基于響應面法優化Flavobacteriaceae sp.CZ1127中巖藻糖苷酶提取參數的研究

陳 豐,王 俊,申晶晶,董書君,常耀光

(中國海洋大學食品科學與工程學院,山東青島 266003)

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基于響應面法優化Flavobacteriaceaesp.CZ1127中巖藻糖苷酶提取參數的研究

陳 豐,王 俊,申晶晶,董書君,常耀光*

(中國海洋大學食品科學與工程學院,山東青島 266003)

海洋細菌Flavobacteriaceaesp.CZ1127胞內含有大量巖藻糖苷酶,為高效獲取該胞內酶,本文比較了超聲破碎法、化學試劑法、反復凍融法、溶菌酶法及滲透壓沖擊法等多種細胞破碎方法,確定了超聲破碎法為較優的提取方式。在此基礎上,利用響應面實驗設計研究超聲破碎各因素對提取效果的影響。最終建立了基于超聲破碎法提取巖藻糖苷酶實驗數據的數學模型,優化后的工藝條件參數為:破碎功率300 W,菌懸液濃度20 mg/mL,破碎總時長10.2 min,單次破碎時長2 s,間歇時長2 s。在優化條件下,Flavobacteriaceaesp.CZ1127菌體中獲得巖藻糖苷酶酶活為(13285.6±274.3) mU/g。本文針對巖藻糖苷酶的提取建立了一種高效簡便的方法,對該酶的進一步開發利用具有積極意義。

巖藻糖苷酶,提取,優化,響應面,Flavobacteriaceaesp.

L-巖藻糖是常出現于糖基片段末端的單糖之一,研究認為巖藻糖基化能夠賦予被修飾的寡糖、多糖及復合物眾多獨特的功能特性,例如:以L-巖藻糖為主要組分的多糖類化合物-巖藻聚糖硫酸酯被證實具有抗腫瘤[1]、抗凝血[2]、調節免疫[3]以及預防乙醇型胃潰瘍[4]等多種生理調節功能;對一種海參來源類硫酸軟骨素的研究表明,去掉其巖藻糖支鏈將顯著降低其抗凝血活性[5];巖藻糖基化乳糖作為人乳寡糖的重要成分,是嬰兒發育早期重要的益生元[6-7]。巖藻糖基化化合物在功能食品開發方面展現出巨大潛力,如日本的“海の雫”沖劑和韓國“FUCOIDAN”口服液等基于巖藻聚糖硫酸酯開發的功能食品已實現商業化,但國內仍缺乏相關產品。巖藻糖苷酶是研究及改造巖藻糖基化化合物不可缺少的工具酶[8],因此,巖藻糖苷酶的獲取及進一步應用可能將有利于巖藻糖基化化合物的研究與產品開發。

巖藻糖苷酶廣泛存在于動物、植物與微生物中,相較動物與植物產生的巖藻糖苷酶,微生物所產生的酶產量更大,更適于大規模發酵生產以及滿足應用所需[8-9]。本課題組前期從近海海水中篩選得到一株海洋細菌Flavobacteriaceaesp.CZ1127,可大量產生巖藻糖苷酶,但其主要產酶位置為胞內。基于此背景,本研究擬針對Flavobacteriaceaesp.CZ1127胞內巖藻糖苷酶的提取方式及條件展開系統探索,從而為該酶制備與應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Flavobacteriaceaesp.CZ1127 本實驗室分離于近海海水[10],保藏于中國典型微生物保藏中心(保藏號:CCTCC AB 2015089T);海地瓜參(Acaudinamolpadioides) 購自青島南山水產品市場;TritonX-100 AMRESCO公司;對硝基苯酚巖藻糖苷、十二烷基硫酸鈉(SDS) Sigma公司;吐溫20、吐溫40、吐溫60、吐溫80 天津博迪化工股份有限公司;溶菌酶 北京Solarbio科技有限公司;其他試劑 購于國藥集團化學試劑有限公司。

高速冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠;HZQ-F160振蕩培養箱 哈爾濱市東聯生化儀器;UV-2550紫外可見分光光度計 SHIMADZU公司;Scientz-650E超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 巖藻聚糖硫酸酯的制備 以海地瓜參體壁為原料,按參考文獻方法提取其中的巖藻聚糖硫酸酯[10],關鍵步驟如下:干海參粉碎,丙酮浸泡脫脂,木瓜蛋白酶酶解,氯化十六烷基吡啶沉淀得到粗多糖,Sepharose Q Fast Flow離子交換樹脂純化,透析脫鹽,凍干后得到巖藻聚糖硫酸酯。

1.2.2 菌體制備 接種Flavobacteriaceaesp.CZ1127至液體發酵培養基(巖藻聚糖硫酸酯 0.2%,NaNO30.2%,MgSO40.5%,CaCl20.01%,Fe2(SO4)30.001%,溶于過濾膜海水,pH7.0),接種量5%,25 ℃恒溫培養箱培養48 h[10]。培養結束后4 ℃離心(10000 r/min,10 min),以20 mmol/L pH7.2 Tris-HCl緩沖液(含5 mmol/L MgCl2)重懸沉淀并再次離心(10000 r/min,10 min),收集沉淀得到濕菌體并稱重。

1.2.3 提取方法的篩選 分別采用化學試劑法[11]、反復凍融法[12]、溶菌酶法[12]、滲透壓沖擊法[12]及超聲破碎法[12-13]提取Flavobacteriaceaesp.CZ1127菌體胞內的巖藻糖苷酶,測定提取酶液中巖藻糖苷酶的酶活(方法見1.2.6),依據公式(1)計算提取率。

式(1)

1.2.3.1 化學試劑法 選擇吐溫20、吐溫40、吐溫60、吐溫80、TritonX-100及SDS作為提取試劑,分散或溶解于20 mmol/L pH7.2 Tris-HCl緩沖液中,濃度分別為0.2%(v/v)、0.2%(v/v)、0.2%(v/v)、0.2%(v/v)、0.75%(v/v)及0.03 mg/mL。將菌體按20 mg/mL的濃度重懸于各提取液,25 ℃振搖1 h后4 ℃離心(10000 r/min,10 min),取上清即得酶液。

1.2.3.2 反復凍融法 將菌體按20 mg/mL的濃度重懸于20 mmol/L pH7.2 Tris-HCl緩沖液,-40 ℃冷凍2 h后于25 ℃融化,反復凍融5次,4 ℃離心(10000 r/min,10 min)收集上清即得酶液。

1.2.3.3 溶菌酶法 將菌體以20 mg/mL的濃度重懸于溶菌酶溶液(10 mg/mL,20 mmol/L Tris-HCl,pH8.0)中,37 ℃孵育1 h,4 ℃離心(10000 r/min,10 min)取上清即得酶液。

1.2.3.4 滲透壓沖擊法 將菌體以20 mg/mL的濃度重懸于高滲透壓溶液(20 mmol/L pH7.2 Tris-HCl緩沖液含0.5 mg/mL EDTA及0.15 g/mL蔗糖),冰水浴0.5 h,4 ℃離心(12000 r/min,10 min),收集菌體沉淀并加入與高滲透壓溶液等體積的20 mmol/L pH7.2 Tris-HCl緩沖液,冰水浴0.5 h,4 ℃離心(10000 r/min,10 min)收集菌體,再次重復上述操作,取上清即得酶液。

1.2.3.5 超聲破碎法 將菌體按20 mg/mL的濃度重懸于20 mmol/L pH7.2 Tris-HCl緩沖液。菌懸液置于冰水浴中超聲破碎,超聲功率500 W,單次破碎時長2 s,間歇時長2 s,工作總時長12 min。完畢后4 ℃離心(10000 r/min,10 min),取上清即得酶液。

1.2.4 超聲破碎法單因素實驗 選擇超聲功率、超聲總時長、菌懸液濃度、單次超聲時長、間歇時長等5個因素進行單因素實驗,考察這5個因素對巖藻糖苷酶提取率的影響。

1.2.4.1 破碎功率的影響 破碎總時長固定為12 min,菌懸液濃度為20 mg/mL,單次破碎時長為2 s,間歇時長為2 s,破碎功率分別為100、200、300、400、500 W。

1.2.4.2 破碎總時長的影響 破碎功率固定為300 W,菌懸液濃度為20 mg/mL,單次破碎時長為2 s,間歇時長為2 s,破碎總時長分別為3、6、9、12、15 min。

1.2.4.3 菌懸液濃度的影響 破碎功率固定為300 W,破碎總時長為6 min,單次破碎時長為2 s,間歇時長為2 s,菌懸液濃度分別為5、10、20、30、40 mg/mL。

1.2.4.4 單次破碎時長的影響 破碎功率固定為300 W,破碎總時長為6 min,菌懸液濃度為20 mg/mL,間歇時長為2 s,單次破碎時長分別為1、2、4、6、8 s。

1.2.4.5 間歇時長的影響 破碎功率固定為300 W,破碎總時長為6 min,菌懸液濃度為20 mg/mL,單次破碎時長為2 s,間歇時長分別為1、2、4、6、8 s。

1.2.5 超聲破碎法響應面優化 利用Design Expert軟件(v 8.0.6),根據中心組合實驗設計原理,以破碎總時長(X1)、單次破碎時長(X2)及菌懸液濃度(X3)等三個變量為自變量,以提取率(Y)為響應值,設計三因素五水平響應面優化實驗。實驗因素及其水平的取值見表1。

1.2.6 酶活測定方法 以巖藻糖苷酶降解對硝基苯酚巖藻糖苷的能力定量其酶活[14]:將150 μL底物溶液(對硝基苯酚巖藻糖苷溶于20 mmol/L pH7.2 Tris-HCl,濃度為3.0 mmol/L)與150 μL適當稀釋的酶液混合,28 ℃下反應30 min后立即加入2.7 mL 0.55 mol/L Na2CO3溶液終止反應,利用分光光度計測定400 nm 波長下吸光值,根據OD400 nm與對硝基苯酚濃度的關系,計算對硝基苯酚生成量,

表1 中心組合實驗設計因素與水平表

表2 不同提取方法對巖藻糖苷酶的提取效果

從而計算出巖藻糖苷酶酶活。酶活單位定義1 mL酶液于1 min內水解底物產生1 μmol對硝基苯酚的活力為1 U;以單位質量(g)菌體獲得巖藻糖苷酶酶活的量(10-3U,mU)表示提取率,其單位以mU/g表示。

1.2.7 數據處理 各實驗重復3次,結果以平均值±標準偏差表示。利用Design Expert軟件進行響應面實驗數據分析,建立數學模型。

2 結果與討論

2.1 不同提取方法的比較研究

利用化學試劑法(Triton、SDS及吐溫)、反復凍融法、溶菌酶法、滲透壓沖擊法以及超聲破碎法對Flavobacteriaceaesp.CZ1127進行處理,各方法提取率,見表2。

Trition及SDS處理對Flavobacteriaceaesp.CZ1127胞內巖藻糖苷酶具有一定的提取效果,吐溫20、40、60以及80的提取效果較差。TritonX-100、SDS、吐溫20、吐溫40、吐溫60及吐溫80屬于表面活性劑,具有雙親性,可通過擾亂細胞壁及細胞膜中脂質分子的致密性、增加膜結構的通透程度,實現胞內酶釋放。吐溫20、40、60以及80的表面活性比Triton X-100和SDS弱,這可能導致它們的提取效果不如后兩者理想。

反復凍融法和滲透壓沖擊法的提取率并不顯著。反復凍融法是利用凍結-解凍過程中冰晶對細胞產生機械性損傷從而使細胞破碎的物理方法[16]。滲透壓沖擊法利用高滲透壓及低滲透壓的轉換使細胞發生溶脹,釋放胞內物質。

溶菌酶可水解細菌細胞壁中的肽聚糖,從而破壞細胞壁結構、實現胞內物質的獲取。溶菌酶常用于革蘭氏陽性菌胞內物質的提取。Flavobacteriaceaesp.CZ1127屬于革蘭氏陰性菌[11],細胞壁中肽聚糖含量較少,這使得溶菌酶處理的提取率有限。

超聲波作為一種彈性機械振動波,可以產生空化效應和強烈的振動作用,從而破壞細胞的完整結構、釋放胞內成分[15]。結果顯示,超聲破碎法的提取率最高,為12450.26 mU/g。基于此,選擇超聲破碎法進行下一步的條件優化。

2.2 超聲破碎法條件的單因素實驗

2.2.1 超聲破碎功率對提取效果的影響 在本實驗選取的條件范圍內,各破碎功率對應的提取率之間無顯著性差異(p>0.05)(圖1)。其中破碎功率為300 W時提取率在數值上最高,因此將破碎功率固定為300 W進行后續優化實驗。

圖1 功率對超聲破碎法提酶效果的影響Fig.1 Influence of power on the performance of ultrasonication

2.2.2 超聲破碎總時長對提取效果的影響 隨著破碎總時長增加,超聲破碎法的提取率呈現先明顯增加(3～6 min)后保持相對穩定(6～15 min)的趨勢(圖2)。這提示破碎總時長達到6 min時細胞的破碎效果已較為完全,繼續延長可能將增強超聲破碎的熱效應從而使酶活受到損失。因此選擇破碎時間為6 min進行后續優化實驗。

圖2 破碎總時長對超聲破碎法提酶效果的影響Fig.2 Influence of total ultrasonic time on the performance of ultrasonication

2.2.3 超聲破碎菌懸液濃度對提取效果的影響 超聲破碎法的提取率隨著菌懸液濃度的增加呈現先增加后下降的趨勢,當菌懸液濃度為20 mg/mL時,提取率最高(圖3)。當菌液濃度較低的時候,超聲波在傳遞中會損失較多的能量,不利于細胞的破碎;隨著菌液濃度的增加,超聲波的能量損失減少,表現為破碎效果的提高;但隨著菌液濃度的增加液體的粘稠度會相應增加,從而使超聲波的空化效應減弱,導致破碎效果降低[17]。

圖3 菌懸液濃度對超聲破碎法提酶效果的影響Fig.3 Influence of bacterial concentration on the performance of ultrasonication

2.2.4 超聲破碎單次破碎時長對提取效果的影響 隨著單次破碎時長的增長,超聲破碎法的提取率呈現先增加后下降的趨勢,當單次破碎時長為2 s時呈現出最高值(圖4)。超聲波的空化效應是空氣泡形成、振動、膨脹、壓縮和崩潰閉合的過程,這種效應的形成需要一定的時間,時間過短不足以完成空化,適時的工作方式使超聲波產生的空氣泡有更多時間和機會完成膨脹與爆炸,從而增加破碎效果[18],但是時間過長會產生過多熱量導致酶活損失。

圖4 單次破碎時長對超聲破碎法提酶效果的影響Fig.4 Influence of single ultrasonic time on the performance of ultrasonication

2.2.5 超聲破碎間歇時長對提取效果的影響 超聲破碎法的提取率隨間歇時長增加整體呈現先增長而后輕微降低的趨勢,間歇時長為2 s時提取效果最佳(圖5)。超聲破碎中設定間歇時長的目的是為了促進處理液與冰水浴環境之間的熱交換,從而降低超聲產熱導致的酶活損失。上述結果提示,間歇時長設置為2 s時熱交換的效果已較為充分,同時,從節約時間成本的角度考慮,選擇2s為適宜的間歇時長條件。

圖5 間歇時長對超聲破碎法提酶效果的影響Fig.5 Influence of interval time on the performance of ultrasonication

2.3 超聲破碎條件的響應面優化

單因素實驗的結果表明,破碎總時長(X1)、單次破碎時長(X2)以及菌懸液濃度(X3)可能對巖藻糖苷酶的提取率具有顯著影響。為進一步優化提取條件,選取上述三個因素進行響應面實驗。

根據中心組合實驗設計,共設置20個實驗點,實驗結果如表3所示。利用Design Expert軟件對表3進行多元線性回歸和二項式擬合,建立的模型為:

Y=13027.7+191.46X1- 510.62X2- 524.31X3-232.94X1X2+35.23X1X3+56.79X2X3- 122.08X12-241.93X22- 1134.19X32

表3 響應面實驗設計及結果

模型方差分析如表4所示,模型整體達極顯著水平(p<0.01),失擬項不顯著(p>0.05),說明其他因素對實驗結果的干擾小。模型相關系數R2(0.9723)較高,表明該模型和實際情況擬合較好。同時,該模型的變異系數較低,為2.31%,變異系數是衡量每個平均值偏離情況的參數,其值越小,重復性越好。綜上分析,該模型可以較好的描述各因素和響應值之間關系,能夠用于預測超聲破碎法對Flavobacteriaceaesp.CZ1127胞內巖藻糖苷酶的提取率。同時,對于回歸方程系數的顯著性檢驗結果表明,單次破碎時長(X2)、菌懸液濃度(X3)對提酶率影響極顯著,破碎總時長(X1)對提酶率影響顯著;同時,交互項X1X2也具有顯著性影響,表明破碎總時長和單次破碎時長之間存在顯著交互作用。

表4 回歸模型方差分析

注:*:差異顯著,p<0.05;**:差異極顯著,p<0.01。

各因素之間的交互影響如圖6所示。當單次破碎時長較短時,增大破碎總時長利于細胞破碎,提取率呈增長趨勢;當單次破碎時長較大時,增大破碎總時長會加劇超聲波的熱效應使酶失活,提取率則呈減小趨勢(圖6a),這說明破碎總時長和單次破碎時長交互效應顯著,與方差分析結果相一致。

圖6 各顯著因素對破碎效果的交互影響Fig.6 The interaction effect of significant factors on ultrasonic results

根據擬合的數學模型,預測提取率最高時的超聲條件為:破碎總時長10.2 min,單次破碎時長2 s,菌懸液濃度20 mg/mL。預測得出最優的提取率為13664.4 mU/g。為驗證模型預測的準確性,按照預測的提取條件進行巖藻糖苷酶的提取,提取率為(13285.6±274.3) mU/g,結果與預測值相近,說明模型的預測效果較為理想。

3 結論

考察了多種細胞破碎方法對Flavobacteriaceaesp.CZ1127胞內巖藻糖苷酶的提取效果,確定了超聲破碎法是較優的提取方式。通過單因素及響應面優化實驗,成功建立了超聲破碎提取效果與破碎總時長、單次破碎時長以及菌懸液濃度等顯著影響因素之間的數學模型,得出最優工藝條件為:破碎功率300 W,菌懸液濃度20 mg/mL,破碎總時長10.2 min,單次破碎時長2 s,間歇時長2 s。在最優條件下,可從單位質量(g)菌體中獲得巖藻糖苷酶酶活(13285.6±274.3) mU。本研究建立了一種提取制備巖藻糖苷酶的良好方法,為該酶的進一步開發利用提供了有益的技術支撐。

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Optimization of the parameters for fucosidase extraction fromFlavobacteriaceaesp.CZ1127 based on response surface methodology

CHEN Feng,WANG Jun,SHEN Jing-jing,DONG Shu-jun,CHANG Yao-guang*

(College of Food Science and Engineering,Ocean University of China,Qingdao 266003,China)

The marine bacteriaFlavobacteriaceaesp.CZ1127 is abundant in intracellular fucosidase activity. This paper compared various methods for extracting fucosidase,including ultrasonication,chemical reagents,repeated freeze-thawing technique,lysozyme method and osmotic shock,and found that ultrasonication was an favorable one. In order to optimize parameters,the factors of ultrasonication for extracting fucosidase were investigated by response surface methodology,and a second order quadratic equation was finally established. The optimal operating parameters were determined as follows:total ultrasonic time 10.2 min,single ultrasonic time 2 s,intermittent 2 s,and bacterial concentration 20 mg/mL. Under those condition,the yield of fucosidase activity from the bacteria cells was high to(13285.6±274.3)mU/g. This study established an optimal method for extracting and preparing fucosidase,which would facilitate the further utilization of the enzyme.

fucosidase;extraction;optimization;response methodology;Flavobacteriaceaesp.

2016-03-24

陳豐(1992-),男,碩士研究生,研究方向:食品酶學,E-mail:cfeng719@163.com。

*通訊作者:常耀光(1985-),男,副教授,研究方向:海洋食品碳水化合物,E-mail:changyg@ouc.edu.cn。

國家自然科學基金(31471684)。

TS201.1

A

1002-0306(2016)22-0248-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.22.040