Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面分析法優(yōu)化“黑金剛”馬鈴薯紫紅色素的提取工藝條件

劉細(xì)霞,盧思帆,侯建軍,李運(yùn)濤

(湖北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院食用野生植物保育與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北黃石 435002)

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Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面分析法優(yōu)化“黑金剛”馬鈴薯紫紅色素的提取工藝條件

劉細(xì)霞,盧思帆,侯建軍*,李運(yùn)濤

(湖北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院食用野生植物保育與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北黃石 435002)

為了研究“黑金剛”馬鈴薯紫紅色素的最優(yōu)提取工藝條件，本研究以紫紅色素的得率為指標(biāo),在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,應(yīng)用Plackett-Burman(PB)和最陡爬坡實(shí)驗(yàn)確定影響得率的主要參數(shù)和最優(yōu)參數(shù)組合。再以其為依據(jù),應(yīng)用響應(yīng)面分析法(response surface method,RSM)對(duì)影響得率的主要條件(酸濃度、提取時(shí)間、提取次數(shù))進(jìn)行再優(yōu)化。結(jié)果表明,最優(yōu)提取條件為酸濃度0.31 mol/L、料液比1∶60(g/mL)、提取溫度70 ℃、提取時(shí)間87 min、提取次數(shù)3次。在此條件下,紫紅色素的得率為3.43 mg/g。

黑金剛馬鈴薯,紫紅色素,Plackett-Burman實(shí)驗(yàn),響應(yīng)面分析法

合成色素的安全性不斷遭到質(zhì)疑,使其應(yīng)用受到一定限制[1]。而天然色素因具有安全可靠及功能性等優(yōu)點(diǎn),在食品工業(yè)的應(yīng)用越來越受到關(guān)注[2]。然而,天然食用色素的研究與開發(fā)面臨的瓶頸問題之一是缺乏具有利用價(jià)值的大量天然色素資源,這便導(dǎo)致了天然食用色素價(jià)格偏貴,在很大程度上也限制其在應(yīng)用上的普及[3]。因此,尋找用于開發(fā)天然色素的資源是一個(gè)亟待解決的問題。

“黑金剛”馬鈴薯皮肉皆為黑紫色,其呈黑紫色的原因是富含Delphindin(紫色)花青素,它有抗癌、抗衰老、抗肥胖等多種保健作用[3,4]。目前,國內(nèi)外對(duì)“黑金剛”馬鈴薯色素的研究主要集中在花青素提取工藝開發(fā)[5]。響應(yīng)面法(Response surface method,RSM)是基于多元二次回歸方程來擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系,建立的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),已廣泛應(yīng)用在天然有效成分提取工藝優(yōu)化領(lǐng)域[6-7]。楊智勇[5]等采用響應(yīng)面法優(yōu)化“黑金剛”馬鈴薯花青苷提取工藝,提取劑為15%的鹽酸乙醇。但高濃度的鹽酸易腐蝕管道,其工藝條件并不能滿足未來工業(yè)化生產(chǎn)的需求。同時(shí),在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上直接進(jìn)行RSM分析,常常會(huì)因?yàn)橐蛩睾退蕉?在RSM分析時(shí)易使模型設(shè)計(jì)失敗,找不到最優(yōu)工藝參數(shù)點(diǎn)。因此,本研究在先進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,將Plackett-Burman(PB)實(shí)驗(yàn)、最陡爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)應(yīng)用于“黑金剛”馬鈴薯色素提取工藝的優(yōu)化研究。本研究的完成,不僅減少需要分析的因素個(gè)數(shù),而且減少了實(shí)驗(yàn)工作量,為未來將該方法用于工業(yè)化放大生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

“黑金剛”馬鈴薯 購自長沙地泰農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司;莧菜紅分析標(biāo)準(zhǔn)品 購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;檸檬酸、濃鹽酸、甲醇和乙醇 均為分析純,購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

TU-1901型紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市精達(dá)儀器制造廠;5430R型冷凍離心機(jī) 德國艾本德公司;BSA124S型分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;高速萬能粉碎機(jī) 永康市帥通電器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 “黑金剛”馬鈴薯紫紅色素提取工藝流程 “黑金剛”馬鈴薯→清洗、切片、干燥、粉碎、過60目篩→馬鈴薯粉→提取→離心→紫紅色素粗提取液。

1.2.2 紫紅色素含量的測定 參考田麗君[8]方法,稍做修改。配制系列濃度(4、8、12、16、20 μg/mL)的莧菜紅標(biāo)準(zhǔn)品,在波長520 nm處測定其吸光度值。以最大吸收波長處的吸光度值為橫坐標(biāo),莧菜紅標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(Y=36.887X+0.19614,R2=0.99964)。

準(zhǔn)確移取適量紫紅色素粗提取液,并用對(duì)應(yīng)濃度的溶劑稀釋至適當(dāng)濃度。然后用紫外分光光度計(jì)在最大吸收波長處測定吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到相應(yīng)紫紅色素的濃度。按照公式計(jì)算得率:得率=濃度×稀釋倍數(shù)×粗提液體積/干粉質(zhì)量

1.2.3 提取劑的選擇和最大波長的確定 準(zhǔn)確稱取1 g“黑金剛”馬鈴薯粉于離心管中,依次加入20 mL不同的提取溶劑(蒸餾水、無水乙醇、0.2 mol/L稀鹽酸、檸檬酸、無水甲醇、甲醇-0.5%甲酸和50%乙醇),混勻。然后置于恒溫水浴鍋中,30 ℃水浴加熱1 h后,在10 ℃、4000 r/min的條件下離心15 min。取上清液進(jìn)行全波長掃描,通過提取液的顏色和最大波長對(duì)應(yīng)的吸光度值,從而確定最佳提取溶劑和最大吸收波長。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取1 g“黑金剛”馬鈴薯粉于離心管中,依次加入20 mL不同濃度的稀鹽酸(0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mol/L),混勻。置于恒溫水浴鍋中,30 ℃水浴加熱1 h后,在10 ℃、4000 r/min的條件下離心15 min。提取1次，取上清液,在波長520 nm處測定吸光度值,從而計(jì)算得率,每個(gè)實(shí)驗(yàn)做三個(gè)平行。

再對(duì)其余四個(gè)單因素進(jìn)行優(yōu)化,每優(yōu)化一個(gè)單因素,其余三個(gè)因素不變按照上述步驟中的參數(shù)。選擇到一個(gè)最優(yōu)參數(shù)后,在下一個(gè)單因素優(yōu)化時(shí),按照篩選的最優(yōu)參數(shù),改變下一個(gè)因素,其余因素不變。四個(gè)單因素包括料液比(W/V)(1∶10、1∶20、1∶40、1∶60、1∶80)、提取時(shí)間(0.5、1.0、1.5、2.0 h)、提取溫度(30、40、50、60、70、80 ℃)、提取次數(shù)(1、2、3次)。

1.2.5 PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 以“黑金剛”馬鈴薯紫紅色素單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果為依據(jù),選用實(shí)驗(yàn)次數(shù)N=12的PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)[9],對(duì)酸濃度、料液比、提取時(shí)間、提取溫度、提取次數(shù)五個(gè)因素進(jìn)行考察,每個(gè)因素分別取兩個(gè)水平,以紫紅色素的得率為響應(yīng)值。PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及相應(yīng)值見表1。

表1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平和編碼

1.2.6 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 參考溫?fù)碥奫10]的方法設(shè)計(jì)最陡爬坡實(shí)驗(yàn)。先根據(jù)PB實(shí)驗(yàn)結(jié)果篩選對(duì)紫紅色素得率影響顯著的因素,再根據(jù)顯著因素的正負(fù)效應(yīng)設(shè)定步長及變化方向,快速逼近最佳區(qū)域,其它因素的取值根據(jù)各因素效應(yīng)的正負(fù)和大小確定,正效應(yīng)的因素取較高值,負(fù)效應(yīng)的因素取較低值。

1.2.7 RSM實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,固定提取溫度為70 ℃,料液比為1∶60。參考Jing C L[11]進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。根據(jù)Box-Behnken的中心組合原理選取酸濃度(A)、提取時(shí)間(B)、提取次數(shù)(C)共3個(gè)對(duì)“黑金剛”馬鈴薯紫紅色素提取影響顯著的因素,以紫紅色素得率為響應(yīng)值,進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表2。

表2 響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因素水平和編碼

1.3 數(shù)據(jù)處理

Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和相關(guān)數(shù)據(jù)分析均采用Design-expert8.1.0軟件完成,單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用OriginLabOriginPro8.5軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取劑的選擇及最大波長的確定

作為天然色素最關(guān)鍵的指標(biāo)之一是色澤,采用不同提取劑時(shí),“黑金剛”馬鈴薯色素的色澤有很大差異。其中,檸檬酸和稀鹽酸為提取劑時(shí),色素液為紫紅色,且色澤穩(wěn)定。而采用蒸餾水、無水乙醇、甲醇、甲醇-甲酸、50%乙醇為提取劑時(shí),色素液分別為棕色、無色、無色、無色、紫色(易褪色)。因此,檸檬酸和稀鹽酸可以作為提取劑。再結(jié)合全波長掃描結(jié)果(圖1),比較最大波長處對(duì)應(yīng)的吸光度值,稀鹽酸為提取劑時(shí),吸光度值高于以檸檬酸為提取劑。綜合考慮兩方面的因素,以稀鹽酸為“黑金剛”馬鈴薯的最優(yōu)提取劑。該提取劑與前期關(guān)于紫薯中花青素提取所用的提取劑組成一致[12],表明這種提取劑廣泛適用于花青素的提取。同時(shí),本研究提取的色素最大吸收波長為520 nm。

圖1 提取劑的優(yōu)化Fig.1 Optimization of extraction reagent

酸濃度的優(yōu)化結(jié)果如圖2所示,隨著酸濃度的增加,最大吸光度值逐漸增加且變化趨勢逐漸平緩。當(dāng)酸濃為0.20 mol/L和0.25 mol/L時(shí),其最大吸收波長處的吸光度值相同,表明提取效果一致。同時(shí),考慮到酸濃度越低,提取劑的價(jià)格越低,故確定最佳酸濃度為0.20 mol/L。

圖2 酸濃度的優(yōu)化Fig.2 Optimization of acid concentration

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

據(jù)報(bào)道[13-14]單因素(料液比、提取時(shí)間、提取溫度、提取次數(shù))對(duì)天然色素得率的影響較大,本研究考察這幾個(gè)單因素對(duì)色素得率的影響。

2.2.1 料液比對(duì)紫紅色素得率的影響 結(jié)果如圖3所示。隨著料液比的增加,紫紅色素得率逐漸增加,直至增加趨勢逐漸平緩。這是因?yàn)樵诘土弦罕认?單位質(zhì)量馬鈴薯粉中紫紅色素提取不完全,而逐漸增加料液比可以使紫紅色素被完全提取。然而溶劑過多,會(huì)導(dǎo)致溶劑的浪費(fèi)、生產(chǎn)成本提高以及濃縮和純化的困難。最佳料液比為1∶60(g/mL)。

圖3 料液比的優(yōu)化Fig.3 Optimization of solid-liquid ratio

2.2.2 提取時(shí)間對(duì)紫紅色素得率的影響 結(jié)果如圖4所示。隨著提取時(shí)間的增加,紫紅色素得率逐漸升高,在1.5 h時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)。這是因?yàn)殡S著提取時(shí)間的增加,單位質(zhì)量馬鈴薯粉中的紫紅色素逐漸充分溶解,使得率增大。其后隨著提取時(shí)間的延長,得率卻逐漸減小,可能隨著時(shí)間的延長,色素發(fā)生部分降解。故最佳提取時(shí)間為1.5 h。

圖4 提取時(shí)間的優(yōu)化Fig.4 Optimization of extraction time

2.2.3 溫度對(duì)紫紅色素得率的影響 結(jié)果如圖5所示。隨著提取溫度的升高,紫紅色素得率逐漸增大,并在提取溫度為70 ℃時(shí)達(dá)到最大值。之后,當(dāng)溫度繼續(xù)升高時(shí),得率反而下降。這是因?yàn)闇囟冗^高可能導(dǎo)致了紫紅色素的降解,使得率急劇下降。故最佳提取溫度為70 ℃。

圖5 提取溫度的優(yōu)化Fig.5 Optimization of extraction temperature

表3 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)方差分析

圖6 提取次數(shù)的優(yōu)化Fig.6 Optimization of extraction times

2.2.4 提取次數(shù)對(duì)紫紅色素得率的影響 結(jié)果如圖6所示。對(duì)同一樣品提取3次,第1次得率最高,第2次其次,第三次得率幾乎為零。結(jié)果表明,第1次提取后的殘?jiān)屑尤胩崛?紫紅色素還可以被溶出。但第2次提取后的殘?jiān)屑尤胩崛r(shí),紫紅色素已不能被溶出,表明在第2次提取時(shí),已將紫紅色素完全提取出。因此,最佳提取次數(shù)為2次。

2.3 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過Design-expert8.1.0軟件對(duì)得出的數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式擬合回歸,得出紫紅色素得率為響應(yīng)值的最優(yōu)方程為:得率=2.95+0.089A+0.052B-0.11C-7.106e-003D+0.22E,回歸方程顯著(p<0.05),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由偏回歸系數(shù)及顯著性檢驗(yàn)(表3)可以看出影響紫紅色素得率的五個(gè)因素的顯著性順序?yàn)?提取次數(shù)>提取時(shí)間>酸濃度>料液比>提取溫度。其中,提取次數(shù)和提取時(shí)間是顯著性因素(p<0.05),但僅選擇這兩個(gè)因素會(huì)使因素?cái)?shù)量太少,故選擇前三個(gè)因素進(jìn)行最陡爬坡實(shí)驗(yàn)。

2.4 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由PB實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,在“黑金剛”馬鈴薯紫紅色素提取過程中,提取次數(shù)和提取時(shí)間對(duì)得率有顯著性影響,其次酸濃度對(duì)得率的影響也較大,且三者都顯示為正效應(yīng)。從而設(shè)計(jì)5個(gè)爬坡實(shí)驗(yàn)組合,結(jié)果由表4可知,組合4的紫紅色素得率為最大,最接近最佳值區(qū)域,故以組合4的實(shí)驗(yàn)條件確定BBD響應(yīng)面的實(shí)驗(yàn)水平。

表4 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與及紫紅色素得率

2.5 響應(yīng)面優(yōu)化紫紅色素提取

2.5.1 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果 為優(yōu)化提取紫紅色素的最佳條件,以酸濃度(A)、提取時(shí)間(B)、提取次數(shù)(C)為自變量,以紫紅色素得率為響應(yīng)值,進(jìn)行響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)方案與結(jié)果見表5,表5中共有17個(gè)實(shí)驗(yàn),1～12為析因?qū)嶒?yàn),13～17為中心實(shí)驗(yàn),用以估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差。

表5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及紫紅色素得率

2.5.2 模型建立與方差分析 通過Design-expert8.1軟件對(duì)表6數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,建立多元二次回歸方程:得率=3.25+0.032A+2.547E-003B+0.39C+0.027AB-0.012AC+0.030BC-0.11A2-0.081B2-0.17C2。對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析,結(jié)果見表6。模型極顯著(p<0.0001),模型的決定系數(shù)R2=0.9889,說明回歸方程對(duì)實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合情況較好,該實(shí)驗(yàn)方法可靠;失擬項(xiàng)p值較大為0.7256,不顯著,該回歸模型與實(shí)測值能較好地?cái)M合。一次項(xiàng)A和B不顯著(p>0.05),C顯著(p<0.05);二次項(xiàng)顯著(p<0.05);交互項(xiàng)不顯著(p<0.05)。

表6 回歸模型及方差分析

2.5.3 響應(yīng)面分析 為了考察交互項(xiàng)對(duì)得率的影響,在其他因素條件固定不變的情況下,考察交互項(xiàng)對(duì)得率的影響,對(duì)模型進(jìn)行降維分析。經(jīng)Design-expert8.1軟件分析,可知,隨著每個(gè)因素的增大,響應(yīng)值增大;當(dāng)響應(yīng)值增大到極值后,隨著因素的增大,響應(yīng)值逐漸減小;在交互項(xiàng)對(duì)得率的影響中,即酸濃度與提取時(shí)間(AB)、酸濃度與提取次數(shù)(AC)、提取時(shí)間與提取次數(shù)(BC)之間交互作用明顯,與方差分析結(jié)果相一致。影響提取紫紅色素得率的主次因素為C>A>B,即提取次數(shù)>酸濃度>提取時(shí)間。

2.6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

通過回歸模型預(yù)測的“黑金剛”馬鈴薯紫紅色素得率的提取最佳條件及得率為:酸濃度0.31 mol/L、提取時(shí)間1.44 h(87 min)、提取次數(shù)3次,紫色色素得率3.47 mg/g。根據(jù)此條件進(jìn)行“黑金剛”馬鈴薯紫紅色素提取驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明,紫紅色素得率為3.43 mg/g,RSD為1.46%,接近理論值3.47 mg/g,說明響應(yīng)面法建立的“黑金剛”馬鈴薯紫紅色素提取數(shù)學(xué)模型對(duì)紫紅色素提取穩(wěn)定可靠,能指導(dǎo)實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用。

本研究優(yōu)化后色素的得率為3.43 mg/g,而楊智勇等[5]采用牽牛花素3葡萄糖苷為標(biāo)準(zhǔn)品時(shí),優(yōu)化后色素的得率為7.84 mg/g,兩篇研究得率相差比較大。猜測本研究得率計(jì)算結(jié)果較低的原因是,采用合成色素為定量標(biāo)準(zhǔn)品,因合成色素一般色價(jià)較天然色素高,導(dǎo)致用其作標(biāo)準(zhǔn)品用于測定天然色素含量時(shí)使得率計(jì)算結(jié)果相對(duì)偏低。后期需要將這幾種測定色素提取液含量的計(jì)算方法比較研究,建立統(tǒng)一的定量標(biāo)準(zhǔn)方法。但本研究采用的方法,不影響最優(yōu)工藝參數(shù)的判斷,可以作為“黑金剛”馬鈴薯色素提取液中色素定量方法的一種補(bǔ)充或參考方法。

3 結(jié)論

本研究經(jīng)優(yōu)化后的最佳工藝條件為:酸濃度0.31 mol/L、提取時(shí)間1.44 h(87 min)、提取次數(shù)3次、提取溫度70 ℃、料液比為1∶60。在此條件下紫紅色素的得率為3.43 mg/g,理論預(yù)測最大得率為3.47 mg/g,測定值與預(yù)測值相差較小,表明,基于PB實(shí)驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面法建立的數(shù)學(xué)模型對(duì)“黑金剛”馬鈴薯紫紅色素提取穩(wěn)定可靠,能指導(dǎo)實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用。

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Optimization of extraction conditions of purple-red pigment from“Heijingang”potato based on Plackett-Burman and response surface method

LIU Xi-xia,LU Si-fan,HOU Jian-jun*,LI Yun-tao

(Hubei Key Laboratory of Edible Wild Plants Conservation and Utilization, College of Life Sciences,Hubei Normal University,Huangshi 435002,China)

In order to investigate on best extraction conditions of purple-red pigment from Heijingang potato,the yield of purple-red pigment was used as an indicator. The key and optimum conditions for extraction pigment were found by Plackett-Burman(PB)and the steepest ascent experiment on the basis of single factor tests.Then,the critical conditions(acid concentration,extraction time,extraction times)were reoptimized by using response surface method(RSM). The results demonstrated that acid concentration of 0.31 mol/L,solid-liquid ratio of 1∶60 g/mL,extracting temperature of 70 ℃,extracting time of 87 min,extracting times of 3 times. Under those conditions,the yield could arrive to 3.43 mg/g.

Heijingang potato;purple-red pigment;Plackett-Burmaken experiment;response surface test

2016-04-18

劉細(xì)霞(1983-)，女，博士，講師，研究方向：食品營養(yǎng)與安全，E-mail：liuxixia1@163.com。

*通訊作者:侯建軍(1966-)，男，博士，教授，研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)，E-mail：1505158971@qq.com。

食用野生植物保育與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金(EWPL201405)；湖北師范大學(xué)校級(jí)優(yōu)秀創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(T201504)。

TS255.1

B

1002-0306(2016)22-0285-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.22.047