結核分枝桿菌吡嗪酰胺耐藥相關基因研究進展

曹志敏，陳 玲

結核分枝桿菌吡嗪酰胺耐藥相關基因研究進展

曹志敏，陳 玲

吡嗪酰胺是治療結核病的重要抗結核藥物之一，特別是用于耐多藥結核病的治療。近年來結核分枝桿菌對吡嗪酰胺的耐藥逐漸增多，其耐藥機制尚未明確。本文針對結核分枝桿菌吡嗪酰胺耐藥及其與基因變異之間的關系研究進展進行綜述，以供研究者參考。

結核分枝桿菌；吡嗪酰胺；基因變異；耐藥機制

吡嗪酰胺 (pyrazinamide，PZA)，又名異煙酰胺，為煙酰胺結構類似物，具有獨特的滅菌活性，酸性條件下可殺滅處于半休眠期結核菌和持留菌，而其他抗結核藥物卻難以做到[1-2]。吡嗪酰胺抗結核療效顯著且與其他抗結核藥物聯用可縮短抗結核化療周期，故被世界衛生組織(World Health Organization，WHO)推薦用于藥物敏感的結核病及耐多藥結核病的治療[3-4]。近年來結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)對PZA耐藥逐漸增多，研究報道在所有結核病中其1耐藥率約為16.2% (95%CI11.2-21.2)[5]，且認為其耐藥性的產生可能與細菌對利福平獲得性耐藥有關[6]。2016年全球結核病報告顯示在對利福平敏感的菌株中0.5%～4.2%的菌株對PZA耐藥，對利福平耐藥的菌株中36.7%～81.3%的菌株對PZA耐藥[4]，在具有耐多藥結核病(Multidrug resistance tuberculosis，MDR-TB，指結核分枝桿菌至少同時對異煙肼和利福平耐藥) 高風險的結核病患者中，結核分枝桿菌對PZA的耐藥率為41.3% (95%CI29.0-53.7)，在MDR結核分枝桿菌中PZA耐藥率達60.5% (95%CI52.3-68.6)，而在非MDR結核分枝桿菌臨床分離株中PZA耐藥率則為5%左右[5,7]。目前MTB對PZA耐藥的機制尚不完全清楚，隨著結核病疫情的加重及耐藥結核病出現及傳播，MTB對PZA的耐藥機制已備受關注。

目前多數研究認為PZA耐藥主要與MTB的某些基因變異后引起細菌對吡嗪酰胺的處理能力降低及細菌物質代謝改變等有關，如pncA、rpsA及PanD等基因。此外，也有文獻報道其他基因如脂肪酸合成酶I(FAS-I)基因、長鏈脂酰輔酶A連接酶D2編碼基因及嘧啶合成相關基因等變異也可能與MTB對PZA耐藥有關?，F將目前文獻已報道的可能與PZA耐藥產生有關的相關基因情況簡述如下。

1 pncA基因

pncA基因全長為561 bp，僅編碼186個氨基酸，但其突變位點繁多、復雜。目前大多數研究認為MTB對PZA耐藥主要與細菌pncA基因變異有關[8]，早前有文獻報道PZA表型耐藥與pncA基因變異的相關性約達85%左右[3]。PZA與其他抗結核藥物不同，必須在酸性環境中才能發揮強的抗菌活性，且其活性隨細胞內pH值的降低而增強。PZA通過被動轉運的方式進入MTB細胞內，被細菌細胞內吡嗪酰胺酶(pyrazinamidase，PZase，由MTB的pncA基因編碼)水解活化成其活性形式吡嗪酸(pyrazinoic acid，POA)并在細胞內蓄積，從而發揮強的抗結核作用[1,9]。pncA基因二級結構上有明確的PZase活性中心和金屬離子結合位點，以其為基礎將該基因分為3個部分，包括4個α區(α1-α4)、6個β區(β1-β6)及10個L區(L1-L10),其中PZase活性中心主要分布在L2、L7區域，L4為金屬離子結合位點區域，兩者均為對酶活性影響較大的區域且基因突變發生率較高，靠近這些位點的基因突變對酶活性的影響較具遠離這些區域位點的突變大[10]。目前為止，研究報道pncA基因突變類型已達270多種，在72%～97%的吡嗪酰胺耐藥菌株中，其突變位置散在分布于基因上游調控序列及下游序列的多個位置，但在整個pncA全基因中尚未發現與耐藥密切相關的特定的“熱點區域”[1,9,11]。

吡嗪酰胺酶由MTB的pncA基因編碼，當結核分枝桿菌pncA基因變異后，可引起吡嗪酰胺酶蛋白結構不穩定和活性改變，從而喪失了將PZA有效轉化為POA的能力，引起MTB對PZA耐藥，研究發現對PZA耐藥的MTB菌株其吡嗪酰胺酶活性常常降低或喪失，這可能是MTB對PZA耐藥最主要的分子機制[9,12]。pncA基因突變形式以單核苷酸多態性(堿基置換)為主，也包括少數堿基缺失或堿基插入引起的移碼或整碼突變[9]。結核分枝桿菌PZA耐藥相關因素的多中心研究中，對pncA基因突變位點與PZA耐藥的關系進行風險評估，將其分為高度與PZA耐藥相關、與PZA耐藥相關性不清楚及與PZA耐藥無明顯相關性等3類，發現啟動子區域的突變A-11G(C)、T-7G及pncA基因編碼區中T2C、T17C、G19T、A29C、C102A、T104C、A146C、A152G、C174G、T192G、C211T、A226C、A286G(C)、T307G、C309G、C312A、G373T、390+G(G)、A403C、T416G、G463A、T490C、A523G等位點與結核分枝桿菌對PZA耐藥相關具有高度相關，其中以啟動子區域A-11G最常見，并認為該位點的突變可能與影響細菌蛋白質的合成和細胞核糖體對mRNA的結合等過程有關，而A188C、A460G等位點的變異是否與結核分枝桿菌PZA耐藥有關尚不清楚[13-15]；A146C位點的突變則與PZA耐藥無明顯相關性[16]。近年來有研究在高水平PZA耐藥(MIC>500 mg/L)的MTB臨床分離株中檢測到pncA基因變異主要集中在51-76、130-142及163-180三個編碼區，而在94-97、11-16兩個區域內也有相關MTB菌株呈低水平PZA耐藥(MIC≤500 mg/L)[11]。盡管多數研究認為pncA基因變異是MTB對PZA耐藥的主要原因，但并不是所有PZA耐藥菌株都會發生pncA基因突變。研究發現3%～28%的PZA耐藥菌株卻無該基因變異，且有些發生突變的菌株仍可檢測到PZase活性，提示可能該突變不能或不足以使PZase活性改變，也有研究在對PZA敏感MTB菌株中檢測到pncA基因變異[1-2]。此外，因吡嗪酰胺發揮抗結核活性對酸性條件實驗要求使得藥物敏感試驗困難，可能出現假陽性耐藥或者假陰性敏感等，亦可能還存在其他的耐藥機制。

2 rpsA基因

rpsA基因全長1 446 bp，編碼長為481個氨基酸的30S核糖體蛋白質S1(RpsA)，研究認為該蛋白是POA的新型作用靶點，可能與MTB對其耐藥性產生有關。有研究在PZA低水平耐藥的MTB臨床分離株DHM444中檢測到在rpsA基因靠近C端的438位點存在3個堿基GCC的缺失(編碼丙氨酸)，而該菌株卻未發現pncA基因變異[17]。RpsA在細菌的“蛋白質翻譯”過程中起重要作用，POA通過與有活性的RpsA結合來干擾MTB的“反式翻譯”過程，從而影響細菌蛋白質的合成，發揮滅菌作用，且rpsA基因的表達水平與MTB生長速率、停止細菌生長的重要條件及下調細菌RpsA蛋白表達量等有關，當rpsA基因過表達時，細菌轉化的POA不能與RpsA有效結合，影響MTB蛋白質的合成而對其產生耐藥，這也有助于解釋了為什么MTB處于饑餓狀態、酸性pH、缺氧及能量抑制等情況時可以增強PZA的活性[17]。有學者通過對比PZA耐藥菌株和敏感菌株的rpsA基因突變率時發現在3株耐藥菌株中發現3′羧基末端出現單位點突變，分別為R474L、R474W和E433D，在1株敏感菌株也出現Q162R單位點突變，比較耐藥菌株和敏感菌株的rpsA基因突變率時發現兩者無統計學差異，認為可能與實驗菌株樣本量較小有關，rpsA的低突變率提示其可能不是PZA耐藥的常見機制。雖有相關文獻報道rpsA基因靠近C端438位點丙氨酸的缺失可影響POA與RpsA的結合[17]，但該基因中是否存在與PZA耐藥相關的特定突變位點及突變類型目前相關文獻報道很少。近年來也有研究認為rpsA基因突變可能與PZA耐藥無關[12,16]，關于rpsA基因與PZA耐藥的關系，還期待更多的研究。

3 panD基因

結核分枝桿菌panD基因全長420 bp，編碼天冬氨酸脫羧酶(139個氨基酸)，該酶與泛酸鹽和輔酶A合成所必需的β-丙氨酸合成有關，而泛酸鹽和輔酶A對維持MTB生存具有重要作用，研究認為POA可能通過抑制泛酸鹽和輔酶A合成來干擾細菌多方面的新陳代謝功能，如能量代謝及脂肪酸的生物合成等，從而發揮抗菌作用，但具體機制仍待進一步研究[18-19]。有研究通過對無pncA基因和rpsA基因變異的PZA耐藥菌株進行全基因組測序分析發現存在panD基因突變，此外，也有研究發現通過誘導MTB的panD基因過表達可提高細菌對POA抵抗性，并發現β-丙氨酸和泛酸鹽也具有拮抗POA的抗結核活性，這些發現都提示了panD基因突變可能與MTB對PZA耐藥有關[12,19-20]。近來有研究發現在panD基因非活性位點H21R、I49V的突變導致了MTB對PZA耐藥[21]，但目前panD基因突變與MTB對PZA耐藥的具體關系及其作用機制仍尚未確切闡明，還需進一步研究。

4 FASI基因與fadD2基因

脂肪酸代謝在MTB的生存中占有重要地位，有研究報道靶向抑制MTB脂肪酸代謝相關功能，有明顯改善PZA抗結核活性的潛力[22]。脂肪酸合成酶I(fattyacidsynthase, FAS)由脂肪酸合成酶I基因編碼，在細菌脂肪酸合成代謝中其重要作用，POA可能通過抑制FASI活性而擾亂細胞膜電位及干擾細胞能量代謝，從而發揮對MTB較弱的殺滅能力[23]。但有研究表明FASI的活性可被POA一系列的類似物，如5-氯-吡嗪酰胺等抑制，而不能直接被POA抑制，提示該酶可能不是POA直接的藥物靶標或者并不是其真正的靶標[24-25]。目前關于FASI基因突變與PZA耐藥性關系相關文獻報道較少，還待更深入的研究。

fadD2基因全長1 683 bp，為長鏈脂酰輔酶A連接酶D2(Long-Chain Fatty Acyl-CoA Ligase D2，FadD2 )的編碼基因，有研究報道FadD2與MTB對PZA或POA的固有耐藥有關，并發現在pH為中性的培養條件下，相對于對PZA高度耐藥的野生型MTB，FadD2喪失功能的MTB突變體卻對PZA敏感，提示可能與FadD2喪失功能后促進了MTB對PZA或POA敏感性升高有關。目前文獻報道FadD2在細菌輔酶A和脂質代謝起核心作用，但在PZA固有耐藥產生中的確切機制仍尚不清楚[22]。

盡管PZA耐藥與MTB基因突變密切相關，但在PZA耐藥的MTB臨床分離株中，尚有部分菌株并未發現上述基因的變異，對于這部分菌株可能存在其他基因變異或其他耐藥機制[18], 如藥物外排泵機制、PZA攝取障礙機制及其他原因引起的耐藥等。

5 展 望

目前對PZA作用機制及其耐藥機制研究已取得一定的進展，但仍缺乏全面深入的了解，還需不斷的探索和研究。大多數研究認為基因突變是MTB對PZA耐藥的主要分子機制，其中pncA基因突變引起PZA耐藥觀念已達成共識，但具體的作用及耐藥機制仍需更深入的研究；rpsA基因突變與PZA耐藥性的產生有關的觀點受到了質疑，待進一步研究證實；panD基因突變與耐PZA結核病有關，但其具體的關系及與PZA相互作用機制仍缺乏充分的實驗數據支撐，需更廣泛深入的研究；其他基因如FASI基因、fadD2基因及嘧啶合成相關的基因等相關研究較少，對其認識尚處于初步探索階段。此外，研究提示MTB對PZA耐藥還存在其他機制，如藥物外排泵機制、PZA攝取障礙機制、其他未知基因變異及尚未發現的耐藥機制等。目前耐藥結核病的出現及傳播已引起廣泛關注，相關研究也陸續開展，隨著科學技術的不斷進步及創新，相信吡嗪酰胺的作用及耐藥機制將會被闡明，同時也將會出現更安全、準確、快速、經濟、簡便的耐藥性檢測技術，為結核病及耐藥結核病的診斷提供更科學有力的支撐。

[1] Akhmetova A, Kozhamkulov U, Bismilda V, et al. Mutations in thepncA and rpsA genes among 77Mycobacteriumtuberculosisisolates in Kazakhstan[J].Int J Tuberc Lung Dis, 2015, 19(2):179-184.

[2] Syre H,Ovre?s, K, Grewal HMS. Determination of the susceptibility ofMycobacteriumtuberculosisto pyrazinamide in liquid and solid media assessed by a colorimetric nitrate reductase assay[J]. J Antimicrob Chemother, 2010, 65(4):704-712.

[3] Pholwat S, Stroup S, Gratz J, et al. Pyrazinamide susceptibility testing ofMycobacteriumtuberculosisby high resolution melt analysis[J]. Tuberculosis, 2014, 94(1):20-25.

[4] WHO.Global Tuberculosis Report 2016[M].Geneva:World Health Organization,2016,1-214.

[5] Whitfield MG, Soeters HM, Warren RM, et al. A global perspective on pyrazinamide resistance: systematic review and meta-analysis[J]. PLoS One, 2015, 10(7): e0133869.

[6] Alameemane AK, Xu P, Pierreaudigier C, et al. Pyrazinamide resistance inMycobacteriumtuberculosisarises after rifampicin and fluoroquinolone resistance[J]. Int J Tuberc Lung Dis, 2015, 19(6): 679-684.

[7] Chang KC, Yew WW, Zhang Y. Pyrazinamide susceptibility testing inMycobacteriumtuberculosis: a systematic review with meta-analyses[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2011, 55(10):4499-4505.

[8] Dudley MZ, Sheen P, Gilman RH, et al. Detecting mutations in theMycobacteriumtuberculosispyrazinamidase gene pncA to improve infection control and decrease drug resistance rates in human immunodeficiency virus coinfection[J]. Am J Trop Med Hyg, 2016, 95(6):1239-1246.

[9] Scorpio A, Zhang Y. Mutations in pncA, a gene encoding pyrazinamidase/nicotinamidase, cause resistance to the antituberculous drug pyrazinamide in tubercle bacillus[J]. Nat Med, 1996, 2(6):662-667.

[10] Petrella S, Gelusziental N, Maudry A, et al. Crystal structure of the pyrazinamidase ofMycobacteriumtuberculosis: insights into natural and acquired resistance to pyrazinamide[J]. PLoS One, 2011, 6(1):e15785.

[11] Li D, Hu Y, Werngren J, et al. Multicenter study of the emergence and genetic characteristics of pyrazinamide-resistant tuberculosis in China[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2016, 60(9):5159-5166.

[12] Gu Y, Yu X, Jiang G, et al. Pyrazinamide resistance among multidrug-resistant tuberculosis clinical isolates in a national referral center of China and its correlations with pncA, rpsA, and panD gene mutations[J]. Diagn Microbiol Infect Dis, 2015, 84(3):207-211.

[13] Miotto P, Cabibbe AM, Feuerriegel S, et al.Mycobacteriumtuberculosispyrazinamide resistance determinants: a multicenter study[J]. Mbio, 2014, 5(5):01819-14.

[14] Peng X, Jie W, Yang C, et al. Prevalence and transmission of pyrazinamide resistantMycobacteriumtuberculosis, in China[J]. Tuberculosis, 2016, 98:56-61.

[15] Lee KW, Lee JM, Jung KS. Characterization of pncA mutations of pyrazinamide-resistantMycobacteriumtuberculosisin Korea[J]. J Korean Med Sci, 2001, 16(5):537-543.

[16] Bhuju S, Fonseca LDS, Marsico AG, et al.Mycobacteriumtuberculosis, isolates from Rio de Janeiro reveal unusually low correlation between pyrazinamide resistance and mutations in the pncA gene[J]. Infect Genet Evol, 2013, 19(10):1-6.

[17] Shi W, Zhang X, Jiang X, et al. Pyrazinamide inhibits trans-translation inMycobacteriumtuberculosis[J]. Science, 2011, 333(6049):1630-1632.

[18] Zhang Y, Shi W, Zhang W, et al. Mechanisms of pyrazinamide action and resistance[J]. Microbiol Spectr, 2013, 2(4):1-12.

[19] Zhang S, Chen J, Shi W, et al. Mutations in panD encoding aspartate decarboxylase are associated with pyrazinamide resistance inMycobacteriumtuberculosis[J]. Emerg Microbes Infect, 2013, 2(6):e34.

[20] Shi W, Chen J, Jie F, et al. Aspartate decarboxylase (PanD) as a new target of pyrazinamide inMycobacteriumtuberculosis[J].Emerg Microbes Infect, 2014, 3(8):e58.

[21] Pandey B, Grover S, Tyagi C, et al. Molecular principles behind pyrazinamide resistance due to mutations inpanD gene inMycobacteriumtuberculosis[J]. Gene, 2016, 581(1):31-42.

[22] Rosen BC, Dillon NA, Peterson ND, et al. Long-chain fatty Acyl-CoA ligase FadD2 mediates intrinsicpyrazinamide resistance inMycobacteriumtuberculosis[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2016:AAC.02130-16.

[23] Ahmady A, Poolad T, Rafee P,et al. Study of pyrazinamidase structural changes in pyrazinamide resistant and susceptible isolates ofMycobacteriumtuberculosis[J]. Tuberk Toraks, 2013, 61(2):110-114.

[24] Boshoff HI1,Mizrahi V,Barry CE 3rd, et al. Effects of pyrazinamide on fatty acid synthesis by whole mycobacterial cells and purified fatty acid synthase I[J]. J Bacteriol, 2002, 184(8):2167-2172.

[25] Stoffels K, Mathys V, Fauvilledufaux M, et al. Systematic analysis of pyrazinamide-resistant spontaneousmutants and clinical isolates ofMycobacteriumtuberculosis[J].Antimicrob Agents Chemother, 2012, 56(10):5186-5193.

ResearchprogressofassociationbetweengenemutationandpyrazinamideresistanceinMycobacteriumtuberculosis

CAO Zhi-min, CHEN Ling

(DepartmentofRespiratoryMedicine,TheAffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege,Zunyi563003,China)

Pyrazinamide (PZA) is an important anti-tuberculosis drug especially for treating multidrug-resistant tuberculosis (MDR-TB). In recent years, the incidence ofMycobacteriumtuberculosis’ resistance to pyrazinamide has increased. At present, the mechanism of drug resistance has not been clearly elucidated. In this review, the association between gene mutation and pyrazinamide resistance inMycobacteriumtuberculosiswill be summarized.

Mycobacteriumtuberculosis; pyrazinamide; gene mutation; drug resistance mechanism

Chen Ling, Email: lingjuncd@163.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.10.015

國家自然科學基金(No.81360002)資助

陳 玲,Email：lingjuncd@163.com

遵義醫學院附屬醫院呼吸二科，遵義 563000

R378

A

1002-2694(2017)10-0923-04

Supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81360002)

2017-02-15編輯李友松