酶解對枸杞果出汁率的影響

王 婭,馬文平,*,許蘭仙,姜一山

(1.北方民族大學生物科學與工程學院,寧夏銀川 750021;2.北方民族大學材料科學與工程學院,寧夏銀川 750021)

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酶解對枸杞果出汁率的影響

王 婭1,馬文平1,*,許蘭仙1,姜一山2

(1.北方民族大學生物科學與工程學院,寧夏銀川 750021;2.北方民族大學材料科學與工程學院,寧夏銀川 750021)

以寧夏枸杞鮮果為原料,經打漿與護色后,用不同酶制劑進行酶解處理,結合酶量、反應溫度、反應時間及底物pH,考察對枸杞出汁率和可溶性固形物的影響。經單因素和Box-Behnken優化實驗,確定枸杞漿最佳酶解工藝。實驗確定的果膠酶酶解最優條件為:果膠酶添加量0.016%,溫度41 ℃,酶解時間1.3 h,枸杞漿出汁率為48.75%。復合酶酶解最優條件為:復合酶(果膠酶∶纖維素酶=3∶7)添加量0.09%,酶解溫度35 ℃,酶解時間2.7 h,枸杞漿出汁率為49.20%。且兩種酶對可溶性固形物無顯著性影響(p>0.05)。結果表明:果膠酶及復合酶均能大幅度提高枸杞果的出汁率,但復合酶比單一果膠酶對提高枸杞果出汁率效果更好。

枸杞鮮果,果膠酶,復合酶,出汁率,可溶性固形物

枸杞為茄科植物枸杞(LyciumChinese Mill)的干燥成熟果實,是一種藥食兩用植物，廣泛分布在我國北方地區的河北、內蒙古、山西、陜西、甘肅、寧夏、新疆和青海等地。中心分布區域在甘肅河西走廊、青海柴達木盆地以及青海至山西的黃河沿岸地帶[1]。枸杞味甘、性平,具有多種藥理作用和生物活性功能。枸杞多糖是其中的主要活性成分之一,研究表明枸杞多糖具有增強免疫力、抗衰老[2]、控制血糖、保護神經[3]、抗疲勞[4]、抑制腫瘤生長和細胞突變[5]等作用。

枸杞果實富含果膠、纖維素等大分子物質,破碎后枸杞汁粘度大,取汁困難且出汁率不高。通過纖維素酶、果膠酶能有效降解這些大分子物質,提高果蔬的出汁率,還能明顯的提高果汁的過濾效率,減少化學澄清劑的用量,改善果汁質量,保留果汁中的營養成分。Sreenath等[6]研究了纖維素酶和果膠酶對降低芒果漿黏度的影響,發現丹麥產的Ultrazym100對降低芒果漿黏度的能力效果最好,可使黏度降低82%,果膠酶和纖維素酶同時使用時能將出汁率提高8%～10%。趙艷玲等[7]在使用果膠酶對樹莓出汁率影響的研究表明,果膠酶可以提高樹莓的出汁率,并且對樹莓汁中的可溶性固形物含量影響很小;孫平等[8]在使用果膠酶對枸杞汁的澄清實驗研究中表明,果膠酶可提高枸杞果汁透光率,明顯改善果汁澄清效果。王夢澤等[9]應用響應面優化枸杞濁汁酶解工藝,結果表明,果膠酶和纖維素酶均可提高枸杞出汁率。

實驗以寧夏枸杞鮮果為原料,經打漿護色后進行酶解工藝處理,分別考察果膠酶及復合酶添加量、酶解時間、酶解溫度、底物pH對枸杞漿出汁率和可溶性固形物的影響,并應用Box-Behnken響應面法對酶解工藝條件進行優化,確定最佳工藝參數,為枸杞深加工及功能性成分的研發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枸杞鮮果 2014、2015年7月上旬采摘于寧夏蘆花臺園林場,經挑選、除雜、清洗后儲存于-60 ℃超低溫冰箱;果膠酶 酶活力5萬U/g,河南東順化工產品有限公司;纖維素酶 酶活力20萬U/g,上海權旺生物科技有限公司;維生素C 上海金穗生物科技有限公司;95%乙醇、無水乙醇等 均為分析純。

H2050R-1型臺式高速冷凍離心機 湖南湘儀離心機儀器有限公司;電熱鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司;HH·SY21-Ni型電熱恒溫水浴鍋 北京長源實驗設備廠;752N型紫外可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司;VBR型手持折光儀 北京維欣儀奧科技發展有限公司;FSH-2型高速電動勻漿機 常州潤華電器有限公司;DW-86L386型海爾超低溫冰箱 青島海爾特種電器有限公司;SHA-B型恒溫振蕩器 常州國華電器有限公司;PHS-3EpH酸度計;PL203型電子天平(0.0001 g) 梅特勒-托利多儀器有限公司;200目過濾袋等。

1.2 實驗方法

1.2.1 枸杞汁的制備 枸杞鮮果(-60 ℃)→解凍、回溫→熱燙(沸水,5 min)→打漿→護色→酶解→滅酶→離心→過濾→枸杞汁。

1.2.1.1 解凍、回溫 從超低溫冰箱取出枸杞冷凍果,放入4 ℃冰箱,熔化。

1.2.1.2 熱燙、打漿 將熔化后的枸杞果,于沸水中熱燙5 min,取出,立刻放入冷水中,直到溫度達到常溫,然后使用勻漿機制備枸杞漿,備用。

1.2.1.3 護色 維生素C的添加量為0.3%,攪拌均勻,室溫放置1 h對枸杞漿進行護色。

1.2.2 可溶性固形物含量的測定 用VBR型手持折光儀測定。

1.2.3 褐變指數的測定 采用分光光度計法,將加入VC后的果漿經4層紗布過濾,收集濾液。準確量取每種濾液各5 mL,分別加入5 mL 95%乙醇提取,在9000 r/min下離心15 min,取上清液在分光光度儀420 nm下測其OD值。該吸光度值指的是非酶促反應產生褐變的褐變指數[10]。

1.2.4 出汁率的計算

出汁率(%)=(獲得汁液質量-加水質量)/原料質量×100[11]

1.2.5 果膠酶酶解工藝參數的確定 根據預實驗結果,選擇果膠酶添加量、酶解時間、酶解溫度、底物pH為主要工藝參數,以枸杞漿出汁率及可溶性固形物為評價指標進行實驗。重復三次。

稱取經過護色后的枸杞漿400 g,分別研究果膠酶添加量(分別添加0.005%、0.01%、0.03%、0.05%、0.1%、0.15%的果膠酶,在40 ℃下,酶解2 h,不添加果膠酶為空白對照)，酶解溫度(添加果膠酶0.1%,分別在30、35、40、45、50、55 ℃下,酶解2 h)，酶解時間(添加果膠酶0.1%,在40 ℃下,分別酶解0.5、1、1.5、2、2.5、3 h)，底物pH(果膠酶0.1%,在40 ℃下,分別調節pH為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5,酶解2 h)對出汁率及可溶性固形物含量的影響。

1.2.6 果膠酶酶解工藝參數的優化 利用Box-Benhnken的中心組合實驗設計,選取對枸杞漿出汁率影響顯著的3個因素,果膠酶添加量、酶解溫度、酶解時間,采用3因素3水平的響應面分析方法進行優化實驗設計,如表1所示。

表1 響應面實驗因素水平表

1.2.7 復合酶酶解工藝參數的確定

1.2.7.1 復合酶比例的確定 選取果膠酶與纖維素酶復配,設置兩種酶的添加量比例為1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、6∶4、7∶3,取枸杞漿10 g,加入0.2%的復合酶,40 ℃水浴酶解1.5 h,測定枸杞漿出汁率。重復三次。

1.2.7.2 其他工藝參數的確定 根據預實驗結果,選擇復合酶添加量、酶解時間、酶解溫度、底物pH為主要工藝參數,以枸杞漿出汁率及可溶性固形物為評價指標進行各項單因素實驗,重復三次。

稱取經過護色后的枸杞漿400 g,分別研究復合酶添加量(分別添加0.03%、0.05%、0.07%、0.09%、0.11%、0.13%的復合酶,在40 ℃下,酶解2 h);酶解溫度(添加復合酶0.03%,分別在30、35、40、45、50、55 ℃下,酶解2 h);酶解時間(添加復合酶0.03%,在40 ℃下,分別酶解0.5、1、1.5、2、2.5、3 h);底物pH(復合酶0.03%,在40 ℃下,分別調節pH為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5,酶解2 h)對出汁率及可溶性固形物含量的影響。

1.2.8 復合酶酶解工藝參數的優化 利用Box-Benhnken中心組合實驗設計,選取對枸杞漿出汁率影響顯著的3個因素,復合酶添加量、酶解溫度、酶解時間,采用3因素3水平的響應面分析方法進行優化實驗設計,如表2所示。

1.2.9 數據處理 數據處理EXCEL,統計采用IBM SPSS Statistics Version 21 軟件進行顯著性分析。

表2 響應面實驗因素水平表

2 結果與分析

2.1 果膠酶對枸杞漿出汁率的影響

2.1.1 果膠酶添加量對枸杞漿出汁率的影響 圖1表明,對照處理枸杞漿的出汁率為54.42%,隨著果膠酶量的添加,枸杞漿出汁率呈先上升后下降的趨勢,當酶的添加量在0.01%～0.03%之間,枸杞漿的出汁率、可溶性固形物,沒有顯著性(p>0.05)變化,因此確定果膠酶的添加量為0.01%。果膠酶添加量較少時,果膠物質分解不完全,出汁率較差;酶用量過多時,高濃度底物降低了水的有效濃度,降低了分子擴散性,從而降低了酶促反應速度,影響了出汁效果,降低了出汁率[12]。

圖1 果膠酶添加量對枸杞漿出汁率及可溶性固形物的影響Fig.1 Effect of pectinase adding amount on wolfberry pulp juice yield and soluble solids

圖2 酶解溫度對枸杞漿出汁率及可溶性固形物的影響Fig.2 Effect of enzymolysis temperature on the Chinese wolfberry pulp juice yield and soluble solids

2.1.2 酶解溫度對枸杞漿出汁率的影響 圖2表明,隨著溫度的增加,枸杞漿的出汁率先增大后減少,當溫度達到40 ℃時,出汁率達到最大,而可溶性固形物沒有顯著性(p>0.05)變化,因此,確定酶解溫度為40 ℃。這主要是因為酶在最適溫度范圍內,酶活性最強,酶促反應速度最大;隨著溫度的升高,酶活性逐漸降低,影響了出汁率。

2.1.3 酶解時間對枸杞漿出汁率的影響 圖3表明,隨著時間的增加,枸杞漿的出汁率先增大后減少,當達到1.5 h時,出汁率最大,而可溶性固形物的含量,沒有顯著(p>0.05)變化,因此,確定酶解時間為1.5 h。這主要是因為酶解時間不足,會導致酶解不完全,影響出汁效果,酶解時間過長,則會造成出汁成本的提高和生產效率的降低。

圖3 酶解時間對枸杞漿出汁率及可溶性固形物的影響Fig.3 Effect of enzymolysis time on Chinese wolfberry pulp juice yield and soluble solids

2.1.4 底物pH對枸杞漿出汁率的影響 圖4表明,隨pH的增大,枸杞漿出汁率、可溶性固形物先增大后減少,當pH為3.5時,出汁率為最大,而可溶性固形物在pH達到4.5時為最大,由于枸杞漿的自然pH為4.38,因此,確定底物pH為枸杞漿自然pH。

圖4 底物pH對枸杞漿出汁率及可溶性固形物的影響Fig.4 Effect of substrates pH on wolfberry pulp juice yield and soluble solids

2.1.5 果膠酶響應面優化實驗結果 利用Design-expert 8.0.6.1對實驗數據(表3)進行分析,因子經回歸擬合,得到回歸方程:

Y=48.58-1.55A+0.55B-0.82C+0.76AB-0.20AC-0.16BC-5.01A2-2.47B2-1.23C2

表4 響應面模型的方差分析

注:*為顯著(p<0.05),**為極顯著(p<0.01);表6同。

表3 響應面實驗設計及實驗結果

決定系數R2為0.9799,表明所選擇的模型很好的擬合了實驗數據。由表4可知,該模型的F=37.96,p<0.0001,表明實驗所采用的二次模型是極顯著的,可以采用回歸模型對響應值(枸杞漿出汁率)進行預測。失擬項p為0.0664不顯著(p>0.05),表明模型是穩定的,能很好的預測實際枸杞漿出汁率的變化。因素A、A2、B2、C2(p<0.01)對出汁率均有極顯著影響,而因素C、AB(p<0.05)對出汁率有顯著影響。

2.1.6 果膠酶響應面優化分析 由圖5可知,當酶量一定時,枸杞漿的出汁率隨著溫度的變化趨勢,先增大后減小。當酶解溫度一定時,枸杞漿的出汁率隨著酶量的變化趨勢,先增大后減小。這是由于溫度較低時果膠酶酶解枸杞細胞壁酶解不完全,所以出汁率較低,當達到一定溫度后,隨著溫度進一步升高果膠酶活性降低,枸杞出汁率減少。

圖5 果膠酶添加量A與酶解溫度B對枸杞漿出汁率的響應面Fig.5 Responsive surfaces of Y=f(A,B)

由圖6可知,當酶量一定時,枸杞漿的出汁率隨著時間的延長,先增大后減小,但其變化的幅度不大。當酶解時間一定時,枸杞漿的出汁率隨著酶量的變化趨勢,先增大后減小。

圖6 果膠酶添加量A與酶解時間C對枸杞漿出汁率的響應面Fig.6 Responsive surfaces of Y=f(A,C)

由圖7可知,當酶解溫度一定時,枸杞漿的出汁率隨著時間的延長,變化幅度極微。當酶解時間一定時,枸杞漿的出汁率隨著酶解溫度的變化趨勢,逐漸增大,當升高到一定溫度后出汁率升高極微。

圖7 酶解溫度B與酶解時間C對枸杞漿出汁率的響應面Fig.7 Responsive surfaces of Y=f(B,C)

根據果膠酶酶解枸杞原漿的響應面優化結果得出,果膠酶添加量0.016%,溫度40.5 ℃,酶解時間1.34 h,枸杞漿的理論出汁率為48.85%。

2.1.7 果膠酶最優酶解條件的驗證 在可操作的情況下,校正果膠酶酶解枸杞原漿的最優酶解條件果膠酶添加量0.016%,溫度41 ℃,酶解時間1.3 h,經驗證,得出其最高出汁率為48.75%,與理論值48.85%接近。

2.2 復合酶對枸杞漿出汁率的影響

2.2.1 復合酶比例的確定 由圖8可知,隨著果膠酶所占比例量的增加纖維素酶所占比例量的減少,枸杞漿的出汁率先增大后減少,可溶性固形物的含量逐漸降低。當果膠酶與纖維素酶添加量的比例為3∶7時,枸杞漿出汁率最大,因此,確定復合酶中果膠酶含量與纖維素酶含量比例為3∶7。

圖8 果膠酶與纖維素酶添加比例對出汁率與可溶性固形物的影響Fig.8 Effect of pectinase,cellulase and proportion on juice yield and soluble solids

圖9 復合酶添加量對枸杞漿出汁率及可溶性固形物的影響Fig.9 Effect of composite enzyme addition amount on wolfberry pulp juice yield and soluble solids

2.2.2 復合酶添加量對枸杞漿出汁率的影響 圖9表明,隨復合酶量添加量的增加枸杞漿出汁率先增大后減少,酶量在0.09%時,枸杞漿的出汁率為最大。可溶性固形物隨酶量的增加,逐漸減少。因此確定果膠酶的添加量為0.09%。這主要是因為酶添加量少時,果膠、纖維素物質分解不完全,出汁效果差,酶添加量過多時,高濃度底物降低了水的有效濃度,降低了分子擴散性,從而降低了酶促反應速度,影響了出汁效果,降低了出汁率。

2.2.3 復合酶酶解溫度對枸杞漿出汁率的影響 圖10表明,隨著溫度的增加,枸杞漿的出汁率先逐漸增大,當溫度達到35 ℃時,出汁率達到最大,而可溶性固形物(p>0.05)沒有顯著性變化,因此,確定酶解溫度為35 ℃。根據酶反應動力學,溫度對酶的反應是兩面性的:隨著溫度的上升,反應速度增加,直到最大速度為止,高溫時酶反應速度減小,這是酶本身變性所致[13]。該酶的最適溫度是30～45 ℃。

圖10 酶解溫度對枸杞漿出汁率及可溶性固形物的影響Fig.10 Effect of enzymolysis temperature on the Chinese wolfberry pulp juice yield and soluble solids

2.2.4 復合酶酶解時間對枸杞漿出汁率的影響 圖11表明,隨著時間的增加,枸杞漿的出汁率先增大后減少,當達到2.5 h時,出汁率最大,而可溶性固形物的含量(p>0.05),沒有顯著變化,因此,確定酶解時間為2.5 h,這主要是適宜的酶解時間使枸杞漿的出汁率達到了最大。

圖11 酶解時間對枸杞漿出汁率及可溶性固形物的影響Fig.11 Effect of enzymolysis time on Chinese wolfberry pulp juice yield and soluble solids

2.2.5 底物pH對枸杞漿出汁率的影響 圖12表明,隨著pH的增大,枸杞漿出汁率、可溶性固形物先增大后減小,當pH為3.5時,出汁率為最大,而可溶性固形物在pH達到4.5時為最大,由于枸杞漿的自然pH為4.38,因此,確定底物pH為枸杞漿自然pH。

2.2.6 復合酶響應面優化實驗結果 利用Design-expert 8.0.6.1對實驗數據(見表5)進行分析,因子經回歸擬合,得到回歸方程:Y=48.84-0.98A+0.31B+1.32C-0.65AB+0.61AC-0.066BC-3.29A2-2.16B2-1.28C2

決定系數R2為0.9786,表明所選擇的模型很好的擬合了實驗數據。由表6可知,該模型的F=

表6 響應面模型的方差分析

圖12 底物pH對枸杞漿出汁率及可溶性固形物的影響Fig.12 Substrates pH of wolfberry pulp juice yield and the effect of soluble solids

表5 響應面實驗設計及實驗結果

35.49,p<0.0001,表明實驗所采用的二次模型是極顯著的,可以采用回歸模型對響應值(枸杞漿出汁率)進行預測。失擬項p為0.0669不顯著(p>0.05),表明模型是穩定的,能很好的預測實際枸杞漿出汁率的變化。因素A、C、A2、B2、C2(p<0.01)對響應值Y均有極顯著影響,對響應值Y 的交互作用中都表現為不顯著。

2.2.7 復合酶響應面優化分析 由圖13可知,當酶量一定時,枸杞漿的出汁率隨著溫度的變化,先增大后減小。 當酶解溫度一定時,枸杞漿的出汁率隨著酶量的變化,先增大后減小。

圖13 復合酶添加量A與酶解溫度B對枸杞漿出汁率的響應面 Fig.13 Responsive surface of Y=f(A,B)

由圖14可知,當酶量一定時,枸杞漿的出汁率隨著時間的延長,先增大后減小,但其變化的幅度不大。當酶解時間一定時,枸杞漿的出汁率隨著酶量的變化趨勢,先增大后減小。

由圖15可知,當酶解溫度一定時,枸杞漿的出汁率隨著時間的延長,逐漸增大最后趨于穩定,但其變化的幅度不大。當酶解時間一定時,枸杞漿的出汁率隨著酶解溫度的變化趨勢,逐漸增大最后降低。

表7 兩種酶酶解最優條件的比較

圖14 復合酶添加量A與酶解時間C對枸杞漿出汁率的響應面Fig.14 Responsive surfaces of Y=f(A,C)

圖15 酶解溫度B與酶解時間C對枸杞漿出汁率的響應面Fig.15 Responsive surfaces of Y=f(B,C)

根據復合酶酶解枸杞原漿的響應面優化結果得出,復合酶(果膠酶∶纖維素酶=3∶7)添加量0.09%,酶解溫度35.4 ℃,酶解時間2.74 h,枸杞漿的理論出汁率為49.23%。

2.2.8 復合酶最優酶解條件的驗證 在可操作的情況下,復合酶酶解枸杞原漿的最優酶解條件校正為復合酶添加量0.09%,酶解溫度35 ℃,酶解時間2.7 h下,經驗證,得出其最高出汁率為49.20%,與理論值49.23%相接近。

2.3 兩種酶的比較及確定

經實驗驗證后,得出實際值與預測值的相對偏差都在1%以內,說明所得到的模型是可靠且可以應用的模型。對照組枸杞漿的出汁率為43.60%,經過果膠酶處理后,枸杞漿的出汁率為48.75%,比對照組高出了5.15%。經過復合酶處理后,枸杞漿的出汁率為49.20%,比果膠酶處理后,枸杞漿的出汁率高出了0.45%。果膠酶及復合酶都能提高枸杞漿的出汁率,但復合酶比單一果膠酶提高出汁率效果更好。這可能是因為枸杞的細胞壁中含有大量的果膠、纖維素等大分子物質,單一的果膠酶只能降解枸杞漿中的果膠,使枸杞漿的粘度下降,提高出汁率。

而復合酶主要是由果膠酶和纖維素酶組成,除了可以降解果膠,還可以降解纖維素,更進一步的提高了枸杞漿的出汁率,與仇小妹等[14]采用果膠酶和復合酶對于提高藍莓果出汁率的研究結果一致。

3 結論

通過實驗確定果膠酶酶解最優條件為:果膠酶添加量0.016%,溫度41 ℃,酶解時間1.3 h,出汁率為48.75%。復合酶酶解最優條件為:復合酶(果膠酶∶纖維素酶=3∶7)添加量0.09%,酶解溫度35 ℃,酶解時間2.7 h,出汁率為49.20%。復合酶比單一果膠酶提高枸杞漿的出汁率更好,且兩種酶對可溶性固形物含量影響較小。

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Effect of enzymatic hydrolysis on wolfberry fruit juice yield

WANG Ya1,MA Wen-ping1,*,XU Lan-xian1,JIANG Yi-shan2

(1.College of Life Science and Engineering,Beifang University of Nationalities,Yinchuan 750021,China; (2.School of Materials Science and Engineering,Beifang University of Nationalities,Yinchuan 750021,China)

The enzymatic hydrolysis treatment was performed with different enzyme preparations. And the effects of enzyme preparations on juice yield of Chinese wolfberry and soluble solids were obesrved combining with the enzyme amount,reaction temperature,reaction time and pH value of substrates. Through the single-factor experiment and Box-Behnken optimization experiment,the optimum enzymolysis process of Chinese wolfberry pulp was determined:addition amount of pectinase 0.016%,enzymatic hydrolysis temperature 41 ℃,enzymolysis time 1.3 h and juice yield of Chinese wolfberry pulp 48.75%. The optimum condition for the enzymatic hydrolysis of complex enzyme was:addition amount of complex enzyme(pectinase∶cellulase=3∶7)0.09%,enzymatic hydrolysis temperature 35 ℃,enzymolysis time 2.7 h and juice yield of Chinese wolfberry pulp 49.20%. And the two kinds of enzymes had no significantly different effect on soluble solids(p>0.05). The results showed that pectinase and complex enzymes could both improve the juice yield of Chinese wolfberry pulp,however,complex enzyme was better than single pectinase in increasing the juice yield of fresh Chinese wolfberry fruit.

fresh Chinese wolfberry fruit;pectinase;complex enzyme;juice yield;soluble solids

2016-04-11

王婭(1988-),女,碩士研究生,研究方向:現代農業與生態安全,E-mail:wangya201499@163.com。

*通訊作者:馬文平(1966-),男,博士,教授,研究方向:農產品貯藏與加工工程,E-mail:petermana@163.com。

寧夏自然科學基金(NZ12200);北方民族大學國家自然科學基金前期培育項目(2014QZP010);北方民族大學研究生創新項目。

TS255.4

B

1002-0306(2016)22-0227-07

10.13386/j.issn1002-0306.2016.22.036