豬圓環病毒病2型診斷技術的研究進展

龍冬梅，湯德元，黃 濤，王 彬，曾智勇，胡玲玲，石遠菊，葉 麗，楊 偉，韋冠東

（貴州大學動物科學學院，貴州 貴陽 550025）

豬圓環病毒病2型診斷技術的研究進展

龍冬梅，湯德元*，黃 濤，王 彬，曾智勇，胡玲玲，石遠菊，葉 麗，楊 偉，韋冠東

（貴州大學動物科學學院，貴州 貴陽 550025）

豬圓環病毒(PCV)是迄今為止發現的一種最小的脊椎動物病毒，可引起斷奶仔豬進行性消瘦、淋巴組織等組織病變的一種多系統衰竭綜合征的重要傳染病，臨床上主要與斷奶仔豬多系統衰竭綜合征（PMWS）、豬皮炎腎病綜合征（PDNS）、仔豬先天性震顫（CT）、壞死性間質性肺炎（PNP）及母豬繁殖障礙等疾病有關。根據病毒致病性的差異，以及核苷酸序列和抗原性的不同，將豬圓環病毒分成無致病性的豬圓環病毒1型（PCV1）和具有致病性的豬圓環病毒2型（PCV2）。本文從病原學診斷、血清學診斷和分子生物學診斷等方面綜述了當前國內外PCV2常用的實驗室診斷方法的研究進展，可為臨床上豬圓環病毒病的確診提供參考。

豬圓環病毒2型；病原學診斷；血清學診斷；分子生物學診斷；快速檢測技術

豬圓環病毒(Porcine circovirus，PCV)是1974年德國學者Tischer從PK15細胞中發現的一種不產生細胞病變的污染病毒，開始一直未被重視，所以在豬群中廣泛傳播。直到1982年Tischer等[1]通過實驗分離鑒定了該病毒后將其命名為豬圓環病毒，PCV隸屬于圓環病毒科、圓環病毒屬，基因組為單股單股負鏈閉合環狀DNA病毒。病毒粒子直徑為14～25 nm，為二十面體對稱結構，無囊膜，是迄今為止發現的一種最小的脊椎動物病毒。根據其致病性、抗原性以及核酸序列的不同，將其分為無致病性的PCV-1型和致病性的PCV2型。兩種基因型的基因組序列長度不一樣，前者為1 759 bp，后者為1 767 bp或1 768 bp?，F在許多國家的豬圓環病毒感染都是PCV2感染。PCV2在臨床上主要與斷奶仔豬多系統衰竭綜合征（PMWS）、豬皮炎腎病綜合征（PDNS）、仔豬先天性震顫（CT）、壞死性間質性肺炎（PNP）、母豬繁殖障礙等疾病有關。此外，PCV2還侵害機體的免疫系統，增加其他病毒和細菌感染的幾率，從而導致豬群的死亡率增加。近年來PMWS在我國豬群中呈流行趨勢，造成了很大的經濟損失。由于豬群中普遍存在PCV抗體，血清學診斷結果并不準確可靠，所以本病的診斷工作一般都在病豬死亡后進行。同時，PMWS的癥狀和病變與豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS)基本相似，所以僅憑癥狀、病理變化及流行病學調查很難做出準確的判斷。目前，對PCV2的診斷主要是先通過臨床癥狀結合病理變化進行初步判定，再結合實驗室檢驗來確診。本文將主要對PCV2的實驗室診斷方法進行綜述，以便為臨床上豬圓環病毒病2型的確診提供依據?，F將豬圓環病毒病2型診斷技術綜述如下。

1 病原學診斷

1.1 病毒的分離鑒定

采集PMWS病死豬肺、肝、脾、扁桃體及淋巴結等組織研磨制成病料與PBS液體積比為1：5的懸液，在-20 ℃反復凍融3次后12 000 r/min離心20 min，取上清液用220 nm濾器過濾后接種于已長成單層且無PCV污染的PK-15細胞，37 ℃吸附1 h（期間每15 min輕搖一次），然后加入5 mL含2%胎牛血清的MEM/DMEM細胞維持液，37℃培養24 h后倒掉細胞培養液，用300 mmol/L D-氨基葡萄糖處理后用pH為7.4的10 mmol/L無菌PBS洗滌2次，然后加入5 mL含2%胎牛血清的MEM/DMEM細胞維持液，37 ℃培養48～72 h后傳代培養，12 h后用300 mmol/L D-氨基葡萄糖溶液處理30 min，棄去D-氨基葡萄糖用pH為7.4的10 mmol/L無菌PBS洗滌2次，然后加入10%胎牛血清的MEM細胞營養液培養，因為PCV2接種細胞后不產生細胞病變（CPE），需連續盲傳1-3代后進行PCV2抗原或核酸的檢測加以鑒定，也可用免疫熒光技術（IFA）檢測病毒的生長情況，或者借助電鏡技術和超薄切片法來觀察PCV病毒粒子。本方法費時費力，不適于臨床上疾病的快速診斷。

在我國，郎洪武等[2]用豬腎傳代細胞Dulac株分離到了2株豬圓環病毒。湯德元等[3]將貴州分離到的豬圓環病毒提取的DNA通過PCR技術擴增PCV ORF2基因，克隆到pMD19-T載體并測序，后將構建好的T載體雙酶切，然后將回收的目的片段與pET-32a(+)載體及pcDNA3.1(+)載體連接并轉化入感受態細胞TOP10中構建原核及真核表達載體，并將ORF2基因插到重組質粒pcDNA3.1-IL-2上，構建以IL-2融合表達真核載體。結果表明：克隆的PCV ORF2基因全長為719 bp，ORF為702 bp，編碼233個氨基酸，與GenBank公布的PCV ORF2基因的核苷酸同源性為98.4%。國內很多研究人員分別從各地的病豬上分離到了多株豬圓環病毒。

1.2 電鏡觀察法

利用電鏡技術將感染豬淋巴或病毒細胞培養物制成切片在電鏡下觀察，則可從平面上觀察到病毒的內部結構，形態大小，復制方式等，再結合病毒自身所具有的形態、大小及結構等不同特征即可對觀察到的病毒做出準確的判斷。

G W Steveson等[4]在透射電鏡下觀察感染PCV2的PK-15細胞，將細胞病毒液反復凍融3次，8 000 r/ min離心30 min后棄沉淀再將上清液40 000 r/min超速離心3 h，棄掉上清液，用0.01 mol/L pH 8.0的TE緩沖液重懸沉淀并收集，通過透射電鏡觀察到了PCV2，并首次詳細描述了細胞的胞漿與細胞核內的病毒包涵體及病毒粒子的形態。

2 血清學檢測

2.1 酶聯免疫吸附試驗

酶聯免疫吸附試驗（ELISA）是將抗原或抗體吸附于固相載體，在載體上進行免疫酶染色，底物顯色后用肉眼或酶標儀測定結果的一種方法。這種方法特異性高、敏感性強、檢測速度快、可一次檢測大批量的樣品，既可以檢測抗原，又可以檢測抗體，是目前應用最多最廣也是發展最快的檢測方法。

2000年，郎洪武等[2]用加拿大的PCV2克隆化特異性表達抗原、陽性血清、陰性血清，按照常規方法進行PMWS抗體的檢測，將被檢血清按1：400稀釋，陽性和陰性對照血清按1：100稀釋，當被檢樣品的OD值是陽性對照OD值的3倍時判為陽性，否則為陰性，此方法證明ELISA的靈敏度比較高。

2.2 競爭性酶聯免疫吸附試驗

2000年，Walker等[5]首次利用PCV1和PCV2特異性單克隆抗體建立了競爭ELISA（C-ELISA）方法來檢測PCV2抗體。利用細胞培養的PCV2作為抗原，PCV2特異性單克隆抗體作為競爭試劑，成功建立了C-ELISA，將此法與間接免疫熒光方法相比較，結果表明C-ELISA方法的檢出率為99.58%，高于間接免疫熒光方法的97.14%，證明此方法與間接免疫熒光相比更加敏感，可用于PCV抗體的大規模監測。

2.3 間接免疫熒光試驗

間接免疫熒光技術（IFA）是一種比較特異的血清學方法，主要用于病毒分離效果的鑒定及監測病變組織或豬源細胞PCV的感染情況，其特點是快速、特異、敏感、花費少，既可以檢測豬群特異性抗原又可以檢測特異性抗原，應用較廣泛。

2004年，Racine S[6]等將PCV2 IAF-2897株的ORF2克隆入真核表達載體pCEP5中，并獲得了大量的表達，他們用IFA技術對PMWS豬場的44份血清樣品進行了檢測，結果15份為PCV2陽性，檢出率為57.1%。2002年，我國的蘆銀華等[7]也應用間接熒光技術對幾個地區的64份臨床血樣進行了檢測，結果38份血清呈現PCV抗體陽性（59%），這表明PCV已在我國普遍流行。

2.4 抗原捕獲ELISA

Mcneilly F等建立了抗原捕獲ELISA方法用來診斷PMWS。在與病毒分離、IHC和聚合酶鏈式反應技術(PCR)等方法的比較中，除PCR外，其他方法均可鑒別PWMS與PCV2的亞臨床感染。

周松海[8]將純化得到的高純度單克隆抗體包被在96孔酶標板上，0.5% BSA封閉后加入到Cap蛋白中，Cap蛋白與包被的抗體發生特異性反應也結合在酶標板上，可以用來檢測血清中的PCV2抗體。對反應條件進行摸索優化，確定包被抗體的最佳稀釋度為1∶3 200，與之結合的Cap蛋白最佳稀釋度為1∶2 000（即濃為3.52 μg/mL），被檢血清最佳稀釋度為1∶40，鼠抗豬酶標二抗最佳稀釋度為1∶16 000，以此建立的捕獲ELISA方法的臨界值為0.2，即若血清樣品OD630nm值大于0.2則判為陽性，反之則判為陰性。對建立的捕獲ELISA方法進行敏感性、特異性和重復性研究，確定此方法具有良好的敏感性、特異性和重復性。

2.5 免疫膠體金技術

免疫膠體金技術(ICGT)的原理是用紅色膠體金為標記物，以微孔濾膜為載體，通過滲濾而逐步反應，3～5 min便可完成整個反應。王慧杰等[9]通過克隆和表達豬圓環病毒Cap蛋白基因的羧基端，結合膠體金標記技術，建立了PCV2 Cap抗體膠體金檢測方法。用ELISA驗證結果顯示表達蛋白免疫原性較強且能準確地區分PCV2的陽性血清和標準陰性血清，與豬其他病毒免疫血清無交叉反應，其檢測靈敏度與ELISA相似。

2.6 免疫過氧化物酶單層細胞試驗

免疫過氧化物酶單層細胞試驗(IPMA)方法基本原理是將生長有PCV的PK-15細胞在96孔板上長成單層后，加入10倍稀釋的待檢豬血清，作用一段時間后吸干（或拍干）洗滌，再加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的豬IgG抗體，37 ℃孵育30 min，吸干（或拍干）洗滌后加入底物溶液顯色，然后終止反應以檢測血清中的抗體。黃立平等[10]建立了一種檢測PCV-1血清抗體的IPMA方法。利用該方法對257份血清樣品進行檢測，結果顯示，PCV1和PCV2陽性率分別為19.1%和80.5%，且PCV1陽性血清中有95.9%為PCV2陽性，表明臨床上PCV1與PCV2在豬群中混合感染程度高。劉長明等[11]將IPMA方法改進后，研制出一種新的IPMA抗體檢測試劑盒，適用于豬血清中PCV2抗體檢測，且該方法具有特異性強、敏感性高、操作簡便等優點。

3 分子生物學診斷技術

分子生物學診斷技術主要應用分子生物學方法檢測組織病料或細胞培養物中的病毒核酸，主要包括PCR診斷技術、熒光定量PCR技術 (FQ-PCR)、環介導等溫擴增技術（LAMP）、PCR產物限制性片段長度多態性((PCRRFLP)、原位雜交實驗（ISH）、基因芯片檢測技術(DNA chip)和核酸雜交檢測技術等方法。分子生物學診斷技術具有簡單方便、準確性高、特異性強、靈敏度高、檢測速度快等優點。

3.1 PCR診斷技術

3.1.1 常規PCR診斷方法

常規PCR檢測是一種簡便、快速、特異的診斷方法。利用Primer等軟件設計一對PCV2特異性引物，可直接從經過處理的病料或細胞中擴增出PCV2特異的基因組片段，以達到特異檢測PCV2感染的目的。

湯德元等[12]應用血清學檢測和PCR/RT-PCR檢測對某規?；i場病料進行檢測，結果發現PCR/RT-PCR結果顯示該豬場為PCV2與豬流感病毒（SIV）混合感染。胡玲玲等[13]通過臨床癥狀觀察、病理剖檢及PCR檢測等方法進行診斷，確診貴州省某規?；i場母豬產死胎、產后仔豬腹瀉、發病仔豬死亡是豬圓環病毒2型感染所引起的。

3.1.2 多重PCR診斷方法

多重PCR（Multiplex PCR）是一種特殊的PCR技術，它可以同時檢測2種或2種以上的病毒DNA/RNA，即在同一反應中加入多對引物，可以同時擴增多個目的基因片段。該方法方便、簡單、快捷，已廣泛應用于疾病的快速診斷。

崔尚金等[14]根據GenBank中20株PCV2核苷酸序列設計兩對引物，建立了能同時區分PCV1和PCV2的多重PCR方法，且該方法具有良好的特異性和敏感性。

湯德元等[15]根據GenBank登錄的病毒相關基因序列，選擇保守區域設計引物，經過反應條件的優化，建立了可同時檢測PCV2、偽狂犬病毒（PRV）和豬細小病毒（PPV）三種病毒的檢測方法，三種核酸檢測的最低濃度為2.2×10-3、2.5×10-2和3.7×10-2ng，證明該方法具有良好的特異性和較高的敏感性。

3.1.3 巢式PCR

巢式PCR（nested PCR）和常規PCR及多重PCR相比更加敏感，當組織病料或細胞中的PCV2模板DNA含量太少時，用這一方法檢測比較靈敏。

Kim J等[16]于2001年建立了巢式PCR方法，他們從福爾馬林固定的、石蠟包埋的組織中檢測到了PCV2病毒，并將該方法同傳統的PCR方法和原位熒光雜交做了比較，結果所有37份陽性樣品用巢式PCR和原位雜交均能全部檢出，而傳統的PCR方法只能檢出26份，該研究表明：巢式PCR方法和原位雜交均可用于PCV2感染的診斷和檢查。

3.1.4 競爭PCR

競爭定量PCR（c-PCR）是預先構建一個具有與靶基因相同的擴增效率和引物結合位點，但探針結合位點內標的不同。在同一個反應管中，靶基因和內標競爭性地與引物結合，進行同步擴增。因為二者是競爭關系，所以當一種模板量逐漸增加時，另一種模板的擴增產物就會相對逐漸減少，但是兩種擴增產物的比值和兩種初始狀態時模板分子數的比值是一致的。所以根據標準品的準確含量制作標準曲線可以進行準確核酸定量。該方法不僅具有PCR方法自身靈敏、特異、快速、簡便等優點，還具有簡便和定量準確的特點。

崔尚金等[17]應用PCR技術將PCV2 ORF2上490 bp片段P3P4基因擴增后克隆到pMD 18-T載體以獲得目標模板。然后構建含692 bp的c-P3P4 DNA片段的競爭模板，其攜帶與目標DNA和靶DNA相同的引物結合區。以定量的競爭模板同一系列稀釋的競爭模板進行競爭PCR擴增，以產物的熒光強度(IOD)繪制標準曲線，結果當反應體系中起始模板的量為1.0×107cop/μL，循環次數小于或等于30時，原始模板數以指數增長。由此確定目標模板和競爭模板的最適工作濃度并用該方法檢測感染細胞內的PCV2基因組的拷貝數和臨床樣品中的PCV2 DNA含量，結果發現臨床樣品中的PCV2 DNA含量達到一定程度(肺中1.0145×107copies/ mL，血中0.8×107copies/mL，淋巴中9.698×108copies/mL)，豬表現臨床癥狀，而病毒在感染細胞內的復制在80 h基因的拷貝數達到最高，這為今后的研究莫定了基礎。

3.2 熒光定量PCR技術

熒光定量PCR (FQ-PCR)技術是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。

Brunborg等[18]建立了以TaqMan為基礎的實時定量PCR方法，用于血清、血漿及組織樣品中的PCV2的定量檢測。用該法測定動物中的病毒載量，對鑒別健康豬和帶PCV2的病豬十分有用。張福良等[19]采用PCR方法克隆了PCV2 ORF2基因，將構建的重組質粒pMD-ORF2作為PCV2 FQ-PCR檢測的標準陽性模板，對該模板進行了酶切及測序鑒定結果顯示，此FQ-PCR具有特異性強，穩定性好，準確性和重現性都很高，在-20 ℃條件下保存20 d都沒有顯著的變化。

3.3 實時定量PCR

實時定量PCR (Real-time PCR)技術是指用SYBR Green熒光染料或熒光探針通過連續監測熒光信號強弱的變化來測定特異性產物的量，以此達到精確定量起始模板數的目的，且不需要取出PCR產物進行分離。該技術可對PCR定量，且和常規PCR相比，它具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高的特點，目前已被廣泛地應用于分子生物學檢測研究的各個領域。

Mcintosh等[20]利用建立的Realtime PCR方法，在臨床血清、肝臟、腎臟、糞便、心肌層、腸系膜淋巴結組織中均能成功檢測出PCV2。Brunborg IM等[18]建立了以Taq Man為基礎的實時定量PCR方法，用于血清、血漿及組織樣品中的PCV2的定量檢測。

3.4 PCR產物限制性片段長度多態性（PCR-RFLP）

這種方法是指在生物進化過程中DNA堿基序列插入、缺失或者改變，從而導致限制性核酸內切酶的識別位點發生改變，是以PCR快速有效的增微量的DNA利用限制性酶進行多態性分析的一種方法。這種方法分2步：首先利用PCV1與PCV2的共同引物進行PCR擴增；然后用一定的限制性內切酶對PCR產物進行酶切，電泳觀察片段差異，從而確定PCV的類型為PCV1或PCV2。此方法充分考慮了引物序列在不同毒株間的保守性和酶切位點的特異性，此方法可對不同地區來源的毒株進行檢測分型，對不同地區PCV的分子流行病學調查以及PCV2相關疾病的診斷與研究具有重要的意義。

王新等[21]借助RFLP方法對PK-15細胞、IBRS-2細胞以及疑似豬斷奶后多系統衰竭綜合征(PMWS)、豬皮炎腎炎綜合征(PDNS)的病料進行了PCV檢測以及血清型的鑒定。

3.5 環介導等溫擴增技術

環介導等溫擴增技術(LAMP)基本原理是利用能夠識別靶序列上6個特異區域的2-3對引物和一種具有鏈置換特性的Bst DNA聚合酶，在等溫條件(65 ℃左右)下能高效、快速、高特異性地擴增靶序列。

Chen等[22]利用Cap蛋白基因設計6對特異引物建立了PCV2LAMP檢測方法，整個反應在64 ℃條件下1 h內完成，其DNA檢測極限為5個拷貝；靈敏度是PCR的10倍，且與PCV1， PPV，PRV及豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）無交叉反應。與傳統的PCR技術相比，該方法具有靈敏度高、特異性強、操作簡便、快速、不需要復雜儀器設備、擴增結果可以憑肉眼便能直接觀察等優點，為臨床檢測PCV2提供了一種快速簡便的新方法。

3.6 原位雜交實驗（ISH）

根據所用探針的特異性不同，可將ISH方法分為3類，包括同時檢測PCV但不能進行分型的ISH；可對PCV1和PCV2進行分型的ISH及檢測PCV2與PPV或PRRSV混合感染的ISH。

2002年，Kin J等[23]建立了檢測和區分PMWS患豬體內的PCV1和PCV2的雙重標記原位雜交技術。他們用地高辛標記的PCV1探針，生物素標記的PCV2探針，檢測了經福爾馬林固定的、石蠟包埋的組織，經熒光鏡下檢查，2種雜交信號分別顯示紅色和暗橙色。同年，Sirinarumitr T等[24]用針對PRRSV的地高辛標記的RNA探針和針對PCV的熒光標記的RNA探針同時進行原位雜交，表明該方法不僅可同時檢測2種病毒的感染，而且還可為確定這2種病毒是否共同感染了同一細胞提供了證據。

3.7 基因芯片檢測技術

基因芯片(DNA chip)檢測技術是指將許多特定的寡聚核苷酸或DNA片段(稱為探針)固定在芯片的每個預先設置的區域內，將待測樣本標記后和芯片進行雜交，利用堿基互補配對的原理進行雜交，通過檢測雜交信號再通過計算機分析來檢測對應片段是否存在及存在量的多少，以用于疾病的臨床診斷和檢測等。是近年來分子生物學與微電子學等多學科交叉融合而成的一項高新技術。

肖馳等[25]根據PCV2、PRRSV和豬瘟病毒（CSFV）的基因序列選取靶標，制備相應的探針并構建DNA芯片，能同時檢測出PCV2、PRRSV和CSFV感染。該方法除了特異性強、靈敏度高等優點外，還具有高通量、并行性和結果判讀客觀、準確和信息化的特點。但該方法目前費用較高，限制了其實際應用。

3.8 核酸雜交檢測技術

核酸雜交是指核酸分子單鏈之間由互補的堿基順序，通過堿基對之間非共價鍵形成穩定的雜交雙鏈。姜永厚等[26]應用該技術建立了一種快速檢測及鑒定PCV基因型的方法。臨床檢測結果表明該技術能準確鑒定PCV的基因型，且其靈敏度較凝膠電泳高。因此該技術適用于PCV臨床檢測及分子流行病學調查。

目前PCV2及相關的疾病已經在全世界范圍內廣泛發生和流行，給養豬業造成了嚴重的威脅。引起了國內外學者的廣泛關注，國內外學者對PCV2的診斷方法進行了大量的研究，到目前為止，雖然已經建立了多種PCV2的診斷方法，取得了一定的研究進展，但各種診斷方法都有其局限性，因此要根據試驗的目的要求，并結合具備的條件選擇適宜的檢測方法對豬圓環病毒進行檢測。所以進一步開展對PCV2診斷方法的研究，實現診斷方法簡便性、診斷試劑商品化是十分必要的，以便及時地檢測出隱性感染豬和對臨床發病豬進行原發性病原的確定，及時對本病進行綜合防治，以減少本病所造成的經濟損失，從而保障我國養豬業的健康發展。

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2017-05-05)

貴州省農業攻關項目資助(黔科合NY字[2014]3055號)；貴州省科學技術基金項目資助(黔科合J字[2013]2110號)。

龍冬梅(1990-)，女，碩士研究生，主要從事動物傳染病病原分子生物學的科研學習。

*通訊作者：湯德元(1964-)，男，教授，博士，碩士生導師，主要從事動物傳染病病原分子生物學和中西獸醫結合的教學科研工作。E-mail:tdyuan@163.com