9種蔬菜發酵體系真核微生物群落結構的分析

燕平梅,荊雪嬌,李艷琴,*,柴 政,喬宏萍,趙文婧,王 琪

(1.太原師范學院生物系,山西太原 030012;2.山西大學生物技術研究所,山西太原 030031)

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9種蔬菜發酵體系真核微生物群落結構的分析

燕平梅1,荊雪嬌2,李艷琴2,*,柴 政1,喬宏萍1,趙文婧1,王 琪2

(1.太原師范學院生物系,山西太原 030012;2.山西大學生物技術研究所,山西太原 030031)

目的:為了探究發酵蔬菜體系中真菌微生物的群落結構。方法:以市售9種發酵蔬菜為對象,提取其中所有微生物宏基因DNA,通過聚合酶鏈式反應結合變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)技術,分離9種發酵蔬菜體系微生物混合真菌18S rDNA V(1-2)區基因片段,采用Quantity One軟件分析真核微生物Shannon-Wiener多樣性指數和9種發酵蔬菜真菌群落結構相似性聚類分析。通過回收DGGE電泳中熒光強度強、不同時間差異的電泳帶,經克隆后測定堿基序列、與GenBank 庫序列對比鑒定。結果:泡菜、榨菜、醬菜和酸菜真核Shannon-Wiener指數差異顯著,其中,泡菜真菌的多樣性指數差異相對最小。四種工藝發酵蔬菜真核微生物相似性為20%,而醬菜與泡菜的相似性較與榨菜的高。同一工藝不同原料發酵蔬菜真核微生物相似性38%。同一工藝袋裝與散裝泡菜真核微生物相似性為51%。堿基序列鑒定結果:所有的測序條帶均為酵母菌,Trichosporonmucoidessp.、Zyqosaccharomycessp.存在于市售9種發酵蔬菜樣品中,且為優勢菌;Candidapalmioleophila存在于泡菜、榨菜、醬菜工藝發酵蔬菜中;Dabaryomycessp.為散裝榨菜中所特有的真菌菌群。結論:實驗結果表明泡菜工藝下制得的發酵蔬菜制品真菌區系相對于榨菜、醬菜和酸菜穩定;加工工藝對發酵蔬菜真核微生物群落的影響較原料、包裝條件的影響顯著;同一工藝條件下原料較包裝的影響顯著。

PCR-DGGE,發酵蔬菜,微生物群落結構,宏基因組學

發酵蔬菜是利用乳酸發酵的一種“冷加工”方法,沒有經過高溫加工,保持了蔬菜的營養、色香味,比烘干、冷凍的菜具有更多優點,成為蔬菜加工保藏的主流產業。蔬菜發酵采用不同工藝可得到泡菜、酸菜、腌制和醬制等多種形式的發酵蔬菜產品。蔬菜的自然發酵是借助于天然附著在蔬菜表面上微生物的作用進行。據施安輝研究報道[1],蔬菜收獲后表面所含的微生物數量大,種類多,其中有細菌、酵母和霉菌等。蔬菜發酵過程微生物群落的種類和數量不斷演替,最終使發酵蔬菜形成特有的風味。其中對風味和品質起主要作用的有乳酸菌、

表1 發酵蔬菜樣品信息表

酵母菌等的微生物[2-10]。前人研究蔬菜發酵體系酵母菌的種類和其隨發酵時間的變化規律是基于傳統微生物學方法[11-16]。但是,現在已培養的微生物可能不到自然界微生物總量的1%[14],大量未培養的微生物在相應生境中存在種類到底有多少,如何發揮功能,傳統微生物學方法已經不能全面解答[15]。宏基因組學的出現和興起擴展了人們對微生物群落的認識。基于宏基因組的微生物多樣性檢測技術如DGGE/TGGE技術[17]、克隆文庫分析法[18-19]和高通量測序技術[20]等被廣泛應用于發酵蔬菜微生物檢測中。其中DGGE/TGGE技術具有一些不可替代的優點能夠更加直觀比較和分析微生物群落結構的變化規律[21]。本研究以基于宏基因組DGGE技術探究蔬菜發酵體系真核微生物群落結構,為闡明蔬菜發酵的機理提供參考數據和方法,同時,為改進蔬菜發酵的工藝提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

9種市售發酵蔬菜 購置于山西省太原市美特好超市,于-4 ℃冰箱保存,詳細信息見表1;凝膠回收試劑盒 購自天根生化科技(北京)有限公司;X-gal、氨芐(Amp) 購自北京全式金生物技術有限公司;PCR引物 由上海生工生物工程公司合成。

DcodeTM凝膠成像系統、TC-96(G)H(b)B PCR儀、Hercules,Calif變性梯度凝膠電泳儀、NanoDrop 2000DNA濃度儀 Bio-Rad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品中菌體的收集 供試樣品為9份市售發酵蔬菜的發酵液。取25 mL發酵液于50 mL的離心管中,2000×g離心10 min;取上清液,10000×g 離心10 min,棄上清,沉淀即為所要收集的菌體。在沉淀中加入1 mL STE 緩沖液(0.1 mol/L NaCl,10 mmol/L Tris-Cl pH8.0,1 mmol/L EDTA pH=8.0),漩渦振蕩混勻,移至1.5 mL 無菌EP管中,10000×g離心3 min,重復洗滌3次。將菌體懸浮于500 μL ddH2O中,用于總DNA的提取。

1.2.2 樣品中微生物總DNA的提取 按照天根生物技術有限公司的DNA提取試劑盒操作步驟提取DNA。

1.2.3 PCR擴增 引物序列NS1:GTAGTCCTA TGCT,Fung-GC:CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCC-GG

CCCGCCGCCCCCGCCCCATTCCCCGTTACCCGTTG[22],NS1/Fung-GC擴增片段理論值分為350 bp。反應程序:94 ℃ 5 min,94 ℃ 30 s,42 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s,72 ℃ 8 min,35循環。PCR產物用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,上樣量3 μL,電泳后4S RedPlus染色,并用凝膠成像系統拍照。

1.2.4 變性梯度凝膠電泳(DGGE) 真菌變性劑梯度為5%～45%。先將緩沖液預熱至60 ℃,上樣3200 ng,200 V恒壓、60 ℃恒溫、1×TAE緩沖液,電泳240 min。染色后的膠置于燈箱上,用滅菌的潔凈刀片割下目的條帶,放入1.5 mL EP管中,用移液槍吸取ddH2O 50 μL,快速沖洗兩次,后用槍頭碾碎,再加入ddH2O 40 μL,-4 ℃過夜。以回收的DNA為模板進行PCR,將所得PCR產物與PMD18-T克隆載體連接、轉化,篩選陽性菌落送去華大基因測序公司測序,且將測序結果經Blast系統比對。

1.2.5 DGGE圖譜分析 DGGE圖譜采用Quantity One軟件對每個發酵蔬菜樣品的電泳條帶的多少、條帶密度進行數字化。進行聚類分析和相似性分析;多樣性指數的計算公式如下[23]:

式中:H為Shannon-Wiener多樣性指數;S為豐度;Ni為樣品DGGE圖譜中第i條帶灰度;N為該樣品所有條帶的總灰度;Pi為第i條帶灰度占該泳道總灰度的比率。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增結果

以總DNA為模板,NS1/Fung-GC引物對進行擴增,產物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。圖1結果表明,7號樣品未擴增出產物,可能是由于其中的真菌較少。其他樣品擴增產物片段清晰、降解少、無非特異性擴增,且長度與理論值350 bp一致,可直接用于后續實驗。

圖1 8種發酵樣品真菌PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 The PCR products of fungus in eight fermented samples by agarose gel electrophoresis 注:1～6、8、9表示的發酵樣品見表1。

2.2 真菌18S rDNA V(1-2)區DGGE圖譜

2.2.1 圖譜分析 由圖2可知,加工工藝、包裝工藝、原料不同的發酵蔬菜樣品具有不同的DGGE圖譜,說明這些因素都影響了發酵蔬菜的真菌菌群群落結構。同時,這些樣品中均含有共同的條帶a,說明不同的樣品間,有著一樣的優勢真菌菌種;同樣遷移率的條帶,亮度不同,如條帶f,說明同一種真菌菌種在不同的樣品內,菌量不同;不同遷移率的條帶,亮度也不盡相同,說明不同的樣品的其優勢真菌菌群的差異。此外,#8號和#9號均為袋裝酸菜,但其原料不同,其條帶差異很大,說明酸菜工藝制得的發酵蔬菜制品,原料對其真菌群落結構影響顯著。

圖2 發酵蔬菜真菌18S rDNA DGGE圖譜Fig.2 The DGGE profile of fungal 18S rDNA from fermented vegetables注:1～9表示見表1;a、b、c、d、e、f、g、h、i、j表示回收測序的電泳條帶。

2.2.2 Shannon-wiener多樣性指數分析 多樣性指數是研究群落物種數和個體數及分布均勻度的綜合指標[24]。8個樣品的真菌多樣性指數如圖3所示,泡菜(1、2、3),榨菜(4、5),醬菜(6),酸菜(8、9)中真菌的多樣性指數具有差異,說明不同的加工工藝對發酵蔬菜制品中真菌多樣性有顯著影響。泡菜工藝(1、2、3號),真菌的多樣性指數差異相對最小,說明泡菜工藝下制得的發酵蔬菜制品真菌區系相對穩定;酸菜工藝(8、9),真菌的多樣性指數差異顯著。

圖3 發酵蔬菜真菌多樣性指數分析Fig.3 Shannon-Wiener analysis ofthe fungus in eight fermented vegetables

2.2.3 聚類分析 由圖4可知,8種發酵蔬菜聚類分析得知聚為5類,三種泡菜(#1、#2、#3)聚為一類,且泡菜#1、#2相似性較低,說明袋裝與散裝泡菜真核微生物相似性不高。榨菜(#4、#5)的聚為一類。酸菜#8、#9雖同為袋裝酸菜,聚類分析為不同類型,聚類相似度很低,而酸菜#8與泡菜聚為一類,酸菜#9為一類,說明酸菜工藝下的不同原料蔬菜的真核微生物相似性很低。四種工藝發酵蔬菜真核微生物相似性為20%,而醬菜與泡菜的相似性較與榨菜的高。同一工藝不同原料發酵蔬菜真核微生物相似性38%。同一工藝袋裝與散裝泡菜真核微生物相似性為51%。總之,不同加工工藝發酵蔬菜真核微生物相似性低,而醬菜與泡菜的相似性較與榨菜的高;同一工藝不同原料發酵蔬菜真核微生物相似性很低。同一工藝袋裝與散裝泡菜真核微生物相似性不高。實驗結果表明加工工藝對發酵蔬菜真核微生物群落的影響較原料、包裝條件的影響顯著;同一工藝條件下原料較包裝的影響顯著。

表2 8種發酵蔬菜的相似性分析(%)

圖4 發酵蔬菜真菌的聚類分析Fig.4 Cluster analysis of fungus in nine fermented vegetables注:#1～#9對應表1的1～9樣品。

注:表格中的1～6、8、9號樣品見表1。2.2.4 相似性系數(CS%)分析 對DGGE圖譜數據化處理得出不同泳道間的相似性系數(表2)。樣品1和#2、#3的相似性系數分別為51.7%、51.3%,樣品#2、#3之間的相似性系數為62%,可知,泡菜樣品#1、#2、#3的相似度最高,說明泡菜工藝下發酵蔬菜真菌群落結構的穩定性高于其他的工藝;榨菜樣品#4、#5的相似性系數為53.1%;酸菜樣品#8、#9的相似性系數為18.1%,可見,酸菜工藝下,發酵蔬菜的真菌群落結構的穩定性最差。和上述多樣性指數、聚類分析結果相吻合。

表3 回收條帶的測序結果的分析比對

2.2.5 測序結果 DGGE電泳后(圖2),對其中10條優勢帶進行切膠回收、克隆,每條帶選陽性克隆子進行測序,并與GeneBank 數據庫比對,結果見表3。結果顯示:所有的測序條帶均為酵母菌,說明發酵蔬菜中優勢真菌為酵母菌。且10條帶中,c、g、h、i、j五條帶鑒定是Trichosporonmucoidessp.(粘性絲孢酵母)的不同菌種,說明Trichosporonmucoidessp.在發酵蔬菜中占優勢。其中,條帶a為Zyqosaccharomycessp.(無對應中文名稱)是所有發酵蔬菜樣品所共有的優勢條帶;條帶b為Basidiomyceteyeastsp.(擔子菌類酵母),是泡菜(1、2、3)和榨菜(4、5)所共有;條帶d 鑒定是Saccharomycessp.(釀酒酵母),是醬菜(6)和酸菜(8)所共有;條帶e為Dabaryomycessp.(德巴利酵母),是#5號散裝榨菜所特有的真菌;條帶f鑒定是Candidasp.,(假絲酵母)是泡菜(2、3)、榨菜(4、5)和醬菜(6)所共有。

3 討論與結論

盡管發酵蔬菜的制作可以追隨到兩千多年前,但是直到20世紀初,人們才將發酵蔬菜和微生物的活動聯系起來。大量學者研究了發酵蔬菜中乳酸菌的多樣性[25-26]。此外,國內外很多學者也對發酵蔬菜中真菌群落結構進行了研究,已經從發酵蔬菜中分離得到了yeast、Saccharomyces、Candida、Pichia等酵母菌。本研究結果可知泡菜、榨菜、醬菜和酸菜真核Shannon-Wiener指數差異顯著,其中,泡菜真菌的香農指數差異相對最小。四種工藝發酵蔬菜真核微生物相似性為20%,而醬菜與泡菜的相似性較與榨菜的高。同一工藝不同原料發酵蔬菜真核微生物相似性38%。同一工藝袋裝與散裝泡菜真核微生物相似性為51%。堿基序列鑒定結果:所有的測序條帶均為酵母菌,Trichosporonmucoidessp.、Zyqosaccharomycessp.存在于市售9種發酵蔬菜樣品中,且為優勢菌;Candida.sp 存在于泡菜、榨菜、醬菜工藝發酵蔬菜中;Dabaryomycessp.為散裝榨菜中所特有的真菌菌群。張先琴[27]對四川地區自然發酵泡菜進行研究,結果表明:也蒙假絲酵母(Meyerozymaguilliermondii)為四川地區自然發酵泡菜中的優勢菌種,幾乎存在于所有的樣品中,此外還有奧默柯達酵母菌(Kodamaeaohmeri),漢遜德巴利酵母(Debaryomyceshansenii),以及曲霉菌(Aspergillus)、熱帶假絲酵母菌(Debaryomyceshansenii)和非培養的真菌(unculturedfungus)。由此可見,Saccharomyces(釀酒酵母)、Candida在蔬菜發酵中廣泛存在。本實驗優勢條帶回收克隆的測序結果表明:在不同的原料,加工工藝及包裝工藝下,真菌的DGGE指紋圖譜均不相同。其中,Trichosporonmucoidessp.在發酵蔬菜中占優勢,Zyqosaccharomycessp.為不同發酵蔬菜共有的優勢菌種,Saccharomycessp.為泡菜和榨菜所共有的優勢菌種。此外,也檢測到了Dabaryomycessp.,與張先琴對自然發酵的泡菜中的測序結果相吻合。

綜合對比市售發酵蔬菜中的真菌,發現不同加工工藝下的市售發酵蔬菜中,真菌的群落豐度相近。而加工工藝對微生物群落結構的穩定性有一定的影響。在泡菜工藝下,真菌的群落結構均最穩定,而酸菜工藝下,真菌的群落結構穩定性均最差。加工工藝對發酵蔬菜真核微生物群落的影響較原料、包裝條件的影響顯著;同一工藝條件下原料較包裝的影響顯著。

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The community structure of eukaryotic microorganisms in nine kinds vegetable fermentation system

YAN Ping-mei1,JING Xue-jiao2,LI Yan-qin2,*,CHAI Zheng1, QIAO Hong-ping1,ZHAO Wen-jing1,WANG Qi2

(1.Department of Biology,Taiyuan Normal University,Taiyuan 030012,China; 2.College of Life Science,Shanxi University,Taiyuan 030031,China)

Objective:In order to explore the community structure of fungus in fermented vegetable system.Methods:The experiment took nine kinds of commercially available fermented vegetables as the research object and extracted macro gene DNA from them. By combining polymerase chain reaction with denaturing gradient gel electrophoresis(DGGE)technology,mixed fungal 18S rDNA V(1-2)gene fragment of nine kinds of vegetable fermentation microbial system were separated and then Shannon Wiener diversity of microbial eukaryotes and similarity cluster analysis of fungi community structures of nine kinds of fermented vegetable were analyzed by Quantity One software. Electrophoresis bands which have strong fluorescence intensity and different time difference in DGGE electrophoresis were recycled and compared with the GenBank sequences after nucleotide sequences by cloning is determined. Results:Shannon-Wiener index of fungus of pickled cabbage,mustard,soy sauce pickles and sauerkraut had significant differences and the Shannon index differences of fungus of pickled vegetables is relatively small. The similarity of eukaryotic microorganism of fermented vegetables under the four process was 20%.Compared with mustard,the similarity of pickled cabbage and soy sauce pickles was high. In the same process,the simwereilarity of eukaryotic microorganism in fermented vegetables with different raw materials was 38%. in the same process and the bulk of the same process was 51%.Base sequence identification results:All the sequencing bands who were yeast.Trichosporonmucoidessp.,Zyqosaccharomycessp were existed in 9 kinds of fermented vegetable samples which were sold in the market and they were dominant fungus.Candidapalmioleophilawas existed in pickled cabbage,mustard,soy sauce pickles.Dabaryomycessp. was endemic fungal flora in bulk mustard.Conclusion:Experimental results showed that fungal flora of the fermented vegetable products under pickle process were relatively stability compared with mustard,soy sauce pickles and sauerkraut. Processing technology of fermented vegetable had an prominant effect on eukaryotic microbial communities compared with the raw material and packing and under the same process conditions,raw materials had an prominant influence on eukaryotic microbial communities compared with packaging.

PCR-DGGE;fermented vegetables;microbial community structure;metagenomics

2016-05-27

燕平梅(1968-), 女，博士, 教授, 主要從事微生物生態學方面的研究，E-mail:yanpingmei1968@163.com。

*通訊作者:李艷琴(1960-),女, 教授, 主要從事微生物生理學方面的研究，E-mail:yanqin@sxu.edu.cn。

國家自然基金項目(31171743);山西省基礎條件平臺項目(2014091003-0107)。

TS255

A

1002-0306(2016)22-0185-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.22.028