瑞舒伐他汀對(duì)經(jīng)缺血再灌注處理的高脂血癥小鼠外周血清氧化相關(guān)物質(zhì)濃度的影響

鄧旭 趙躍萍 林琳 康景佳 賈大林△

(1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，遼寧 沈陽(yáng) 110031；2.武警遼寧省總隊(duì)醫(yī)院心內(nèi)科，遼寧 沈陽(yáng) 110034)

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瑞舒伐他汀對(duì)經(jīng)缺血再灌注處理的高脂血癥小鼠外周血清氧化相關(guān)物質(zhì)濃度的影響

鄧旭1趙躍萍2林琳2康景佳2賈大林1△

(1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，遼寧 沈陽(yáng) 110031；2.武警遼寧省總隊(duì)醫(yī)院心內(nèi)科，遼寧 沈陽(yáng) 110034)

目的 探討瑞舒伐他汀(rosuvastatin)對(duì)經(jīng)缺血再灌注(MI/R)處理后的高脂血癥小鼠外周血氧化相關(guān)物質(zhì)濃度及其心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響。方法 選取性成熟ICR小鼠60只，隨機(jī)分為三組(每組20只)：A組(假手術(shù)組)、B組(心肌缺血再灌注模型組)、C組(瑞舒伐他汀組，造模前連續(xù)給予瑞舒伐他汀3 d)，建立心肌缺血再灌注實(shí)驗(yàn)小鼠模型，阻斷左冠脈前降支(ADC)血流30 min后恢復(fù)血供。阻斷1 h后測(cè)定外周血清中GSH-PX、SOD、ROS、MDA濃度的變化及其前降支供血區(qū)心肌組織Bax與Bcl-2基因mRNA水平的表達(dá)。結(jié)果 C組小鼠外周血清GSH-PX、SOD活性值低于A組，高于B組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；C組小鼠外周血清ROS、MDA高于A組，低于B組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；C組小鼠心肌組織中Bax基因mRNA水平明顯高于A組，低于B組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；C組小鼠心肌組織中Bcl-2基因mRNA水平明顯低于A組，高于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 瑞舒伐他汀能改善經(jīng)缺血再灌注后高脂血癥小鼠心肌組織的氧化與抗氧化平衡失調(diào)并抑制心肌細(xì)胞凋亡。

瑞舒伐他汀； 心肌缺血/再灌注； 高脂血癥； GSH-PX； SOD； ROS； MDA； 凋亡

心臟冠狀動(dòng)脈介入治療后缺血組織發(fā)生的心肌缺血/再灌注損(MI/R)傷一直是介入治療需要解決的問(wèn)題，MI/R損傷與氧化/抗氧化平衡失調(diào)導(dǎo)致的血管內(nèi)皮損傷有關(guān)，而氧化/抗氧化平衡失調(diào)加重血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生凋亡[1-2]。瑞舒伐他汀(rosuvastatin)是他汀類降脂藥物中的新品種，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于抑制并延緩動(dòng)脈粥樣硬化與冠心病的治療，能很好地改善血管內(nèi)皮功能抑制內(nèi)皮細(xì)胞增生，此外還有一定的調(diào)節(jié)免疫、抑制炎性因子的作用[3]，但該藥在MI/R損傷抑制細(xì)胞凋亡與調(diào)節(jié)免疫方面還需進(jìn)一步研究，本實(shí)驗(yàn)以合并高脂血癥MI/R損傷ICR小鼠實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，并給予瑞舒伐他汀進(jìn)行干預(yù)，進(jìn)一步研究其具體作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 60只性成熟ICR小鼠(雌雄各30只)由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，周齡6～8周，28～32g(雌鼠)，30～34 g(雄鼠)，合格證號(hào)SCXK-(京)2012-0002。

1.2 藥品與試劑 瑞舒伐他汀為英國(guó)阿斯利康公司提供；GSH-PX、SOD、MDA、ROS酶活性檢測(cè)試劑盒為南京建成生物技術(shù)公司提供；血清TG、TC濃度檢測(cè)試劑盒為上海復(fù)星長(zhǎng)征有限公司提供；Trizol試劑盒為美國(guó)Invitrogen公司提供；RT-PCR檢測(cè)試劑盒由日本TaKaRa公司提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 生物分光光度計(jì)為BioPhotometer型，由德國(guó)Eppendorf公司提供；超速低溫離心機(jī)為美國(guó)Beckman公司提供；UA-265雙光道紫外分光光度計(jì)為日本島津公司提供；RT-PCR儀為美國(guó)Sigma公司提供。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與造模 60只小鼠用隨機(jī)數(shù)字法分為A、B、C三組，每組均為20只，每籠5只飼養(yǎng)(雌雄分開飼養(yǎng))，飼養(yǎng)溫度控制在20～26 ℃，12 h光照，12 h黑暗，顆粒飼料(高脂飼料)喂養(yǎng)28 d，自由飲水飲食，28 d后開始MI/R損傷動(dòng)物模型的制備。A組(假手術(shù)組)、B組(心肌缺血再灌注模型組)、C組(瑞舒伐他汀組，造模前連續(xù)給予瑞舒伐他汀3 d)。MI/R損傷模型制備：使用異氟烷吸入麻醉法，麻醉后接小動(dòng)物呼吸機(jī)，沿著胸骨左側(cè)縱向切開皮膚約1.5 cm，逐層分離表皮、皮下組織、肌肉、肋骨、胸膜(從第4肋間穿透胸膜經(jīng)膈肌進(jìn)入胸腔)，擠壓右胸廓，暴露出心臟，分離心包后暴露出左前降支冠脈(anterior descending coronary，ADC)并將其分離，用絲線(6.0)在ADC起始端打一活結(jié)，維持30 min后打開結(jié)[4]，A組小鼠只穿線不打結(jié)，B、C兩組打結(jié)，C組造模前3 d連續(xù)給予瑞舒伐他汀(每日空腹灌胃5 mg/kg，用0.9%氯化鈉溶解配成混懸液現(xiàn)用現(xiàn)配)，B、C兩組造模前3 d連續(xù)給予相同體積的0.9%氯化鈉灌胃，閉鎖ADC 30 min，松開后30 min后處死(頸椎脫臼法)小鼠，抽取靜脈血，測(cè)定氧化與抗氧化酶，切取心臟左室ADC供血區(qū)檢測(cè)凋亡相關(guān)基因mRNA水平表達(dá)。

1.5 GSH-PX、SOD、ROS酶活性及其MDA濃度測(cè)定 抽取1 mL靜脈血，注入玻璃試管中，靜置10 min，以3 000 r/min離心10 min，分離血清在-70 ℃超低溫冰箱內(nèi)保存待測(cè)。按試劑盒說(shuō)明測(cè)定GSH-PX、SOD、ROS活性并檢測(cè)MDA含量。所取標(biāo)本均在1周內(nèi)測(cè)定。

1.6 外周血清TG、TC濃度檢測(cè) 抽取的靜脈血保存于10 mL的玻璃試管內(nèi)，放于高速離心機(jī)(3 000 r.min-1)離心5 min后，用微量移液器抽取上層血清1 mL，隨后將血清放入容積為1.5 mL的離心管中，將離心管立即放于-30 ℃冰箱中冷凍保存，檢測(cè)時(shí)按試劑盒說(shuō)明分別檢測(cè)血清TG、TC濃度，所取標(biāo)本均在1周內(nèi)測(cè)定。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析，采用方差分析法分析各組小鼠的外周血清GSH-PX、SOD、ROS、MDA酶活性與心肌組織凋亡相關(guān)基因Bax、Bcl-2基因mRNA水平表達(dá)情況，分析前先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 外周血清氧化/抗氧化酶活性 C組小鼠外周血清GSH-PX、SOD活性值低于A組，高于B組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；C組小鼠外周血清ROS、MDA高于A組，低于B組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果見表1。

注:與A組比較，aP<0.05；與B組比較，cP<0.05。

2.2 凋亡相關(guān)基因表達(dá)情況 C組中Bax基因mRNA水平明顯高于A組(P<0.05)，低于B組(P<0.05)；C組中Bcl-2基因mRNA水平明顯低于A組(P<0.05)，高于B組(P<0.05)；C組中Bax/Bcl-2明顯高于A組(P<0.05)，低于B組(P<0.05)，兩基因mRNA水平表達(dá)量間呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.723，P=0.032<0.05)，結(jié)果見表2,圖 1。

表2 三組ICR小鼠心肌組織Bax、Bcl-2基因相對(duì) GAPDH基因mRNA水平表達(dá)量

注: 與A組比較，aP<0.05；與B組比較，cP<0.05。

圖1 三組ICR小鼠心肌組織Bax、Bcl-2基因相對(duì) GAPDH基因的相對(duì)mRNA水平表達(dá)量

3 討 論

瑞舒伐他汀商品名為可定，它是羥甲基戊二酰輔酶A(hydroxy-methy1-glutaryl coenzyme A，HMG-CoA)還原酶抑制劑中的一種，流行病學(xué)調(diào)查[5]顯示該藥物能顯著降低心血管事件的發(fā)生，并能很好地改善心血管功能?？啥ǔ擞泻芎玫慕档脱饔猛猓€有很好的抗血小板聚集、調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、抗炎作用，這些非降脂作用是目前研究的熱點(diǎn)[3]，S.Atar等[6]研究表明連續(xù)給予瑞舒伐他汀(10 mg/kg) 3 d，隨后造MI/R動(dòng)物模型，發(fā)現(xiàn)大鼠心肌梗死面積明顯少于未用瑞舒伐他汀組，戴一等[4]研究表明給予瑞舒伐他汀干預(yù)治療后外周血心肌組織Tunnel表達(dá)量明顯低于對(duì)照組。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在造模前給予瑞舒伐他汀預(yù)處理后可以明顯降低心肌組織的Bax基因mRNA水平表達(dá)升高Bcl-2基因mRNA水平表達(dá)，說(shuō)明能很好地抑制心肌細(xì)胞凋亡，與戴一等[4]研究結(jié)果相同。

合并高脂血癥的患者往往存在外周血的氧化/抗氧化平衡失調(diào)，維生素E等抗氧化劑能改善其氧化/抗氧化平衡失調(diào)[7]。他汀類降脂藥物有較強(qiáng)的抗氧化作用已經(jīng)得到了廣泛認(rèn)可[3]。線粒體是細(xì)胞內(nèi)能量物質(zhì)生成與儲(chǔ)存的重要場(chǎng)所，對(duì)缺氧缺血敏感性高，正常情況下，細(xì)胞內(nèi)部氧化/抗氧化處于平衡狀態(tài)，抗氧化體系(SOD、GSH-PX、維生素E、維生素C及其機(jī)體自身的調(diào)控技能如脂肪酶、蛋白酶、DNA修復(fù)酶等)能清除氧化物質(zhì)，但是缺血時(shí)線粒體不能進(jìn)行有氧氧化而進(jìn)行無(wú)氧酵解，能量產(chǎn)生減少，再灌注血液突然進(jìn)入時(shí)帶來(lái)的氧氣能在蛋白激酶C、髓化過(guò)氧化物酶、黃嘌呤氧化酶催化生成活性氧類物質(zhì)、單線態(tài)氧、過(guò)氧化氫和氫過(guò)氧基等物質(zhì)，同時(shí)產(chǎn)生大量類脂類物質(zhì)，大量的ROS、MDA產(chǎn)生，超出了SOD、GSH-PX等酶的清除能力，造成過(guò)氧化物質(zhì)集聚而導(dǎo)致?lián)p傷[8-10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：C組小鼠外周血清GSH-PX、SOD活性值低于A組，高于B組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；C組小鼠外周血清ROS、MDA高于A組，低于B組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，再次證實(shí)了瑞舒伐他汀有著很強(qiáng)的抗氧化活力。其抑制凋亡作用可能與其抗氧化作用有關(guān)。

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Effect of Rosuvastatin on concentration of oxidative related substances after myocardial ischemia/reperfusion in mouse with hyperlipemia

DengXu1,ZhaoYueping2,LinLin2,KangJingjia2,JiaDalin1.

1.DepartmentofCardiology,theFirstAffiliatedHospitalofChinaMedicalUniversity,Shenyang110031,China. 2.DepartmentofCardiology,LiaoningProvincialCorpsHospitalofChinesePeople'sArmedPoliceForces,Shenyang110034,China.

Objective To explore the effect of Rosuvastatin on concentration of oxidative related substances after myocardial ischemia/reperfusion in mouse with hyperlipemia and the expression of apoptosis gene. Methods 60 viripotent female ICR mice were randomly divided into A, B, C three groups, every group included 20 mice which were A group (Sham group, Sodium Chloride injected,n=20), B group (Model group, the model of myocardial ischemia/reperfusion,n=20), and C group (MI/R model after given Rosuvastatin last 3 days,n=20). The model of MI/R was made,reperfusion after blocking the anterior descending coronary for 30 min. After blocking ADC 1 h, and that were detected the oxydic (ROS, MDA) and antioxidative (GSH-PX, SOD) index and the gene of Bax and Bcl-2 in the level of mRNA in the cardiac muscle of ADC blood-supply and the concentration of TG, TC in the serum. Results The activity of GSH-PX, SOD in the C group were lower than A group, higher than B group, and the activity of ROS and concentration of MDA in the C group were higher than A group, lower than B group, and there were statistical significantly differences (P<0.05); The expression of Bax in the level of mRNA in the C group were super than A group, lower than B group, and the expression of Bcl-2 in the level of mRNA in the C group were lower than A group, higher than B group and there were statistical significantly differences (P<0.05). Conclusion Rosuvastatin can improve the unbalance of oxydic and antioxidative after myocardial ischemia/reperfusion in mouse with hyperlipemia and inhibit apoptosis of cardiac muscle.

Rosuvastatin； Myocardial ischemia/reperfusion； Hyperlipemia； GSH-PX； SOD； ROS； MDA； Apoptosis

遼寧省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2014021066)

R-332,R541.4

A

1000-744X(2016)05-0453-03

2015-08-01)

△通信作者，E-mail: 736724666@qq.com