類風濕關節炎病證結合動物模型研究進展?

魏艷霞，李 鑫，林 也，王莘智，李如意，余黃合，邵 峰，鄺 濤，宋厚盼，蔡 雄△，黃惠勇△

(1. 湖南中醫藥大學，長沙 410208； 2.湖南中醫藥大學，長沙 410208)

【綜述】

類風濕關節炎病證結合動物模型研究進展?

魏艷霞1，李 鑫1，林 也1，王莘智2，李如意1，余黃合1，邵 峰1，鄺 濤2，宋厚盼1，蔡 雄1△，黃惠勇1△

(1. 湖南中醫藥大學，長沙 410208； 2.湖南中醫藥大學，長沙 410208)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種慢性自身免疫功能障礙疾病，其病因及發病機制尚不明確。長期臨床研究表明，中醫藥治療類風濕關節炎具有獨特優勢，加大對中醫藥的研究必須借助動物模型，由此構建具有中醫證候特征的動物模型是關鍵。病證結合動物模型結合現代醫學“病”和中醫“證”的優勢，是目前應用最廣泛的中醫動物模型。筆者擬對近年來RA病證結合動物模型進行綜述，并對其存在的問題進行思考，以期推動RA病證結合動物模型及其證候生物學機制的研究進展。

類風濕關節炎；病證結合；動物模型；研究進展

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis, RA)是以關節滑膜慢性炎癥反應、進行性關節骨質破壞和功能喪失為特征的自身免疫疾病[1]，其發病率和致殘率高，嚴重影響患者的生活質量[2]。根據臨床特征，屬于中醫“痹癥”范疇，與中醫古籍中所記載的“歷節病”“骨痹”“頑痹”等病證相似[3]。中醫藥治療講求審證求因、辨證論治，因其多靶點、多途徑的整合效應治療RA具有獨特優勢，越來越受到研究者們的廣泛關注。由于人體和疾病的復雜性和不可控性，臨床證候研究中存在諸多未知因素，要開展證候形成機制科學內涵研究，就必須構建具有中醫屬性的動物模型[4]。病證結合動物模型采用中醫學病因和現代醫學病因或病理復合因素造模，既能體現中醫辨證論治思想，又能模擬患者的臨床病理特征，是目前公認的證候動物模型構建方法[5]。

本文擬對近年來痹癥病證結合動物模型研究進行綜述，并對其存在的問題進行思考，以期為病證結合動物模型的構建及其證候生物學機制研究提供新思路。

1 痹癥病證結合動物模型研究現狀

1.1 風寒濕痹病證結合動物模型

金祝秋等[6]造模第1天于大鼠右后足趾皮內注射0.1 ml佐劑，將大鼠置于深2 cm、溫度5～7 ℃水中站立20 min，伴4級風力，每日1次，14 d后停止風寒濕刺激，連續觀察2周后處死大鼠，取右后足踝關節做病理切片。模型組大鼠關節腫脹與正常組比較有明顯差異，病理切片示模型組大鼠關節有大量中性粒細胞、淋巴細胞和巨噬細胞浸潤，正常組無變化。呂愛平[7]等將大鼠置于15 ℃左右水中游泳7 min，每日1次，連續7 d，第8天給予大鼠尾部、踝部多處皮下注射0.125 ml佐劑造模，結果示大鼠關節先后出現滑膜受損和軟骨損傷2個病理時期，有的甚至出現骨損傷、軟骨下骨細胞變性壞死。肖長虹等[8]設計2個實驗，實驗1有雌雄2種大鼠，實驗2僅有雄性大鼠。實驗1于實驗第1天大鼠尾根部、頸背部皮內多點注射II型膠原500 μg/只造模，7 d后注射200 μg/只加強免疫。造模第1天將大鼠放于造模箱，箱內環境設置為風速18 m/s，相對濕度100%，溫度7～10 ℃，每日1次，每次1 h，連續9 d，第10天后每隔1 d觀察大鼠關節，直至30 d實驗結束。第2個實驗在第1個實驗基礎上，于第7～9天于大鼠雙后肢踝關節涂抹30 μL葡萄菌腸毒素 B(SEB)，第10天后每隔1 d觀察關節炎癥，直至30 d實驗結束。實驗1表明，風寒濕+CIA不能加重雄性鼠足腫脹，反而減輕雌性鼠足腫脹，實驗2表明風寒濕+CIA+SEB能顯著加重雄性鼠足腫脹,由此認為可以將雄性大鼠風寒濕+CIA+SEB模型作為風寒濕痹病證結合動物模型。劉春芳[9]先將大鼠放在自制造模箱接受風寒濕刺激，刺激條件為風速6 m/s，相對濕度100%，溫度6 ℃，每日1次，每次6 h，持續15 d。第7天于大鼠尾根部皮內注射0.15 ml佐劑，第15天加強免疫，結果示風寒濕+CIA能明顯加重大鼠關節腫脹。胡玲等[10]將大鼠放在自制造模箱中，箱內環境設置為溫度(6±2) ℃，濕度80%～90%(超聲霧化器加冰塊控制)，風速6檔風力，每日1次，每次刺激12 h，連續20 d。第21天注射0.15 ml佐劑造模，結果表明風寒濕+CIA能明顯加重大鼠關節腫脹。鎮蘭芳[11]實驗第1天于大鼠背部多點注射0.05 ml CⅡ造模，2周后加強免疫，同時將大鼠放在氣候箱中接受風寒濕刺激，條件設為溫度(6±2) ℃，濕度(90±4)%，風力3級，每日1次，每次4 h，連續30 d，結果示風、寒、濕合并可以促進大鼠發病。高慧琴等[12]在實驗第1天將大鼠左后足跖部注射0.1 ml佐劑，且將大鼠放于5～7 ℃冷水中伴以3級風力，每日1次，每次20 min，連續14 d，結果示風寒濕+CIA能加重大鼠足趾部腫脹。

1.2 風濕熱痹病證結合動物模型

肖長虹等[8]將溫度設置為36～38 ℃，其他同上，直至30 d實驗結束。結果表明,風濕熱+CIA或風濕熱+CIA+SEB能加重雌性大鼠關節侵蝕程度，促使滑膜內炎癥細胞浸潤及血管增生，但能降低雄性大鼠的發病率，故認為風濕熱不宜作為雄性大鼠的造模方法。鎮蘭芳[11]將溫度設置為(33±2) ℃，其他同上，連續30 d，結果表明風、濕、熱合并可以促進大鼠發病，加重大鼠關節腫脹。高慧琴等[12]將溫度設置為36～38 ℃，且在37 ℃水浴恒溫熱蒸汽條件下熏蒸，其他條件同上。第14天實驗結束，結果示風濕熱+CIA能加重大鼠足趾部腫脹。

1.3 氣虛血瘀病證結合動物模型

李學榮等[13]先進行CIA造模，然后把大鼠置于14～16 ℃冷水中，每日1次，期間密切觀察大鼠精神狀態，大鼠自然下沉則撈出水面，置于自然通風環境中晾干。給予大鼠高脂飼料并分時段行饑餓療法，上午8∶00給予2/3 d飼料量，晚上8∶00給予1/3 d飼料量。以上2種方法持續4 周，大鼠出現精神萎靡、嗜睡、毛發枯黃且脫落等氣虛癥狀時行大鼠血液流變學檢測，結果示大鼠血黏度較空白組升高，血清 TNF-α、IL-1β 及 IL-6 含量均明顯升高。

1.4 瘀血痹阻病證結合動物模型

李征[14]將CCP多膚抗原與弗氏完全免疫佐劑混合后，注射于大白兔雙側后肢腘窩淋巴結進行結內注射，產生類似血瘀證的病理變化。結果示CCP佐劑組相對于單純佐劑組和正常組自身抗體含量明顯增加，且血漿中具有較高水平的FPA和D-二聚體，表明免疫功能紊亂是早期類風濕關節炎發病的主要致病因素，后期出現血瘀證表現。

1.5 痰瘀痹阻病證結合動物模型

唐先平[15]造模前1周給予大鼠精煉豬油灌食，于大鼠右后足趾部注射0.1 ml佐劑造模，造模后給予高脂飼料喂養，結果大鼠同時具備佐劑性關節炎和痰瘀痹阻證特點，表明造模成功。

1.6 腎虛痹病證結合動物模型

徐世杰等[16]先切除小鼠雙側卵巢模擬腎虛，注射0.1 ml佐劑造模，結果表明切除卵巢小鼠血中的雌二醇明顯下降，血清骨鈣素和腫瘤壞死因子的含量明顯升高，同時滑膜組織加重，軟骨損傷及骨的破壞更加嚴重，表明卵巢切除所致的腎虛能加重小鼠發病程度。艾錄景等[17]切除雌鼠卵巢，3 d后注射0.1 ml佐劑造模，雄鼠先免疫造模，第2天注射乙烯雌酚制成腎虛型痹癥模型，與正常組比較切除卵巢的雌鼠發病率增加，雄鼠注射乙烯雌酚能降低發病率。王燕等[18]先摘除大鼠雙側卵巢和睪丸，再注射羥基脲制成腎虛模型，28 d后注射0.2 ml佐劑造模，制成腎虛痹病證結合動物模型，結果表明去勢法、羥基脲+CIA能加重大鼠關節損傷和嚴重程度。呂愛平等[19]選用Wistar大鼠和DBA小鼠，Wistar大鼠由母代鼠避光飼養生殖選取，給予低鈣飲食復制腎虛動物模型，大小鼠分別注射1 mg、0.5 mg CⅡ免疫造模，結果示腎虛痹癥動物模型加重大鼠關節病變。壽旗揚等[20]切除大鼠雙側腎上腺制成腎陽虛動物模型，注射0.1 ml佐劑造模，結果示大鼠足容積較正常組明顯增大。

1.7 脾虛痹病證結合動物模型

徐士杰等[21]第1周開始給予小鼠大黃煎液灌胃和饑飽失常法復制脾虛模型，劑量為25 ml/kg，每日1次，1周結束，饑飽失常法持續2周。14 d后于小鼠雙側足底部注射50 μg CⅡ/足復制脾虛痹動物模型，結果示脾虛痹組小鼠的小腸PP結數量較空白組及CIA組明顯減少，表明脾氣虛是加重痹癥發病的機理之一。杜中平等[22]腹腔注射0.5 mg/kg利血平復制脾虛模型，每日1次，14 d后注射0.2 ml佐劑造模，結果示其兼具脾虛癥狀和痹癥臨床表現。肖誠等[23]第1周開始給予小鼠25 mg/kg大黃煎液灌胃和饑飽失常療法，每日1次，灌胃持續1周，饑飽失常療法至第9周建立脾虛證動物模型，第3周注射100 μgCⅡ造模。與單純痹癥組比較，脾虛痹證組大鼠關節腫脹、病理學改變明顯，炎癥因子含量明顯增加。

2 痹癥病證結合動物模型存在的不足及展望

病證結合動物模型是目前應用較廣泛的中醫藥動物模型，它結合了現代醫學“病”和中醫“證”的優勢，在單純疾病模型基礎上模擬風寒濕、風濕熱、腎虛等多種不同的證候，制成痹癥病證結合動物模型，具有較高的可信度和重復性[24]。該模型將宏觀與微觀、整體論與分析論相結合，在探討疾病生理病理的同時，可探討中醫證候的特征[25]，為中醫藥動物模型的研制提供了出路，較前有很大的進步，但其仍存在許多問題，主要有以下幾個方面。

2.1 造模方法不統一

動物品種有不同的選擇，國外制作 RA動物模型多選用 Lewis 大鼠，國內選用 Lewis、SD 或 Wistar 大鼠，選擇因人而異[26]。造模方式和造模劑量也各不相同，沒有統一標準。刺激條件不統一，溫度、濕度和風速沒有公認的標準，刺激時間和頻率各不相同，無法進行統一的比較[27]。刺激環境是人為設置，與自然界環境仍有一定差距，不能完全模擬自然界風寒濕因素，這也使得類風濕關節炎病證結合動物模型的可信度降低[17]。

2.2 評判標準不統一

目前多用的標準主要有免疫學檢查，如血清TNF檢測和血沉、病理切片觀察和大鼠足腫脹度測量、腫脹度評分和影像學檢查等，尚未形成統一的標準，無法確定動物模型是否復制成功[26]。

2.3 證候形成機制和屬性判定不明確

如脾虛痹病證結合動物模型，研究者從動物造模后出現體質量下降、嗜睡少動、毛發黃等一系列表現認為，大鼠屬于脾虛模型，卻往往忽略臨床利血平在精神神經系統、泌尿系統、呼吸系統等方面也有異常表現，這表明證型的確立具有一定主觀選擇性。事實上，綜合以上癥狀在臨床很難診斷為脾虛證，在動物身上則更難實現[28]。

2.4 無法復制證型的動態變化

“證”是指疾病發展某一階段病因、病理、病性的概括，它隨時間和空間的改變而改變[4]，臨床根據患者不同階段的四診信息可確定為相應的證型。而病證結合動物模型對象是動物，無法獲取四診資料，證型始終是固定的，直接導致動物模型的重復性和依從性受到廣泛的質疑，無法實現對臨床證型的全面復制，這表明病證結合動物模型要實現由實驗室到臨床的飛躍仍有很大的差距。

綜上，類風濕關節炎病證結合動物模型的研制已取得初步成果，較前有很大進步，但仍需廣大研究者們繼續探索。一個成功的病證結合動物模型必須達到如下要求：一是病因所造證候的主要形成病因，二是病因所致的病理表現是所研制證型的證候特征。以上要求都是基于人與動物生理病理一致的基礎上制定的。由于人和動物的種屬差異，人體的證候規律在動物機體上只能進行一定程度的模擬，不可能完全復制。由此，采用臨床標準作為實驗動物造模成功與否的條件缺乏可行性[29]。其次，類風濕關節炎病證結合動物模型是基于現代醫學的“病”和中醫的“證”，類似于“1+1”的模式[30]。然而目前我們所研制的病證結合動物模型只是病和證的簡單相加，效果類似于“1+1=1”甚至是“1+1<1”，對應于中西醫結合臨床所達到的成效是遠遠不夠的。因此，未來病證結合動物模型的研制要深入病證結合機制、演變規律的研究，真正做到病證同塑，更好地服務于臨床。

[1] 祁昌杰, 柴立民. 類風濕關節炎中醫藥治療研究進展[J]. 醫學綜述, 2015, 21(9): 1652-1653.

[2] 楊俊玲, 盧軍, 趙翡翠, 等. 類風濕關節炎實驗動物模型的研究進展[J].西北藥學雜志, 2015, 30(3): 329-330.

[3] 王燕. 腎虛痹癥(類風濕關節炎)病證結合動物模型制作方法研究[D]. 北京: 中國中醫科學院, 2010.

[4] 呂愛平. 病證結合動物模型研究: 從理論創新到技術挑戰[J]. 中國中西醫結合雜志, 2013, 33(1): 6-7.

[5] LING S, XU JW. Model organisms and traditional chinese medicine syndrome models[J]. Evid Based Complement Alternat Med, 2013: 761987.

[6] 金祝秋, 鄭建生, 彭芝配, 等. 大鼠風寒濕痹癥模型的建立與前列腺素EZ的關系[J].湖南中醫學院學報,1996,16(1):40-42.

[7] 呂愛平, 王安民, 曾曉蓮. 益腎蠲痹丸對大鼠實驗性痹癥影響的病理學研究[J]. 中藥方劑研究, 1988(6): 49-51.

[8] 肖長虹, 顧為望, 李留洋, 等. 類風濕關節炎風寒濕痹與風濕熱痹動物模型的研究[J]. 中醫雜志, 1996, 37(8): 492-496.

[9] 劉春芳. 抗類風濕關節炎滑膜血管新生的中藥藥效評價方法研究[D]. 北京：中國中醫科學院, 2012:5.

[10] HU L, LARS DH, SONG XG, et al. Effect of moxibustion onIL-1β and IL-2 in rat models of rheumatoid arthritis[J]. JAcupunct Tuina Sci, 2010, 8(3): 149-153.

[11] 鎮蘭芳. 外感風寒濕熱與痹癥相關性的理論和實驗研究[D]. 武漢：湖北中醫藥大學, 2014:5.

[12] 高慧琴, 吳國泰, 孫少伯, 等. 秦艽不同配伍對風濕痹癥模型大鼠血清炎癥因子水平的影響[J]. 中醫雜志, 2013, 54(9): 785-788.

[13] 李學榮, 李榮亨, 楊敏美. 復元膠囊治療氣虛血瘀證類風濕關節炎的機制[J]. 中國老年學雜志, 2013, 33(10): 2304-2306.

[14] 李征, 胡蔭奇. 早期類風濕關節炎血瘀與自身免疫功能紊亂的相互關系[J]. 中國中醫藥信息雜志, 2003, 10(6): 38-40.

[15] 唐先平. 類風濕關節炎痰瘀痹阻證的臨床及實驗研究[D]. 北京：中國中醫研究院, 2004.

[16] 徐世杰, 呂愛平, 王安民, 等. 卵巢切除所致腎虛對免疫性關節炎小鼠血清骨鈣素和腫瘤壞死因子的影響[J]. 中國中西醫結合雜志, 1999, 19(1): 34-36.

[17] 艾景錄, 呂愛平, 徐士杰, 等. 性腺功能異常型腎虛痹癥發生機理的實驗研究[J]. 中國中醫基礎醫學雜志, 1995, 1(1): 42-44.

[18] 王燕, 趙宏艷, 劉梅潔, 等. 類風濕關節炎腎虛證大鼠模型的建立[J].中西醫結合學報,2011,9(9):973-982.

[19] 呂愛平, 艾景錄, 徐世杰, 等. 實驗性低鈣腎虛痹癥的病理學研究[J]. 中國中西醫結合雜志, 1995(S1):183-185.

[20] 壽旗揚, 丁科, 周衛民, 等. 腎上腺切除腎陽虛大鼠佐劑性關節炎模型的建立[J]. 甘肅中醫學院學報, 2010, 27(4): 7-9.

[21] 徐士杰, 肖誠, 周桂琴, 等. 實驗性脾虛痹癥的黏膜免疫學機制研究[J]. 中國中醫基礎醫學雜志, 2003, 9(12): 35-38.

[22] 杜中平, 趙宏艷, 肖誠, 等. 類風濕關節炎脾虛證病證結合動物模型的建立[J]. 世界科學技術：中醫藥現代化, 2012, 14(2): 1384-1392.

[23] 肖誠, 李艷, 左錚云, 等. 芎附散對脾虛痹癥(類風濕關節炎)模型的影響[J]. 中醫雜志, 2007, 48(11): 1016-1019.

[24] 呂愛平, 吳萍, 鞠大宏, 等. 用膠原誘導性關節炎探討中藥治療類風濕關節炎的方法學研究[J]. 中國中藥雜志, 2004, 29(6): 505-507.

[25] 柴鐵玲. 類風濕關節炎動物模型在中醫藥研究中的進展和思考[J]. 環球中醫藥, 2011, 5(3): 215-217.

[26] 楊亞旭, 邵麗娟, 黃小麗, 等. 類風濕關節炎常用動物造模方法的研究進展及評價標準比較[J]. 風濕病與關節炎, 2015, 4(4): 62-66.

[27] 胡吳斌, 胡玲, 唐照亮, 等. 類風濕關節炎實驗動物模型研究與評述[J]. 中國中西醫結合雜志, 2011, 31(9): 1290-1294.

[28] 梁茂新, 范穎. 中醫證和病證結合動物模型研制的利弊與癥結[J]. 世界科學技術: 中醫藥現代化, 2013, 15(7): 1656-1664.

[29] 黃碧燕. 關于中醫病證結合動物模型研究現狀的思考[J]. 中國中醫藥信息雜志, 2010, 1(1): 4-5.

[30] 殷惠軍, 黃燁. 病證結合動物模型的研究進展[J]. 中國中西醫結合雜志, 2013, 1(1): 8-10.

ResearchProgressonAnimalModelwithRheumatoidArthritisofIntegratedDiseaseandSyndromeinTCM

WEI Yan-xia1, LI Xin1, LIN Ye1, WANG Shen-zhi2, LI Ru-yi1, YU Huang-he1, SHAO Feng1, KUANG Tao2, SONG Hou-pan1, CAI Xiong1△, HUANG Hui-yong1△

(1.HunanUniversityofChineseMedicine,Changsha410208,China; 2.TheFirstAffiliatedHospitalofHunanMedicalUniversity,Shangsha410208,China)

Rheumatoid arthritis is a chronic autoimmune disorder diseases, its etiology and pathogenesis are not clear. The long-term clinical research shows that traditional Chinese medicine has unique advantage about rheumatoid arthritis, to increase the research of Chinese medicine, we must use the animal model. The key is to establish an animal model with characteristics of TCM syndromes. The integrate of disease and syndrome animal model Combines the advantages of “disease“in modern medicine and “syndrome” of traditional Chinese medicine, its currently the most widely used animal models of TCM. The author intends to promote research progress of RA animal model with integrate of disease and syndrome in TCM and biological mechanism of syndrome.

Rheumatoid arthritis; Integrate of disease and syndrome in TCM; Animal model; Research progress

R593.22

A

1006-3250(2017)10-1485-04

國家自然科學基金資助項目(81373540)-基于PI3K-Akt-mTOR信號傳導通路探討青風藤配伍白芍治療類風濕關節炎“相使”為用的機理；湖南省高層次衛生人才“225”工程醫學學科骨干人才培養對象項目；湖南中醫藥大學中醫診斷國家重點學科開放基金項目(2014-08)-基于懸液芯片技術的RA寒濕痹阻證生物標志物及證候診斷模型研究；基于代謝組學的類風濕關節炎風寒濕痹證病證結合模型證候生物學基礎研究(2015ZYZD05)；類風濕關節炎活動期中醫證素及其與病理改變的關系研究(2015ZYZD15)；湖南中醫藥大學“科技創新團隊”資助項目(201503)-風濕免疫疾病中醫藥診治轉化醫學研究

魏艷霞(1991-)，女，湖南邵陽人，在讀碩士，從事風濕免疫系統疾病的中醫辨證與方證轉化醫學研究。

△通訊作者：蔡 雄，教授，博士研究生導師，從事風濕免疫系統疾病的中醫藥基礎與轉化醫學研究，E-mail: caixiong@hnctcm.edu.cn; 黃惠勇，教授，博士研究生導師，從事中醫辨證學與數字中醫藥的研究, E-mail: huanghy@hnctcm.edu.cn。

2017-02-17