雙重DPO-PCR檢測副溶血弧菌和霍亂弧菌

魏 霜,馬新華,汪天杰,龍 陽,紀 強,任 嬌,吳希陽

(1.汕頭出入境檢驗檢疫局,廣東汕頭 515041;2.暨南大學理工學院食品科學與工程系,廣東廣州 510632;3.湛江出入境檢驗檢疫局,廣東湛江 524022;4.廣州出入境檢驗檢疫局,廣東廣州 510632)

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雙重DPO-PCR檢測副溶血弧菌和霍亂弧菌

魏 霜1,2,馬新華3,汪天杰4,龍 陽3,紀 強1,任 嬌1,吳希陽2,*

(1.汕頭出入境檢驗檢疫局,廣東汕頭 515041;2.暨南大學理工學院食品科學與工程系,廣東廣州 510632;3.湛江出入境檢驗檢疫局,廣東湛江 524022;4.廣州出入境檢驗檢疫局,廣東廣州 510632)

根據副溶血弧菌collagenase基因和霍亂弧菌ompW基因,分別設計特異性DPO(dual priming oligonucleotide)引物,建立一種快速檢測這兩種弧菌的多重DPO-PCR方法,并對其特異性和靈敏度進行了評價。結果顯示,設計的DPO引物特異性較強,副溶血弧菌和霍亂弧菌DNA可分別擴增出307 bp與463 bp的特異性條帶,檢測靈敏度均達0.1 ng/μL。該檢測方法對退火溫度不敏感。利用該方法對69株疑似弧菌菌株進行鑒定,結果與生理生化鑒定結果一致。該方法特異性強、靈敏度高,適合于對食品、水產品等中副溶血弧菌和霍亂弧菌的進行快速篩檢。

副溶血弧菌,霍亂弧菌,多重DPO-PCR

傳統檢測方法特異性差、靈敏度低并且耗時長、操作繁瑣、滿足不了快速檢測的需求。PCR技術具有快速、特異性強和靈敏度高等特點,是目前食源性致病菌檢測主要采用的檢測技術之一[10]。在此基礎上,DNA探針技術[11]、普通多重PCR(Multiplex PCR)[12]、多重熒光定量PCR(Multiplex real-time PCR)[13]、PCR結合變性高效液相色譜(DHPLC)[14]等檢測方法也已建立起來,但是這些方法有些對引物設計的要求很高,而且需要優化退火溫度,有些則需依賴較昂貴的儀器設備,難以在實驗室推廣。因此,尋求一種能快速、靈敏、特異的同時檢測這兩種病原菌的技術十分重要。

表1 引物序列

由于多重PCR可同時檢測多種致病菌,在提高檢測效率的同時又能降低檢測成本,因此被廣泛應用于食品、水產品等產品中的多種食源性致病菌檢測。但傳統的多重PCR體系中,由于多對引物之間存在干擾、各引物的退火溫度存在差異、引物與模板的錯配,容易造成靈敏度下降與非特異性擴增等問題,限制了多重PCR技術的應用。

近年來研究發現一種新型PCR引物設計方法,即雙啟動寡核苷酸引物(dual-priming oligonucleotide,DPO)[15]。DPO引物技術的主要原理為其引物包含兩個獨立的區域,5′端序列由18～25個堿基組成,3′端序列由6～12個堿基用來引導PCR反應的特異性延伸,這兩段獨立的特異性區域利用寡聚次黃嘌呤(Inosine,I)進行連接,由于次黃嘌呤的退火溫度低,在退火時寡聚次黃嘌呤形成類似泡狀的結構,從而使5′和3′區域形成兩個獨立功能的雙特異性引物結構,研究表明5′和3′引物區域中任何有3個及以上堿基的錯配,PCR反應將不能進行,而且因為其構造的特殊性,引物自身以及引物之間能夠生成的二級結構較少,并且對于退火溫度具有不敏感的特性。該技術的優點主要在于它對退火溫度等影響普通多重PCR的關鍵因素不敏感,適用范圍廣[16],而且該技術特異性強,擴增效率高,為多重PCR技術的應用提供了新的前景。目前該技術已經廣泛應用于病原菌檢測中,據報道DPO-PCR技術已建立了創傷弧菌[17]、產腸毒素大腸桿菌[18]、腸出血性大腸桿菌O157∶H7[19]、志賀氏菌[20]等的檢測方法。本研究旨在建立一種多重DPO-PCR方法來同時檢測副溶血弧菌和霍亂弧菌,為口岸實驗室快速鑒定這兩種病原菌提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

河流弧菌(Vibriofluvialis)、擬態弧菌(V.mimicus)、鰻弧菌(V.anguillarum)、哈維氏弧菌(V.harveyi)、梅氏弧菌(V.metschnikovi) 保存于汕頭出入境檢驗檢疫局;副溶血弧菌(V.parahaemolyticus,ATCC17802)、溶藻弧菌(V.alginolyticus,ATCC17749)、霍亂弧菌(V.cholerae,ATCC14035)、創傷弧菌(V.vulnificus,ATCC27562)、大腸桿菌(Escherichiacoli,ATCC8739)、單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes,ATCC19111)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,ATCC43300) 保存于暨南大學食品科學與工程系;2012年6月,采集3個湖泊水樣(暨南大學石牌校區明湖)、9個水產養殖水樣和9個貝殼類水產品(石牌市場) 共計21個樣本;胰蛋白胨大豆肉湯(Tryptic Soy Broth,TSB)培養基、腦心浸液(Brian Heart Infusion,BHI)液體培養基、硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂(Thiosulfate citrate bile salts sucrose agar culture medium,TCBS)培養基 美國BD公司;DNA提取試劑盒、細菌基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技(北京)有限公司;多重PCR反應試劑盒(Multiplex PCR Assay Kit) TaKaRa公司;DNA Marker DL2000,大連寶生物公司;PCR引物 生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

Veriti96 PCR擴增儀 美國ABI公司;ND-1000微量紫外分光光度計 Nano Drop公司;600SI電泳儀 上海博彩生物科技有限公司;GBOX-F3凝膠成像系統 GENE公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA的提取 挑取上述弧菌單菌落,接種于3% NaCl的胰蛋白胨大豆肉湯培養基中;挑取上述非弧菌單菌落,接種于腦心浸液液體培養基中,37 ℃下振蕩培養過夜。參照DNA提取試劑盒說明操作,分別提取1.1中12種菌株的基因組DNA。提取后取1 μL基因組DNA樣品用微量紫外分光光度計測定基因組DNA的濃度和純度,并保存于-20 ℃待用。

教師一句評價性鼓勵的話，調整了課堂探究氣氛，成為了孩子學習的新動力，使他在原有基礎上不斷進步，用自己的勤奮創造一片屬于自己的真正舞臺。

1.2.2 引物設計 參考DPO引物設計方法和要求[16],根據副溶血弧菌collagenase基因序列和霍亂弧菌ompW基因序列,設計檢測副溶血弧菌和霍亂弧菌的多重DPO-PCR引物組合(引物序列中的I為次黃嘌呤)(表1)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.3 雙重DPO-PCR體系 參考多重PCR反應試劑盒說明書的反應體系,Mix 2溶液25 μL、Mix 1溶液0.25 μL、各引物終濃度均為0.4 μmol/L、DNA模板1.0 μL,ddH2O調節最終體積至50 μL。反應條件為94 ℃ 1 min;94 ℃ 30 s,60 ℃ 90 s,72 ℃ 90 s,40個循環;72 ℃ 10 min。PCR擴增產物經2.0%瓊脂糖電泳后,用凝膠成像系統觀察并拍照。

1.2.4 雙重DPO-PCR體系退火溫度敏感性實驗 按照1.2.3多重DPO-PCR反應體系,將反應條件中的退火溫度范圍設定為45～65 ℃,5 ℃為1個梯度共五個梯度,以副溶血弧菌和霍亂弧菌的基因組DNA混合物為模板進行退火溫度敏感性實驗,產物經2.0%瓊脂糖凝膠電泳觀察結果,討論不同退火溫度下多重DPO-PCR體系的穩定性。

1.2.5 雙重DPO-PCR體系的特異性評價 按照1.2.3多重DPO-PCR反應體系,以1.2.1中提取的12個供試菌株的基因組DNA為模板,同時以水為模板做陰性對照,以副溶血弧菌和霍亂弧菌的基因組DNA混合物為模板做陽性對照,對所建立的雙重DPO-PCR反應體系的特異性進行評價。

1.2.6 雙重DPO-PCR體系的靈敏度評價 按照1.2.1方法分別提取副溶血弧菌和霍亂弧菌的基因組DNA。用生物學分光光度計標定濃度為100 ng/μL,再按10倍梯度稀釋為10、1、0.1、0.01、0.001 ng/μL的模板濃度,共六個模板濃度,分別取1 μL作為模板進行靈敏度實驗。

1.2.7 雙重DPO-PCR體系檢測實際樣品 采集9個養殖水樣、3個湖泊水樣品、9個貝殼樣品共計21個樣本,將樣品接種于3% NaCl堿性蛋白胨水中,培養8 h后在TCBS培養基上劃線分離得到疑似弧菌單菌落,并挑取該單菌落接種于含3% NaCl的TSB培養基中,按照1.2.1的方法來提取基因組DNA,然后利用已建立的多重DPO-PCR體系來鑒定分離得到的疑似弧菌菌株,同時對該菌株進行API生理生化實驗[21],將兩種方法得到的結果進行比較分析。

2 結果與分析

2.1 兩種弧菌的雙重DPO-PCR檢測方法建立

調整了雙重DPO-PCR體系中引物濃度,確定引物終濃度均為0.2 μmol/L,建立了副溶血弧菌和霍亂弧菌的雙重DPO-PCR檢測方法,結果如圖1所示,雙重DPO-PCR檢測結果與單重DPO-PCR檢測結果一致,則瓊脂糖凝膠電泳檢測在307 bp和463 bp處有特異性條帶。

圖1 雙重DPO-PCR和單重DPO-PCR的結果Fig.1 Results of the multiplex DPO-PCR and single DPO-PCR注:M:Marker DL 2000;1:陰性對照;2:副溶血弧菌、霍亂弧菌;3:副溶血弧菌;4:霍亂弧菌。

2.2 雙重DPO-PCR退火溫度敏感性實驗

由圖2可知,在本研究DPO-PCR退火溫度敏感性實驗中,退火溫度設定在45～65 ℃五個梯度,利用雙重DPO-PCR檢測體系均能高效擴增出目的基因即副溶血弧菌、霍亂弧菌,不同退火溫度點對擴增結果影響不明顯,表明所建立的雙重DPO-PCR檢測方法退火溫度范圍較寬并且對退火溫度不敏感,彌補了常規雙重PCR擴增結果易受退火溫度變化的影響較大、擴增效果較差的缺陷。

圖2 雙重DPO-PCR退火溫度敏感性實驗Fig.2 Tm Sensitivity test of the multiplex DPO-PCR注:M:Marker DL 2000;1～5:退火溫度依次為45、50、55、60、65 ℃。

2.3 雙重DPO-PCR體系的特異性評價

DPO引物poly I的氫鍵結合力弱,擴增過程中,若DPO引物的5′或3′端有3個以上堿基發生錯配,引物就會與模板脫離,從而不能正常發生反應,這大大增強了引物的特異性;同時DPO引物自身及引物間難形成二級結構[16]。本實驗以副溶血弧菌collagenase基因和霍亂弧菌外膜蛋白ompW為靶基因建立的雙重DPO-PCR檢測方法對12種供試菌株DNA檢測結果見圖3,結果顯示以副溶血弧菌和霍亂弧菌的基因組DNA混合物為模板的陽性對照、副溶血弧菌基因組DNA為模板及霍亂弧菌基因組DNA為模板的樣品中順利檢出副溶血弧菌和霍亂弧菌特異性條帶,而其它10種非目標菌及陰性對照均未出現目的條帶,證明該方法能夠準確地擴增出目標菌,且與其他菌株無交叉反應及非特異性擴增,表明所建立的雙重DPO-PCR檢測方法特異性強。

圖3 多重DPO-PCR特異性實驗Fig.3 Specificity test of the multiplex DPO-PCR注:M:Marker DL 2000;1:陰性對照;2:副溶血弧菌、霍亂弧菌;3:副溶血弧菌;4:霍亂弧菌;5:溶藻弧菌;6:創傷弧菌;7:擬態弧菌;8:梅氏弧菌;9:河流弧菌;10:哈維氏弧菌;11:鰻弧菌;12:大腸桿菌;13:金黃色葡萄球菌;14:單增李斯特菌。

2.4 雙重DPO-PCR體系的靈敏度評價

靈敏度評價實驗結果見圖4,DNA模板含量在100、10、1、0.1 ng/μL時均可擴增出2條目的條帶,且呈依次減弱,當模板量降到0.1 ng/μL以下時未能擴增到目的條帶。檢測體系對混合模板中副溶血弧菌和霍亂弧菌的DNA靈敏度較高,能大大增強該技術在不同實驗室的可推廣性。

圖4 靈敏度實驗Fig.4 Sensitivity test of the multiplex DPO-PCR 注:M:Marker DL 2000;1～6:2種病原菌DNA模板量從左到右依次為100、10、1、0.1、0.01、0.001 ng/μL。

2.5 雙重DPO-PCR體系對實際樣品的檢測

1.2.7中的21個樣品共分離到69個疑似弧菌菌落,其中有27個綠色菌落、42個黃色菌落。 API生理生化鑒定結果顯示,24個綠色菌落為副溶血弧菌(V.parahaemolyticus),22個黃色菌落為溶藻弧菌(V.alginolyticus),1個黃色菌落為創傷弧菌(V.vulnificus),并沒有分離到霍亂弧菌(V.cholerae)[21]。利用建立好的多重DPO-PCR體系對上述69個疑似弧菌菌落進行PCR鑒定,結果與前期的API生理生化實驗結果一致。

3 結論

建立了兩種病原弧菌副溶血弧菌和霍亂弧菌的雙重DPO-PCR檢測方法,該方法具有特異性強、靈敏度高、適用范圍廣的優點,適用于食品中這2種病原弧菌的快速篩檢,具有較強的實用價值。同時今后還可以將多重DPO-PCR檢測技術應用到更多的致病菌檢測上,以更好的保障食品、水產品的安全,特別是對沿海地區,更能夠有效的降低微生物中毒的發生。

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Multiplex DPO-PCR for the detection ofVibrioparahaemolyticusandVibriocholerae

WEI Shuang1,2,MA Xin-hua3,WANG Tian-jie4,LONG Yang3,JI Qiang1,REN Jiao1,WU Xi-yang2,*

(1.Shantou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Shantou 515041,China; 2.Department of Food Science and Engineering,Jinan University,Guangzhou 510632,China; 3.Zhanjiang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Zhanjiang 524022,China; 4.Guangzhou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Guangzhou 510623,China)

Based on collagenase gene sequences ofVibrioparahaemolyticusand ompW gene sequences ofV.cholerae,designed two pairs of DPO(dual priming oligonucleotide)primers. A multiplex DPO-PCR method had been developed for the detection ofV.parahaemolyticusandV.choleraesimultaneously. The specificity and sensitivity of the method had been tested. The result showed that the DPO primers were of high specificity. Amplified fragments 307 bp forV.parahaemolyticusand 463 bp forV.choleraewere obtained,the sensitivity of the method was 0.1 ng/μL forV.parahaemolyticusandV.cholerae. The multiplex DPO-PCR was not sensitive to the annealing temperature. The multiplex DPO-PCR was validated with 69 suspicious vibrio strains and the results was consistent with physiological and biochemical experiments. The multiplex DPO-PCR method proved to be strong specificity,high sensitivity. This method was suitable for the detection ofV.parahaemolyticusandV.cholerain food,aquatic products,etc.

Vibrioparahaemolyticus;Vibriocholerae;multiplex DPO-PCR

2016-05-27

魏霜(1988-),男,碩士,農藝師,研究方向:病原微生物檢測,E-mail:weishuang2008@hotmail.com。

*通訊作者:吳希陽(1966-),男,博士,教授,研究方向:病原微生物檢測,E-mail:tkentwu@jnu.edu.cn。

湛江市科技計劃項目(2014C01007);廣東出入境檢驗檢疫局科技計劃項目(2015GDK27);廣東省科技計劃項目-國際科技合作領域(2015A050502030)。

TS201.7

A

1002-0306(2016)22-0080-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.22.007