臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)的研究進(jìn)展

馮可欣 詹昱 曲佳 巫進(jìn)明 陳玲珍 楊郁青 譚明珠 陳燕梅 譚雪芳 羅英

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)的研究進(jìn)展

馮可欣 詹昱 曲佳 巫進(jìn)明 陳玲珍 楊郁青 譚明珠 陳燕梅 譚雪芳 羅英

目的觀察臍帶中含有的間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離、純化及培養(yǎng), 并用流式細(xì)胞儀監(jiān)測臍帶表面抗原及細(xì)胞周期, 探討臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在組織工程及再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用的優(yōu)勢。方法取正常足月新生兒臍帶近胎兒端, 剔除動靜脈, 取其中的間質(zhì)成分, 雙酶法消化, 從而得到原代細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)和純化獲得貼壁細(xì)胞, 采用流式細(xì)胞儀檢測間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原表達(dá)情況。結(jié)果從臍帶培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞呈成纖維狀細(xì)胞形態(tài), 表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞相關(guān)抗原CD105、CD44、CD13、CD29, 但不表達(dá)造血細(xì)胞抗原CD34、CD45, 不表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞抗原CD31, 與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表型一致。結(jié)論臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞可在體外培養(yǎng)、擴(kuò)增, 具有和骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞相似的生物形態(tài)和抗原表型, 為細(xì)胞治療探索出的新的來源。

臍帶；間充質(zhì)干細(xì)胞；細(xì)胞培養(yǎng)；免疫表型；多向分化免疫調(diào)節(jié)

間充質(zhì)干細(xì)胞是一種起源于中胚層的成體干細(xì)胞, 其具有自我更新和多向分化能力, 近年來成為研究的熱點(diǎn)。既往間充質(zhì)干細(xì)胞主要來源于骨髓, 但隨著年齡的老化, 間充質(zhì)干細(xì)胞逐漸減少, 增殖分化能力大大減退, 取材對供者有所損傷, 限制了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用。尋找一種新的可替代來源成為迫切要解決的問題。目前, 人臍帶間充質(zhì)細(xì)胞已經(jīng)在癌癥［1］、心臟病、糖尿?。?］、神經(jīng)疾?。?］等動物實(shí)驗(yàn)中證實(shí)有良好的治療效果。從臍帶里提取出間充質(zhì)干細(xì)胞并進(jìn)行體外培養(yǎng)、擴(kuò)增、生物學(xué)鑒定, 為間充質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用提供新的來源。

1 材料與方法

1. 1材料來源 取健康足月新生兒臍帶組織, 在胎兒出生12～24 h內(nèi)進(jìn)行進(jìn)一步處理。

1. 2方法 采用無菌的PBS沖洗臍帶表面, 以清除多余的血液, 將臍帶剪至3～5 cm小段, 剖開臍帶, 去除臍帶中的血管、內(nèi)皮, 將臍帶組織剪碎成約1 mm2小塊, 經(jīng)配制的0.2%膠原酶Ⅰ(美國Sigma公司)消化過夜, 次日再予0.25%胰蛋白酶(美國Sigma公司)消化1 h, 經(jīng)離心洗滌收集細(xì)胞, 取樣做單個核細(xì)胞計數(shù), 按1×105/cm2密度將組織接種到新的有完全培養(yǎng)基(美國Stemcell公司)的75 cm2塑料培養(yǎng)瓶(美國Corning公司)中, 置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 4～5 d后全換液去除非貼壁細(xì)胞, 此后2～3 d半量換液1次, 至貼壁細(xì)胞融合至80%, 予0.25%胰酶消化, 收集懸浮細(xì)胞后按1∶4傳代。傳代至第三代后收集貼壁細(xì)胞, 應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行CD44、CD105、CD29、CD34、CD45(熒光標(biāo)記鼠抗人CD44-FITC、CD105-PE、CD34-PE、CD45-FITC)表面抗原檢測。

2 結(jié)果

2. 1臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài) 采用本方法獲得的原代細(xì)胞多于24 h內(nèi)貼壁, 倒置顯微鏡下可見貼壁細(xì)胞呈梭形, 部分聚集成簇, 7～14 d細(xì)胞達(dá)80%融合, 經(jīng)胰蛋白酶消化傳代后12～24 h內(nèi)貼壁, 觀察此時為呈較均一的平行排列或旋渦狀的長梭形細(xì)胞, 7～10 d細(xì)胞融合至80%～90%, 繼續(xù)傳代至第十代, 細(xì)胞形態(tài)無明顯改變。

2. 2臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫表型特征 流式細(xì)胞檢測結(jié)果表明, 貼壁細(xì)胞表達(dá)CD105、CD44、CD29, 但不表達(dá)造血細(xì)胞抗原CD34、CD45, 可從臍帶分離出來的貼壁細(xì)胞為間充質(zhì)干細(xì)胞。

3 討論

目前, 間充質(zhì)干細(xì)胞已成為近年來干細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域中重要的研究方向。隨著研究的深入, 發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞具有自我更新和多向分化能力, 同時產(chǎn)生的微環(huán)境對造血干細(xì)胞的歸巢和細(xì)胞增殖分化均具有重要意義。2000年, Rrices等［4］首次報道了臍帶血中可以分離培養(yǎng)出間充質(zhì)干細(xì)胞, 隨后Ro.nlanov等又分別從臍靜脈內(nèi)皮和內(nèi)皮下、臍帶Whartong膠質(zhì)和血管周圍組織中分離培養(yǎng)出了間充質(zhì)干細(xì)胞, 并建立了臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法。許多研究表明不同組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞同時又具有相似的免疫表型特征［5］, 表現(xiàn)為SH2(CD105)、SH3(CD73)、SH4、CD166、CD13、CD29、CD44等粘附分子陽性, 不表達(dá)造血和內(nèi)皮標(biāo)記, 如CD34、CD31和CD45等。表達(dá)HLA-I, 不表達(dá)HIA-DR, 不表達(dá)協(xié)同刺激分子CD80、CD86和CD40。

現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)可在胎兒血液、肝臟、骨髓、脂肪獲得間充質(zhì)干細(xì)胞且各種來源的細(xì)胞之間無明顯差異, 都具有向多種中胚層和神經(jīng)外胚層組織細(xì)胞分化的能力, 在一定條件下, 可被誘導(dǎo)分化成軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞［6,7］。其次, 間充質(zhì)干細(xì)胞獨(dú)特的細(xì)胞增殖分裂模式使外源基因易于導(dǎo)入和表達(dá), 因此, 間充質(zhì)干細(xì)胞是潛在的基因治療靶細(xì)胞。早期主要使用骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞, 但存在以下的缺點(diǎn)：細(xì)胞增殖能力隨供者年齡增加而減弱；骨髓采集對供者而言為有創(chuàng)性的操作, 難以進(jìn)行大規(guī)模的推廣。為此尋找新的可替代間充質(zhì)干細(xì)胞供源顯得十分迫切。采用本實(shí)驗(yàn)方法得到的間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)鑒定具有與骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞相似形態(tài)特點(diǎn)與免疫表型標(biāo)記。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的貼壁細(xì)胞呈長梭形, 較均一的平行排列或旋渦狀,均表達(dá)CD105、CD44、CD29, 但不表達(dá)造血細(xì)胞抗原CD34、CD45。相比于骨髓, 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞具有以下優(yōu)勢：臍帶的獲得更容易, 對供者無創(chuàng)傷；臍帶中間充質(zhì)干細(xì)胞免疫原性更低, 不表達(dá)與移植排斥相關(guān)的HLAⅡ類抗原, 也不表達(dá)由效應(yīng)T細(xì)胞誘導(dǎo)的共刺激分子, 混合淋巴細(xì)胞檢測中呈免疫抑制, 異體移植該細(xì)胞不會發(fā)生免疫排斥反應(yīng)［8-10］, 受者排斥可能性??；人臍帶中分離出的間充質(zhì)干細(xì)胞在細(xì)胞含量、增殖能力上均優(yōu)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞, 可在體外大量擴(kuò)增［11,12］；④在胎盤屏障保護(hù)下, 臍帶病毒或細(xì)菌感染機(jī)會更小；⑤不牽涉?zhèn)惱淼赖碌葐栴}。在組織工程及再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域, 問充質(zhì)干細(xì)胞作為種子細(xì)胞可應(yīng)用于修復(fù)替代受傷或病變的多種組織器官, 從而為目前一些無法有效治愈的重大疾病如脊髓受傷、多發(fā)性硬化(MS)、老年性癡呆、帕金森氏癥等提供了嶄新的治療方案。此外, 間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)、免疫抑制功能尤其值得關(guān)注。

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10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2017.13.114

2017-04-11］

510620 廣東省廣州市第十二人民醫(yī)院血液內(nèi)科