雙霉菌混合發酵腐乳前發酵條件優化及酶活研究

李 順,顧永忠,鄭 志,陳小舉,吳學鳳,姜紹通,李興江,*

(1.合肥工業大學食品科學與工程學院,農產品精深加工安徽省重點實驗室,安徽合肥 230009;2.安徽八公山豆制品有限公司,安徽壽縣 232200;3.巢湖學院化學化工與生命科學學院,安徽巢湖 238000)

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雙霉菌混合發酵腐乳前發酵條件優化及酶活研究

李 順1,顧永忠2,鄭 志1,陳小舉3,吳學鳳1,姜紹通1,李興江1,*

(1.合肥工業大學食品科學與工程學院,農產品精深加工安徽省重點實驗室,安徽合肥 230009;2.安徽八公山豆制品有限公司,安徽壽縣 232200;3.巢湖學院化學化工與生命科學學院,安徽巢湖 238000)

八公山腐乳前發酵工藝對其總體風味具有重要影響,在總狀毛霉和米根霉單獨發酵腐乳的基礎上,探索總狀毛霉(Mucorracemosus)和米根霉(Rhizopusoryzae)混合發酵腐乳的發酵工藝。在單因素的基礎上,以蛋白酶活力和糖化酶活力為評價指標,選取發酵時間、發酵溫度和混合比例為影響因子,采用響應面法優化總狀毛霉和米根霉混合發酵腐乳的前發酵條件,比較最優條件下混合發酵和總狀毛霉與米根霉單獨發酵的前發酵情況。研究結果表明總狀毛霉和米根霉混合發酵的前發酵條件為:發酵時間56 h、發酵溫度28 ℃、混合比例(總狀毛霉和米根霉)1∶1,此時分泌產蛋白酶活力50.51 U/mL,糖化酶活力為15.15 U/mL。通過對比雙菌和單菌發酵腐乳前發酵情況可知:總狀毛霉和米根霉混合發酵較總狀毛霉更能耐高溫,且在菌絲的生長和酶系的分泌積累較單獨發酵都更有優勢,為后期發酵的一系列生化反應奠定了良好的基礎,有利于改善腐乳的發酵周期,提高腐乳的品質。

腐乳,總狀毛霉,米根霉,混合發酵,前發酵

腐乳是在豆腐的基礎上利用微生物發酵的大豆制品,因其具有良好的感官性能且營養豐富,而深受我國百姓喜愛[1-3]。工業發酵腐乳常用菌為毛霉菌屬和根霉菌屬,少量利用細菌發酵(克東腐乳)[4-5]。我國各地所產的腐乳在口感風味、理化性質、感官性質和功能活性方面各有差異,這可能是由于毛霉菌屬、根霉菌屬以及各種發酵腐乳的微生物在發酵分泌的酶不盡相同[6-7]。腐乳釀造過程中,主要的生化變化就是蛋白酶將豆腐中的蛋白質分解成多肽、氨基酸等小分子化合物并形成風味物質[8-12]。毛霉菌屬分泌蛋白酶量較大,但是不耐高溫;根霉菌屬雖然分泌蛋白酶能力較弱,但是其耐高溫且可以分泌較多的其他糖化酶、脂肪酶等酶系[13-15]。

目前我國腐乳的生產主要利用單一菌種發酵,然而采用單一菌種發酵或自然發酵,存在酶系不全,風味單一等問題[16-17]。本研究主要結合安徽地方特色食品――八公山腐乳,研究總狀毛霉和米根霉混合發酵腐乳的前發酵工藝優化,以期豐富前發酵的酶類,改善理化性質,豐富風味物質的同時優化腐乳的發酵條件和發酵周期,為腐乳的研究和生產提供理論和實踐基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

豆腐 安徽八公山豆制品有限公;總狀毛霉(MucorracemosusCICC 40481) 中國工業微生物菌種保藏中心;米根霉(Rhizopusoryzae) 合肥工業大學農產品加工研究院保藏菌種;福林酚試劑 生物試劑純,上海振企化學試劑有限公司;磷酸氫二鈉 分析純,天津市四友精細化學品公司;氯化鈉、磷酸二氫鈉、干酪素、碳酸鈉、三氯乙酸、乙酸鈉、氫氧化鈉 均為分析純,國藥集團;PDA培養基 實驗室配制。

HH.B11420-BS型電熱恒溫培養 上海躍進醫療器械廠;SWO-CJ-1F超凈工作臺 蘇靜集團泰安公司;721G紫外分光光度計 上海精密科學儀器有限公司;HC-3018R高速冷凍離心機 安徽中科中佳科學儀器公司;手提式壓力蒸汽滅菌器 寧波開普電子儀表有限公司;BST-801放大鏡 貝斯特科技有限公司;B203LD生物顯微鏡 重慶奧特光學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種活化及孢子懸液的制備 將總狀毛霉和米根霉分別接種于PDA斜面,分別置于26 ℃和30 ℃條件下培養5 d,置于4 ℃冰箱保存,使用前向斜面加入20 mL無菌水沖洗,并用接種環刮劃,充分振蕩,用雙層擦鏡紙過濾至三角瓶中,通過血球計數板計數并調節孢子懸液濃度為1×105CFU/mL[18]。孢子懸液現配現用。

1.2.2 腐乳坯的制備 豆腐切塊擺放好,通過高壓噴壺噴灑接種一定比例的總狀毛霉和米根霉混合孢子懸液,接種量每三塊豆腐接種1 mL混合孢子懸液,置于霉菌培養箱中,控制培養箱濕度在80%以上,在一定溫度條件下培養一定時間,制得腐乳坯。

1.2.3 腐乳樣品前處理 將1.2.2中制備的腐乳毛坯充分研磨,準確稱取5 g,加20 mL 0.15 mol/mL的氯化鈉溶液,在40 ℃水浴中加熱不斷攪拌,浸提1.5 h后離心取上清液。

1.2.4 腐乳毛坯感官屬性評價 用放大鏡觀察不同發酵方式發酵的腐乳坯上霉菌生長情況,由8名同課題組同學組成評定小組,對霉菌的密度、菌絲的粗壯程度以及霉菌產孢子量對腐乳坯體上霉菌生長情況進行綜合評分,取其平均數[18-19]。評分標準見表1。

表1 霉菌生長情況評分標準

1.3 測定方法

1.3.1 蛋白酶活力 采用福林酚法測定,40 ℃、pH7.2條件下,1 min水解酪蛋白產1 μg酪氨酸所需要的酶量,定義為1個酶活力單位[20]。

1.3.2 糖化酶活力 采用碘量法測定,40 ℃、pH4.6條件下,1 h水解可溶性淀粉產生1 mg葡萄糖所需的酶量,定義為1個酶活力單位[21]。

1.3.3α-淀粉酶活力 采用3,5-二硝基水楊酸(DNS)法進行測定,在40 ℃、pH5.6條件下,1 min水解淀粉產1 μg麥芽糖所需要的酶量,定義為1個酶活力單位[22]。

1.3.4 脂肪酶活力 采用PVA-橄欖油乳化液水解滴定法進行測定,將在40 ℃、pH7.5條件下,1 min水解底物產生1 μmol可滴定的脂肪酸所需要的酶量,定義為1個酶活力單位[23]。

1.4 前發酵條件優化的單因素實驗

通過對總狀毛霉和米根霉單獨發酵腐乳前發酵條件優化得到二者的接種量均為每三塊豆腐接種1 mL濃度為1×105CFU/mL的孢子懸液。在總狀毛霉和米根霉單獨發酵的基礎上選取發酵時間、發酵溫度、混合菌種比例為單因素考察混合霉菌發酵腐乳的前發酵情況。

1.4.1 發酵時間對前發酵的影響 選取發酵溫度28 ℃,總狀毛霉和米根霉的混合比例1∶1,選取發酵時間分別為50、52、54、56、58、60 h,考察發酵時間對總狀毛霉和米根霉混合發酵的影響。

1.4.2 發酵溫度對前發酵的影響 選取發酵時間56 h,總狀毛霉和米根霉的混合比例1∶1,選取發酵溫度分別為24、26、28、30、32 ℃,考察發酵溫度對總狀毛霉和米根霉混合發酵的影響。

1.4.3 總狀毛霉和米根霉的混合比例對前發酵的影響 選取發酵時間56 h,發酵溫度28 ℃,選取總狀毛霉和米根霉的混合比例分別為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3,考察混合比例對前發酵的影響。

1.4.4 前發酵條件的響應面優化實驗 在單因素實驗結果的基礎上,以前發酵分泌蛋白酶活力和糖化酶活力為響應值,采用Design Expert軟件中的Box Behnken實驗,優化總狀毛霉和米根霉混合發酵的前發酵條件[24-25],響應面設計見表2。

表2 前發酵條件Box-Benhnken設計實驗因素水平及編碼

1.5 數據處理

所有實驗重復三次,應用Origin 9.1軟件作圖,采用Design-Expert V8.0.6處理數據。

2 結果與分析

2.1 前發酵單因素實驗

2.1.1 發酵時間對前發酵蛋白酶及糖化酶活力的影響 考察不同發酵時間對前發酵蛋白酶及糖化酶活力的影響,結果如圖1所示。

圖1 發酵時間對前發酵蛋白酶及糖化酶活力的影響Fig.1 Effect of fermentation time on the pre-fermentation of the protease and glucoamylase

隨著培養時間的增加,霉菌開始生長繁殖,蛋白酶和糖化酶活力呈現先增加后下降的趨勢。發酵時間56 h時蛋白酶和糖化酶的酶活力都達到最大值,酶活力分別為50.67 U/mL和14.21 U/mL。隨著發酵時間的繼續增加,蛋白酶和糖化酶的活力均呈現下降的趨勢。這是由于隨著發酵時間的增加,總狀毛霉和米根霉菌絲出現老化,同時代謝副產物的增加,從而減慢了酶的分泌。因此選擇發酵時間56 h。

2.1.2 發酵溫度對前發酵蛋白酶及糖化酶活力的影響 考察不同發酵溫度對前發酵蛋白酶及糖化酶活力的影響,結果如圖2所示。

圖2 發酵溫度對前發酵蛋白酶及糖化酶活力的影響Fig.2 Effects of fermention temperature on the pr-fermentation of the protease and glucoamylase

發酵溫度過低不利于總狀毛霉和米根霉的菌絲生長從而影響了酶量的分泌,隨著發酵溫度的增加蛋白酶活力和糖化酶活力由于菌種的生長繁殖而逐漸遞增。在28 ℃時兩者都達到一個峰值,隨著溫度的繼續增加蛋白酶活力和米根霉活力都呈現下降的趨勢,可能是因為溫度超過28 ℃后總狀毛霉的生長繁殖會受到抑制,酶活受到影響;溫度過高致使水分散失過快,加快菌絲老化,蛋白酶和糖化酶活力受到影響呈現下降趨勢[26]。由圖2也可以看出在28 ℃之后隨著溫度的增加,蛋白酶活力的降低趨勢明顯大于糖化酶的下降趨勢,這可能是由于總狀毛霉最適發酵溫度比米根霉低,而在發酵過程中總狀毛霉主要產蛋白酶,米根霉主要產糖化酶,所以溫度增加對蛋白酶活力影響要大于糖化酶。

2.1.3 混合比例對前發酵蛋白酶及糖化酶活力的影響 考察總狀毛霉和米根霉混合的比例對前發酵蛋白酶及糖化酶活力的影響,結果如圖3所示。

圖3 混合比例對前發酵蛋白酶及糖化酶活力的影響Fig.3 Effects mix ratio of mould on the pr-fermentation of the protease and glucoamylase

由圖3可知總狀毛霉和米根霉的比例從3∶1～1∶1,發酵分泌糖化酶的活力隨著米根霉的比例增大而逐漸增加;這期間雖然總狀毛霉的比例在降低,然而蛋白酶活力也依然呈現上升的趨勢,一方面米根霉也有不錯的分泌蛋白酶的活力,其次可能是兩者協同作用促進了酶的分泌?？偁蠲购兔赘沟幕旌媳壤?∶1時蛋白酶活力和糖化酶活力均到達峰值。隨著米根霉的比例增加,蛋白酶活力和糖化酶活力都呈現下降的趨勢。

2.2 響應面優化前發酵

表3 前發酵條件響應面設計及結果

2.2.1 回歸模型的建立 以發酵時間(X1)、發酵溫度(X2)和混合比例(X3)為自變量,總狀毛霉和米根霉混合發酵產蛋白酶活力(Y1)和混合發酵產糖化酶活力(Y2)為因變量,建立回歸模型方程分別為:

表4 蛋白酶活力回歸模型方差分析表

式(1)

Y2=-1418.94503+40.75204X1+20.95967X2+4.57278X3-9.37500×10-3X1X2-3.3333×10-3X1X3+0.071667X2X3-0.36237X12-0.36675X22-2.69244X32

式(2)

表5 糖化酶活力回歸模型方差分析

注:**表示差異極顯著(p<0.01);*表示差異顯著(p<0.05)。2.2.3 雙因子效應分析 前期發酵分泌蛋白酶活力的雙因子效應分析:根據回歸方程及回歸模型方差分析表繪出雙因子效應圖見圖4～圖6。

圖4 時間和溫度對蛋白酶活力影響的響應面圖Fig.4 Three-dimensional plot and corresponding contour plot of the effect of time and temperature on activity of protease

圖5 混合比例和時間對蛋白酶活力影響的響應面圖Fig.5 Three-dimensional plot of the effect of mix ratio of mould and time on activity of protease

圖6 混合比例和溫度對蛋白酶活力影響的響應面圖Fig.6 Three-dimensional plot of the effect of mix ratio of mould and temperature on activity of protease

由圖4～圖6所示,兩兩因素之間的影響基本呈拋物線型關系,均有極大點,變化趨勢都是呈現先增大后減小的趨勢;等高線主要說明兩因素之間的交互作用,如果等高線呈圓形說明兩因素之間的交互作用不顯著,等高線呈橢圓或者馬鞍形則說明因素之間交互作用顯著,上圖4～圖6的等高線均呈橢圓形,結果均與模型方差分析一致。

前期發酵分泌糖化酶活力的雙因子效應分析:根據回歸方程及回歸模型方差分析表繪出雙因子效應圖見圖7～圖9。

圖7 時間和溫度對糖化酶活力影響的響應面圖Fig.7 Three-dimensional plot of the effect of time and temperature on activity of glucoamylase

圖8 混合比例和時間對糖化酶活力影響的響應面圖Fig.8 Three-dimensional plot of the effect of mix ratio of mould and time on activity of glucoamylase

圖9 混合比例和溫度對糖化酶活力影響的響應面圖Fig.9 Three-dimensional plot of the effect of mix ratio of mould and temperature on activity of glucoamylase

由圖7～圖9所示,兩兩因素之間的影響基本呈拋物線型關系,均有極大點,變化趨勢都是呈現先增大后減小的趨勢;等高線主要說明兩因素之間的交互作用,如果等高線呈圓形說明兩因素之間的交互作用不顯著,等高線呈橢圓或者馬鞍形則說明因素之間交互作用顯著,圖7、圖9的等高線呈橢圓形,而圖8的等高線則較圓,結果均與模型方差分析一致。

綜上所述,通過結果分析和綜合考慮得到總狀毛霉和米根霉協同發酵腐乳的前發酵最優條件為:發酵時間55.78 h、發酵溫度27.97 ℃、混合比例總狀毛霉和米根霉1.19∶1,此時分泌產蛋白酶活力為50.57 U/mL,糖化酶活力為15.209 U/mL。

2.2.4 驗證實驗 為檢驗實驗結果與真實情況的一致性,對上述最優條件進行驗證實驗。對最優結果進行修正為發酵時間56 h、發酵溫度28 ℃、混合比例總狀毛霉和米根霉1∶1,此條件下進行三次平行實驗,測得蛋白酶活力的平均值為50.51 U/mL,糖化酶活力為15.15 U/mL。

2.3 混合發酵與單獨發酵前發酵比較

前期對總狀毛霉和米根霉單獨發酵腐乳的前發酵條件進行優化,得到的最優條件:總狀毛霉的前發酵條件為發酵時間60 h、發酵溫度24 ℃、接種量為1×105CFU/mL,此時分泌產蛋白酶活力為42.70 U/mL,糖化酶活力為11.62 U/mL;米根霉的前發酵條件為發酵時間50 h、發酵溫度32 ℃、接種量為1×105CFU/mL,此時分泌產蛋白酶活力為33.53 U/mL,糖化酶活力為13.72 U/mL。在此條件下制得腐乳坯,對比總狀毛霉和米根霉混合發酵前期情況與單獨發酵的前發酵情況,包括前發酵腐乳坯的霉菌生長情況即為腐乳坯的感官屬性和前發酵產酶(蛋白酶活力、糖化酶活力、脂肪酶活力和α-淀粉酶活力)的比較,腐乳前發酵的好壞,直接影響到腐乳的品質和風味。

2.3.1 發酵腐乳坯的感官屬性 腐乳坯是腐乳前發酵產物,腐乳的前發酵就是在腐乳上接種微生物(霉菌或者細菌),使微生物在豆腐坯上生長繁殖,菌絲得到充分生長后會在豆腐坯上形成一層堅韌細致的菌膜且能積累大量的酶類,為后期發酵奠定基礎。霉菌的生長情況也直接反應了腐乳坯的品質,用放大鏡觀察霉菌生長情況及孢子量結果見表6,顯微鏡四倍鏡下三種方法發酵腐乳坯霉菌的生長情況見圖10。

圖10 四倍鏡下霉菌的形態Fig.10 Four times times the microscopic mould shape注:(a)為混合霉菌、(b)為米根霉、(c)為總狀毛霉。

霉菌生長情況發酵方式總狀毛霉米根霉混合菌種菌絲密度202030菌絲粗壯度203030孢子量203020

由圖10和表6可知,由于總狀毛霉和米根霉的協同作用混合菌種發酵的腐乳坯上霉菌的菌絲密度要比總狀毛霉和米根霉單獨發酵的密度大;混合菌種發酵和米根霉發酵的腐乳坯的菌絲粗壯度差異不大,比總狀毛霉的更為粗壯;在產孢子量上混合菌種和總狀毛霉發酵的腐乳坯要比米根霉少,更有利于酶的分泌。綜合考慮霉菌的菌絲密度、菌絲粗壯度和產孢子量,混合菌種發酵的腐乳坯體霉菌生長情況更好,有利于分泌和累積酶類。

在相應的最佳前發酵條件發酵產的腐乳坯,總狀毛霉和米根霉混合發酵的腐乳坯上的菌絲生長旺盛,菌絲濃密,并且在腐乳坯上形成一層致密的菌膜,而總狀毛霉和米根霉各自單獨發酵的腐乳坯體上的菌絲較為短小稀疏,不利于腐乳坯體外層菌膜的形成,同時也不利用酶系的累積。協同發酵菌絲生長更有優勢,有利于酶類的積累,為后期發酵的生化反應提供基礎,保證后期發酵腐乳坯體具有完整的塊形和豐富的風味。

2.4 前發酵分泌酶系的比較

在驗證實驗過程中檢測協同發酵腐乳前發酵的蛋白酶活力、糖化酶活力、脂肪酶活力和α-淀粉酶活力。與前期實驗中測得的總狀毛霉和米根霉單獨發酵產腐乳坯的各種酶的活力的比較,如圖11所示。

圖11 混合發酵與單獨發酵分泌酶系比較Fig.11 Comparison of enzyme activity withco-fermentation and separate fermentation

腐乳發酵過程中起主要作用的是蛋白酶,在蛋白酶作用下蛋白質被分解生產多肽和氨基酸,改變腐乳坯的內部結構,并且生產風味物質。由圖11可知,總狀毛霉和米根霉混合發酵腐乳前發酵的蛋白酶活力比二者單獨發酵的要高,且比米根霉要高出很多?；旌习l酵分泌的糖化酶活力、脂肪酶活力和α-淀粉酶活力比總狀毛霉發酵的活力要高。雖然混合發酵分泌的糖化酶活力、脂肪酶活力和α-淀粉酶活力沒有米根霉發酵的酶活力高,但是也具有較高的活力。綜合考慮三種發酵方式前發酵分泌各種酶活力可知,總狀毛霉和米根霉混合發酵分泌的各種酶活都有較高的積累和活力,混合發酵不僅發揮二者單獨發酵的優勢,而且彌補了二者發酵的某些不足,比二者單獨發酵更為全面。為后期發酵過程中的一系列生化反應奠定了良好的基礎。

3 結論

以蛋白酶活力和糖化酶活力為指標,通過單因素和響應面實驗優化總狀毛霉和米根霉混合發酵腐乳的前發酵條件,得到混合發酵腐乳的前發酵最佳條件為:發酵時間56 h、發酵溫度28 ℃、混合比例總狀毛霉和米根霉1∶1,此條件下測得蛋白酶活力為50.51 U/mL,糖化酶活力為15.15 U/mL。

在此條件發酵的腐乳坯與總狀毛霉和米根霉最優條件下單獨發酵的腐乳坯比,混合發酵的腐乳坯上霉菌的菌絲密度和粗壯度要更好一點,同時產孢子量也少,有利于腐乳坯體外層菌膜的形成和酶系的積累,混合發酵分泌的酶系比總狀毛霉和米根霉單獨發酵更為全面豐富。

通過對比三種發酵方式,總狀毛霉和米根霉混合發酵前發酵溫度比總狀毛霉前發酵溫度高,且在菌絲的生長和酶系的分泌積累較單獨發酵都更有優勢。混合發酵腐乳在豐富了酶類積累的同時也提高了發酵的溫度,彌補了單獨發酵不足,也突出了單獨發酵的優勢,為后期發酵的一系列生化反應奠定了良好的基礎,有利于提高腐乳的品質,豐富腐乳的風味。

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Study on the optimization and enzyme activity of co-fermentation sufu pr-fermentation with double moulds

LI Shun1,GU Yong-zhong2,ZHENG Zhi1,CHEN Xiao-ju3,WU Xue-feng1,JIANG Shao-tong1,LI Xing-jiang1,*

(1.Key Laboratory for Agriculture Products Processing of Anhui Province,School of Biotechnology and Food Engineering Hefei University of Technology,Hefei 230009,China; 2.Anhui Bagongshan LTD,Shouxian 232200,China; 3.School of Chemistry and Biology Science Chaohu University,Chaohu 238000,China)

The pre-fermentation of bagongshan sufu had an important influence in the overall nutrition flavor.Based on the single fermentation ofMucorracemosusandRhizopusoryzae,the exploration for its fermentation process surrounding both common strain(MucorracemosusandRhizopusoryzae)was needed. According to the basic fermentation conditions,the fermentation time,fermentation temperature and ratio of strain were investigated through single factor experiment. On the basis of single factor experiment,the activities of protease and glucoamylase were as response value and the prophase fermentation of co-fermentation of sufu byMucorracemosusandRhizopusoryzaewas identifed using response surface methodology. The pr-fermentation was considered by comparing of co-fermentation and separate fermentation. The conditions of the multi-fermentation were found that the fermenting time was 56 h,fermenting temperature was 28 ℃,ratio of strain was 1∶1,and the activity of protease was 50.51 U/mL,the activity of glucoamylase was 15.15 U/mL. Through the comparison of both strains,the result indicated that the enzyme system and sensory attributes of sufu pehtez in co-fermentation was better than separate fermentation,which laid a theoretical foundation for later fermentation,improved the fermented sufu fermentation period and improved the quality of sufu.

sufu;Mucorracemosus;Rhizopusoryzae;co-fermentation;prophase fermentation

2016-04-14

李順(1991-)，男，碩士研究生，研究方向：食品科學，E-mail：lishun@mail.hfut.edu.cn。

*通訊作者:李興江(1978-)，男，博士，副教授，研究方向：發酵工程代謝調控，E-mail：lixingjiang1978@hfut.edu.cn。

國家863計劃項目(2013AA102201)；安徽省重大科技專項(15czz03096)；合肥工業大學應用科技成果培育計劃項目(JZ2016YYPY0041)；國家自然科學基金(31601465/31470002)。

TS214

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1002-0306(2016)22-0205-08

10.13386/j.issn1002-0306.2016.22.032