益氣除痰方對肺癌移植鼠內質網分子伴侶蛋白GRP94表達的影響

魏玉林 王淑美 劉啟歐

摘要：目的 觀察益氣除痰方對脾虛Lewis肺癌移植鼠內質網分子伴侶蛋白GRP94表達的影響，探討其抗癌的可能作用機制。方法 采用苦寒瀉下加饑飽失常方式建立脾虛小鼠模型，再將無血清培養基制備的癌細胞懸液接種至脾虛C57BL/6小鼠背側，制作脾虛Lewis肺癌小鼠模型。將48只成模小鼠隨機分為模型組、化療組、聯合用藥組及益氣除痰方低、中、高劑量組，每組8只。各給藥組給予相應藥物干預。給藥14 d后處死小鼠，檢測腫瘤體積和質量；HE染色觀察各組移植瘤組織形態，免疫組化、Western blot和RT-PCR檢測腫瘤組織GRP94蛋白和基因表達。結果 與模型組比較，化療組、聯合用藥組及益氣除痰方中、高劑量組腫瘤體積、腫瘤質量明顯降低（P<0.05，P<0.01），腫瘤細胞大量壞死，GRP94蛋白表達明顯降低（P<0.01）；與化療組比較，聯合用藥組GRP94蛋白表達明顯降低（P<0.01）。結論 益氣除痰方聯合化療可有效治療Lewis肺癌小鼠，其機制可能與其下調內質網分子伴侶蛋白GRP94表達、逆轉腫瘤細胞自身保護機制相關。

關鍵詞：益氣除痰方；肺癌；脾虛證；GRP94；小鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.12.015

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）12-0059-05

Effects of Yiqi Chutan Formula on GRP94 of Endoplasmic Reticulum Molecular Chaperone in Mice with Lung Cancer WEI Yu-lin， WANG Shu-mei， LIU Qi-ou （Chongqing Medical University， Chongqing 400016， China）

Abstract：Objective To investigate the effects of Yiqi Chutan Formula on expression of GRP94 of endoplasmic reticulum molecular chaperone in mice with lung cancer. Methods The binding methods of diarrhea of bitter and cold and abnormal of starvaion were used to establish spleen-deficiency mice models. Cancer cell suspension prepared by serum-free medium was inoculated to the back of C57BL/6 mice to establish spleen-deficiency Lewis lung cancer models. 48 successfully modeling spleen-deficiency Lewis lung cancer mice were randomly divided into model group， chemotherapy group， Yiqi Chutan Formula low-， medium-， and high-dose groups， and combined medication group， with 8 mice in each group. Each medication group was intervened with relevant medicine. The mice were killed after 14 days of medication. The size and weight of tumor in mice were measured； morphological changes of transplanted tumor were observed by HE staining method； the protein and gene expressions of GRP94 in tumor tissues were tested by immunohistochemistry， Western blot and real-time fluorescence quantitative PCR. Results Compared with model group， the tumor volume and weight of chemotherapy group， Yiqi Chutan Formula medium- and high-dose groups， and combined medication group decreased significantly （P<0.05， P<0.01）； large necrosis of tumor cells occurred in transplanted tumor； protein expression of GRP94 decreased significantly （P<0.01）. Compared with chemotherapy group， protein expression of GRP94 in the combined medication group was significantly lower （P<0.01）. Conclusion Yiqi Chutan Formula combined with chemotherapy can be effective in the treatment of Lewis lung cancer mice. The mechanism may be related to the down-regulation of the expression of GRP94 of endoplasmic reticulum molecular chaperone， and reversion of the mechanism of self-protection of tumor cells.

Key words： Yiqi Chutan Formula； lung cancer； spleen-deficiency syndrome； GRP94； mice

基金項目：重慶市科委課題（cstc2013jcyjA10092）

通訊作者：王淑美，E-mail：Winna968@sina.com

肺癌屬中醫學“肺積”“息賁”“肺癰”等范疇，中醫病機特點為本虛標實。中醫理論認為，肺癌的發病多因正氣先虛，邪毒乘虛而入，致肺氣膹郁，肅降無權，加之脾虛運化失司，痰濁內生而成，故肺癌的治療首選益氣除痰。益氣除痰方是由黨參、白術、茯苓、生半夏、山慈菇、蟾酥等中藥組成。方中黨參、生半夏宣肺健脾，白術、茯苓健脾化痰，山慈菇軟堅散結、化痰解毒，蟾酥解毒止痛、開竅醒神，全方標本兼治，共奏健脾除痰、解毒散結之功，對于證屬脾虛痰濕之肺癌患者療效顯著。本研究在前期研究基礎上[1]，觀察益氣除痰方對脾虛肺癌小鼠移植瘤組織內質網分子伴侶蛋白GRP94表達的影響，探討其抗癌的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞和動物

Lewis肺癌細胞株，華西醫科大學腫瘤中心。SPF級C57BL/6小鼠54只（6只用于傳代），雌雄各半，體質量18～22 g，鼠齡6～8周，重慶醫科大學實驗動物中心，合格證號SCXK（渝）2012-0001。飼養于重慶醫科大學實驗動物中心，溫度（23±2）℃、濕度（55±10）%，光照12 h，噪音<60 dB，自由攝食飲水，分籠喂養。

1.2 藥物

益氣除痰方，廣州中醫藥大學第一附屬醫院中藥房；番瀉葉，重慶醫科大學附二院中藥房，經重慶醫科大學中醫藥學院林於教授鑒定均為正品。益氣除痰方和番瀉葉均按照中藥常規煎法煎成相當于含原藥材2 g/mL的藥液，4 ℃冰箱保存。順鉑注射液，齊魯制藥（海南）有限公司，批號2A1A1401002A。

1.3 主要試劑與儀器

胎牛血清、改良型RPMI-1640培養基（賽默飛世爾生物化學制品北京有限公司），GRP94一抗為兔來源的多克隆抗體（北京博奧森生物技術有限公司），DAB顯色試劑盒、兔SP檢測試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司），發光試劑（MILLIPORE 公司），Rever Tra Ace-α-反轉錄試劑盒、2×SYBR Green（TOYOBO公司）。光學顯微鏡（日本 Olympus公司），電泳儀、FX9600熒光定量PCR儀、紫外分光光度計（美國Bio-Rad公司），核酸蛋白分析儀（美國Beckman），低溫離心機（Sigma公司）。

1.4 造模

1.4.1 脾虛小鼠模型制作 正常C57BL/6小鼠48只，采用苦寒瀉下加饑飽失常方式建立脾虛模型，具體方法參照文獻[2]：予C57BL/6小鼠100%番瀉葉水煎液灌胃，劑量為15 mg/g（即0.15 mL/10 g），隔日禁食，至小鼠出現食欲不振、消瘦、便溏、倦怠乏力等脾虛癥狀（一般10 d）為造模成功。

1.4.2 Lewis肺癌小鼠模型制作 收集體外培養對數生長期的Lewis肺癌細胞，制成癌細胞懸液，調節細胞數為1×107/mL，將癌細胞懸液接種至6只C57BL/6小鼠背部皮下以供傳代，0.2 mL/只。14 d后處死小鼠，剝取腫瘤組織，以無血清培養基制備癌細胞懸液，調節濃度為1×107/mL，接種至脾虛C57BL/6小鼠背部皮下，0.2 mL/只。

1.4.3 分組及給藥 根據預實驗，接種第6日小鼠皮下腫瘤可明顯捫及，中藥劑量為4 g/kg時抑瘤作用最佳。故接種第6日，將小鼠隨機分為模型組（生理鹽水）、化療組（生理鹽水+順鉑注射液1 mg/kg）、聯合用藥組（4 g/kg益氣除痰方藥液+順鉑注射液1 mg/kg）和中藥低、中、高劑量組（2、4、8 g/kg益氣除痰方藥液），每組10只。灌胃給藥體積為0.2 mL/只，每日1次，連續14 d；順鉑注射液腹腔注射0.2 mL/只，每日1次，連續5 d。

1.5 觀察指標

1.5.1 腫瘤體積和質量測定 第21日脫頸處死小鼠，測量荷瘤小鼠腫瘤最長徑（a）和最短徑（b），計算腫瘤體積（V=0.5ab2，單位：cm3）。取腫瘤稱重，計算抑瘤率。抑瘤率（%）=（模型組平均瘤質量-治療組平均瘤質量）÷模型組平均瘤質量×100%。

1.5.2 瘤組織形態學觀察 取腫瘤組織，肉眼觀察其生長情況，4%多聚甲醛固定，常規石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察腫瘤組織形態學變化。

1.5.3 免疫組化檢測GRP94蛋白表達 取腫瘤組織置于4%多聚甲醛固定，常規石蠟包埋、切片、二甲苯脫蠟、水化、抗原修復等，滴加抗GRP94抗體（1∶100）4 ℃孵育過夜，次日37 ℃復溫40 min，PBS沖洗3 min×3，滴加生物素化二抗工作液，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3 min×3，滴加標記親和素，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3 min×3，DAB顯色，蘇木素復染，碳酸鋰返藍，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，鏡檢并攝片。應用Image-ProPlus6.0軟件分析圖片，選取圖片上具有染料色調的區域（Area），測量該區域的積分光密度（IOD）值，選擇并測量有效統計區域的面積，計算選擇區域內的光密度平均值（IOD/Area）。

1.5.4 Western blot檢測GRP94蛋白表達 將腫瘤組織加入組織裂解液，超聲勻漿，4 ℃、12 000 r/min 離心20 min，取上清液，BCA法測定蛋白水平。取樣品50 μg進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），轉入硝酸纖維素膜（PVDF），封閉，兔抗GRP94抗體以1∶1000比例稀釋雜交過夜，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗（1∶1000稀釋）37 ℃反應1 h，采用化學發光法進行顯色，計算機灰度掃描處理。GAPDH作為內參校正上樣量。

1.5.5 RT-PCR檢測GRP94基因表達 RNA提取后再用紫外分光光度計及瓊脂糖凝膠電泳的方法進行RNA濃度測定。然后進行cDNA制備，加RNA 1 μg，5×RT Buffer 4 μL，RNA Ace 0.5 μL，RNase Inhibitor 0.5 μL，dNTPs 2 μL，Oligo（dT）1 μL，補1‰DEPC水至20 μL。反應條件：42 ℃，10 min；30 ℃，20 min；99 ℃，5 min；4 ℃，5 min。依據GenBank上所查mRNA序列，采用Gene tool軟件設計引物，內參GAPDH上游5'-ACCCCGTGCTGCTGACCGAG-3'，下游5'-TCCCGGCCAGCCAGGTCCA-3'；GRP94上游5'-GCGGCGGATTAAGGAAGATG-3'，GRP94下游5'-CTTCTGCGTCTTCTGAGGTGTCT-3'，擴增產物長度152 bp。再加cDNA 2 μL，GRP94上游引物0.5 μL，GRP94下游引物0.5 μL，2×SYBR Green10 μL，H2O 7 μL，共20 μL。反應條件：94 ℃、5 min→（94 ℃、30 s→57 ℃、30 s→72 ℃、30 s）×40→72 ℃、10 min。反應結束后，用ABI StepOne Plus PCR System軟件分析，計算目的基因Ct值。ΔΔCt=（Ct處理組目的基因-Ct處理組內參基因）-（Ct對照組目的基因-Ct對照組內參基因）。變化倍率以2-ΔΔCt值表示。

1.6 統計學方法

采用SPSS17.0統計軟件進行分析。計量資料以—x±s表示，組間比較采用方差分析。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 益氣除痰方對模型小鼠腫瘤體積和質量的影響

與模型組比較，化療組、聯合用藥組和中藥中、高劑量組均能一定程度降低腫瘤體積和腫瘤質量，其中聯合用藥組效果最為明顯，差異有統計學意義（P<0.05，P<0.01）；與化療組比較，聯合用藥組腫瘤體積和腫瘤質量明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05）。各組抑瘤率比較，聯合用藥組抑瘤率最高，達55.91%，其次是化療組和中藥中劑量組，抑瘤率分別為42.56%、33.70%；中藥低劑量組抑瘤率最低，僅9.46%。結果見表1。

2.2 益氣除痰方對模型小鼠移植瘤組織形態的影響

肉眼觀察各組小鼠移植瘤呈結節狀生長，表面欠光滑，質地較韌，與周圍組織粘連，推之不動；外觀呈淡粉色魚肉狀，表面有血管分布，部分瘤體中央區有變性、壞死、出血，以聯合用藥組最為明顯。光鏡觀察模型組腫瘤細胞排列密集，呈片狀分布且生長旺盛，細胞結構畸形，核質比例失常，核固縮較少，無壞死或點狀壞死，瘤組織內微血管豐富；化療組核固縮、核碎裂較模型組多，可見片狀壞死灶，瘤組織及其周圍微血管較為豐富；中藥中、高劑量組及聯合用藥組瘤組織散在分布，核固縮、核碎裂多見，細胞大片壞死，瘤組織微血管較模型組、化療組減少。

2.3 免疫組化檢測益氣除痰方對模型小鼠移植瘤組織內質網分子伴侶蛋白GRP94蛋白表達的影響

與模型組比較，化療組、聯合用藥組和中藥中、高劑量組GRP94光密度平均值明顯降低，差異有統計學意義（P<0.01）；與化療組比較，聯合用藥組GRP94光密度值顯著降低，差異有統計學意義（P<0.01），見表2。GRP94主要表達于細胞漿或細胞膜，陽性染色呈黃色或棕黃色細顆粒狀，見圖1。

2.4 Western blot檢測益氣除痰方對模型小鼠移植瘤組織內質網分子伴侶蛋白GRP94蛋白表達的影響

與模型組比較，化療組、聯合用藥組和中藥中、高劑量組GRP94蛋白表達明顯降低，差異有統計學意義（P<0.01）；與化療組比較，聯合用藥組GRP94蛋白表達明顯低于化療組，差異有統計學意義（P<0.01）。結果見表3、圖2。

D.中藥中劑量組；E.中藥高劑量組；F.聯合用藥組

圖2 各組小鼠移植瘤組織GRP94蛋白表達免疫印跡電泳圖

2.5 RT-qPCR檢測益氣除痰方對模型小鼠移植瘤組織內質網分子伴侶蛋白GRP94基因表達的影響

與免疫組化、Western blot檢測結果一致，化療組、聯合用藥組及中藥中、高劑量組GRP94基因表達較模型組明顯降低（P<0.01）；聯合用藥組GRP94基因表達較化療組明顯降低（P<0.01）。結果見表4。

3 討論

細胞內質網的主要功能是完成蛋白質合成、折疊、轉運和Ca2+存儲，這些功能的完成得益于內質網腔內的許多分子伴侶蛋白。因藥物、缺氧、內環境失衡等導致內質網功能紊亂，錯誤折疊蛋白或非折疊蛋白在內質網腔內聚積，進而對細胞產生毒性，稱為內質網應激[3]。該應激不利于細胞的生存，但細胞又具有特異性的針對內質網應激的保護性反應，以確保在不利條件下內質網的蛋白質折疊等功能不被損害，這條特有的保護性反應途徑稱為未折疊蛋白反應（unfolded protein response，UPR）。在內質網應激的不利條件下，通過UPR機制確保細胞得以繼續生存或凋亡，如果內質網的穩態環境遭到嚴重破壞，機體可通過內質網應激信號通路誘導細胞凋亡[4-5]。

GRP94又稱內質網蛋白99，是內質網中數目最多的葡萄糖調節蛋白，主要貯存于內質網中，參與內質網應激反應，是內質網應激反應中的重要因子。在正常細胞環境下，GRP94可與Ca2+結合具有伴侶蛋白特征，協助新合成多肽的轉位、折疊以及寡聚體的組裝、分解，抑制錯誤折疊蛋白的分泌；此外，GRP94還具有抗原呈遞作用，可作為腫瘤細胞的伴侶蛋白參與腫瘤細胞的新陳代謝，保護腫瘤細胞免受有害因素的侵害[6]。有關實驗顯示，GRP94在肺癌、乳腺癌、肝癌、多發性骨髓瘤等腫瘤中均有較高表達，正常細胞演變成腫瘤細胞與GRP94的高表達密切相關，降低GRP94的表達水平可抑制腫瘤細胞生長[7-10]。另有關研究顯示，長春新堿、阿霉素、喜樹堿等抗腫瘤化療藥物可以在預先誘導GRP94表達的腫瘤細胞系中丟失藥效，產生耐藥性；降低GRP94的表達可增強化療藥物對腫瘤細胞的敏感性促進腫瘤細胞凋亡[11]。因此，抑制GRP94的表達，有望成為治療腫瘤的一種新策略。

本實驗結果顯示，益氣除痰方中劑量組、益氣除痰方高劑量組、化療組及聯合用藥組均能明顯抑制小鼠移植瘤生長，促進腫瘤細胞壞死；內質網分子伴侶蛋白GRP94在移植瘤組織中呈現高表達，經益氣除痰方治療后，GRP94蛋白表達明顯降低，益氣除痰方中劑量組降低最明顯，且益氣除痰方與順鉑聯合使用可明顯增強對GRP94的抑制作用。提示益氣除痰方可能通過下調GRP94的表達，逆轉腫瘤細胞自身保護機制（UPR機制），從而誘導腫瘤細胞凋亡，且益氣除痰方與順鉑聯合使用可明顯增強抑瘤作用。本研究顯示，雖然益氣除痰方和化療作用后各組小鼠腫瘤組織GRP94表達均有所降低，但仍呈現較高表達，考慮其可能原因為：在腫瘤引發內質網應激反應的基礎上，化療、脾虛模型的建立亦引發了內質網應激從而啟動了UPR機制，致使GRP94過表達，而另一方面益氣除痰方、順鉑又具有下調GRP94表達的作用，但兩兩相互抵消，故而出現以上結果。在今后的實驗中考慮建立單純肺癌模型，以同樣的分組及條件重復實驗，以檢驗該推測是否合理。

參考文獻：

[1] 林麗珠，王淑美，周京旭.益氣除痰方對脾虛LEWIS肺癌小鼠生存期及 PRDX-1，PRDX-6表達的影響[J].中國中西醫結合雜志，2011，31（1）：99- 103.

[2] 吳秀，周聯，羅霞，等.四君子湯多糖對脾虛小鼠腸道菌群及免疫功能的影響[J].中藥藥理與臨床，2014，30（2）：12-14.

[3] LAI E， TEODORO T， VOLCHUK A. Endoplasmic reticulum stress：signaling the unfolded protein response[J]. Physiology，2007， 22（3）：193-201.

[4] TANG J， GUO Y S， ZHANG Y， et al. CD147 induces UPR to inhibit apoptosis and chemosensitivity by increasing the transcription of Bip in hepatocellular carcinoma[J]. Cell Death Differ，2012， 19（11）：1779-1790.

[5] TRUSINA A， PAPA F R， TANG C. Rationalizing translation attenuation in the network architecture of the unfolded protein response[J]. PNAS，2008，105（51）：20280-20285.

[6] STRBO N， PODACK E R. Secreted heat shock protein Sp96-Ig：aninnovative vaccine approach[J]. Am J Reprod Immunol，2008，59（5）：407-416.

[7] 王慧賢，劉彥仿，楊守京，等.熱休克蛋白70、葡萄糖調節蛋白94和IgG在人肺癌組織中的表達[J].細胞與分子免疫學雜志，2008，24（5）：447- 449.

[8] RACHIDI S， SUN S， WU B X， et al. Endoplasmic reticulum heat shock protein gp96 maintains liver homeostasis and promotes hepatocellular carcinogenesis[J]. J Hepatol，2015，62（4）：879-888.

[9] HUA Y， WHITE-GILBERTSON S， KELLNER J， et al. Molecular chaperone gp96 is a novel therapeutic target of multiple myeloma[J]. Clin Cancer Res，2013，19（22）：6242-6251.

[10] 王新，范立君，李壯，等.GRP78、GRP94在乳腺癌中的表達及其意義[J].黑龍江醫藥科學，2014，37（6）：89-91.

[11] OQISO Y， TOMIDA A， LEI S， et al. Proteasome inhibition circumvents solid tumor resistance to topoisomerase II-directed drugs[J]. Cancer Res，2000，60（9）：2429-2434.

（收稿日期：2016-02-25）

（修回日期：2016-03-17；編輯：華強）