的活性，但更大程度上反映的是骨轉(zhuǎn)換，其水平高低可代表骨形成狀態(tài)。目前，OC在骨代謝中的生理功能尚不明確，但一般認為其可維持骨的正常礦化速率，抑制生長軟骨的礦化速率[5]。W.V.Giannobile等[6]在研究狗實驗性牙周炎時發(fā)現(xiàn)，齦溝液中骨鈣素有可能作為牙周病進展過程中的預(yù)測物；K.Nakashima等[7]在臨床研究中發(fā)現(xiàn)特定位點齦溝液OC水平可以反映局部牙槽骨變化。牙槽骨破壞吸收是牙周炎的主要病理變化之一，而OC作為骨代謝瞬間變化的一項特異的生化指標，可直接反映藥物對牙槽骨的骨形成和重建情況的影響。

以往主要通過組織病理學、X線影像學評價牙槽骨改建。但組織病理切片制作較為復(fù)雜，且無法定量分析，而X線片的二維性又決定了其在評價牙槽骨改建方面的局限性。而顯微CT可對興趣區(qū)內(nèi)的牙槽骨進行測量，能充分排除牙體組織對測量的影響，牙槽骨的骨密度水平也可良好體現(xiàn)牙槽骨改建情況，以評價藥物對牙周炎的治療作用。

中醫(yī)學理論認為，“腎主骨生髓”，腎虛導致骨質(zhì)疏松骨破壞。因此，補腎之法成為治療骨破壞之主法。骨碎補性苦、溫，入肝、腎經(jīng)。中醫(yī)主要用來治療跌打損傷、骨折、腎虛腰痛。骨碎補總黃酮作為中藥骨碎補中最主要的一種黃酮成分，體外研究表明其對成骨細胞體外培養(yǎng)的分化和增殖均有促進作用[8]；體內(nèi)實驗證實骨碎補總黃酮可促進骨組織愈合[9]，抑制大鼠炎癥關(guān)節(jié)骨破壞[10]。

本實驗以“牙頸部絲線結(jié)扎+高糖飲食”的方法建立SD大鼠牙周炎模型，建模后齦溝液OC水平顯著升高，牙槽骨骨密度顯著下降。其機制可能為：局部機械刺激誘導大鼠牙周組織發(fā)生炎癥反應(yīng)而造成牙槽骨吸收，大鼠牙槽骨骨間質(zhì)細胞外和血清內(nèi)的OC釋放入齦溝液，造成其水平升高。第6周時牙周炎組和骨碎補總黃酮組大鼠齦溝液OC水平、牙槽骨骨密度均顯示出上升趨勢，但牙周炎組OC水平顯著高于骨碎補總黃酮組(P<0.05)、骨密度顯著低于骨碎補總黃酮組(P<0.05)。其機制可能為：去除牙周炎刺激因素后，兩組大鼠都進入骨改建高峰期，而骨碎補總黃酮組的骨改建速率更快，在第6周時已顯示出趨于穩(wěn)定的趨勢。8周時，牙周炎組和骨碎補總黃酮組大鼠齦溝液OC水平都顯示出下降趨勢，牙槽骨骨密度都顯示出上升趨勢。但牙周炎組齦溝液OC水平顯著高于骨碎補總黃酮組(P<0.05)、骨密度顯著低于骨碎補總黃酮組(P<0.05)，且此時骨碎補總黃酮組OC水平已逐漸恢復(fù)至正常水平。其機制可能為：第8周時，兩組大鼠牙槽骨骨改建都有向平穩(wěn)發(fā)展的趨勢，但骨碎補總黃酮組改建速度更快，此時已接近正常水平。而齦溝液OC水平達到正常值的時間短于牙槽骨骨密度恢復(fù)正常的時間，也進一步說明了齦溝液中OC可作為牙周病進展過程中的預(yù)測物。綜上所述，對于牙周炎患者給予骨碎補總黃酮治療可能會促進牙槽骨重建、增加牙槽骨骨密度、有效減緩牙周炎進程，從而幫助患者早日康復(fù)，而利用骨碎補總黃酮治療牙周炎也值得進一步研究和推廣。

[1] 劉劍剛,謝雁鳴,徐哲,等.骨碎補總黃酮的活血化瘀作用及對實驗性微循環(huán)障礙和骨質(zhì)疏松的影響[J].中國骨質(zhì)疏松雜志,2006,12(1):46-49.

[2] 陳勇,肖潤梅,杜鵬,等.骨碎補、淫羊藿總黃酮與黃芪醇提物對維甲酸所致小鼠骨質(zhì)疏松的實驗研究[J].湖北大學學報(自然科學版),2007,29(2):189-191,195.

[3] 孫靖臨,孟煥新.齦溝液中骨鈣素含量與牙周炎的關(guān)系[J].中華口腔醫(yī)學雜志,2002,37(5):394.

[4] Bikle DD. Biochemical markers in the assessment of bone disease[J]. American Journal of Medicine,1997, 103(5):427-436.

[5] Lian JB, Gundberg CM. Osteocalcin Biochemical considerations and clinical applications[J]. Clinical Orthopaedics and Related Related Research, 1998，267-269.

[6] Giannobile WV,Lynch SE,Denmark RG.Crevicular fluid osteocalcin and pyridinoline cross-linked carboxyterminal telopeptide of type I collagen (ICTP) as markers of rapid bone turnover in periodontitis A pilot study in beagle dogs[J].Journal of Clinical Periodontology,1995,22(22):903-910.

[7] Nakashima K,Rochrich N,Cimasoni G.Osteocalcin,prostaglandin E2 and alkaline phosphatase in gingival crevicular fluid:their relations to periodontal status[J].Journal of Clinical Periodontology,1994,21(05):327-333.

[8] 謝雁鳴,秦林林,鄧文龍,等.骨碎補總黃酮對成骨細胞體外培養(yǎng)作用的機制研究[J].中華中醫(yī)藥雜志,2005,20(3):161-162.

[9] 吳靜,向?qū)W熔.骨碎補總黃酮對體外培養(yǎng)人牙周膜細胞總蛋白、超微結(jié)構(gòu)的影響[J].激光雜志,2012,33(6):81-83.

[10] 張鏑,賈志杰,田永利,等.骨碎補總黃酮與柚皮苷干預(yù)股骨干骨缺損模型大鼠骨愈合的比較[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù),2010,14(37):6947-6950.

Effect of Rhizoma Drynariae Flavone on the sulcular fluid level of osteocalcin and alveolar bone mineral denisity in periodontitis rats

ZengHui1,ZhaoXubing2,LiZixia1,ZhouFang1,TangChengfang1△.

1.DepartmentofStomatology,XianMedicalCollege,Xian710021,China; 2.DepartmentofEmergency,StomatologyMedicalCollege,XianJiaotongUniversity,Xian710004,China.

Objective To observe the effect of Rhizoma Drynariae Flavone on the sulcular fluid level of osteocalcin (OC) and alveolar bone mineral density during experimental periodontitis for its therapy mechanism. Methods The model of experimental periodontitis was established by means of silk ligatures around and high-carbohydrate diet. Then the animals were randomly assigned to three groups and received daily oral treatment. Four weeks after the ligure, Rhizoma Drynariae Flavone was given to rats of treatment group at a dose of 240mg/kg/d by gastric injuction, and the same amount of saline was given to rats of normal control and periodontitis group for same period. Six animals in each group were randomly selected and sacrigiced at 4, 6 and 8 weeks. OC was detected by radio immunoassay, alveolar bone density was detected by micro-computed tomographic. Results The level of OC in experimental periodontitis group was significantly higher than that in control group and treatment group (P<0.05), and the level of OC in treatment group was significantly lower than that in periodontitis group at week 6 and 8 (P<0.05). There were no statistical significantly differences between control group and treatment group at week 8 (P>0.05). The alveolar bone mineral density in periodontitis group was significantly lower than that in control and treatment group (P<0.05).The level of alveolar bone mineral density in treatment group was significantly higher than that in periodontitis group at weeks 6 and 8 (P<0.05). Conclusion Rhizoma Drynariae Flavone reduces the level of osteocalcin in the sulcular fluid, increases aoveolar bone mineral density. Rhizoma Drynariae Flavone could play an important role in treating periodontitis.

Periodontitis； osteocalcin； Alveolar bone mineral denisity； Rhizoma Drynariae Flavone

西安醫(yī)學院2015年青年科研基金項目(項目編號：2015QN11)；陜西省科技廳社會發(fā)展項目(項目編號：2015SF242S)

R-332,R784.1+2

A

1000-744X(2016)05-0460-03

2014-12-12)

△通信作者， E-mail：tangchengfang@sohu.com