改進的QuEChERS結合RPLC-TMS測定水產品中生物胺的研究

蔣林蓉,徐志偉,曾 敏,黃杰英,徐 莉,符傳軍,龐道標,李實飛

(海南出入境檢驗檢疫局,海南海口 570311)

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改進的QuEChERS結合RPLC-TMS測定水產品中生物胺的研究

蔣林蓉,徐志偉,曾 敏,黃杰英,徐 莉,符傳軍,龐道標,李實飛

(海南出入境檢驗檢疫局,海南海口 570311)

采用改進的QuEChERS方法,利用液相色譜-串聯質譜(RPLC-TMS)檢測,建立了幾種水產品中生物胺的分析方法。樣品用乙腈+甲醇(9+1)提取,無水硫酸鈉除去水分,經乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)和C18混合粉末凈化,采用HILIC柱,以乙腈/1%甲酸水溶液為流動相梯度洗脫進行液相色譜分離。質譜分析采用電噴霧正離子電離,多反應監測模式,外標法定量。結果顯示6種生物胺在10～200 ng/mL范圍線性關系良好。方法的定量限(LOQ,信噪比為10)為0.10 mg/kg。加標水平在0.10 mg/kg時,魚、蝦、蟹及魷魚四種陰性基質中加標的回收率在74.18%～90.15%之間,相對標準偏差(RSD,n=6)在2.22%～8.04%之間。結果表明本方法簡便、快速、安全、適用于水產品中生物胺含量的定性和定量檢測。

QuEChERS,液相色譜-串聯質譜,生物胺,水產品,檢測

生物胺是廣泛存在于生物體及多種食品中的一類低分子量含氮有機化合物,根據分子結構的不同,生物胺可分為脂肪族(尸胺、腐胺、精胺、亞精胺、胍丁胺等)、芳香族(酪胺、苯甲胺、苯乙胺等)和雜環類(組胺、色胺、5-羥色胺等)[1]。根據其結構組成中所含氨基(NH2-)的不同,還可以分為一元胺(組胺、色胺)和二元胺(如腐胺和尸胺)。大部分生物胺是氨基酸通過脫羧酶類催化脫羧形成的,也有部分是通過醛或酮的胺化和轉胺作用形成的[1]。

水產品富含蛋白質,在加工和貯藏過程中會產生多肽和氨基酸,這些小分子物質容易進一步轉化為生物胺。如鮐、鰹以及鯖魚、鯡魚、沙丁魚、秋刀魚、金槍魚和竹魚等,當魚體不新鮮時可產生大量的生物胺(組胺、腐胺、尸胺、酪胺、精胺和亞精胺)[2]。

生物胺是激素、生物堿、核酸和蛋白質合成的前體物質,同時在人和動物的生物神經系統、循環系統、呼吸系統和消化系統、免疫系統及代謝過程的活性細胞中發揮著重要的生理作用[3]。適量的生物胺對人體健康是有益的,但在動物和人體內積聚達到一定量時就具有毒性[1]。我國規定鮐魚類中組胺的限量標準為1000 mg/kg,其它海產魚類為300 mg/kg(GB 2733-2005)。

生物胺分子中缺少發色基團,本身既無紫外吸收又無熒光及電化學活性,使得各類生物胺的分離及測定都比較困難。文獻報道的測定生物胺的方法主要有薄層色譜法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GC)、離子色譜法,毛細管電泳法(CE)等。已報道的HPLC法需要柱前或柱后衍生,操作繁瑣且衍生條件苛刻,衍生產物不穩定,陽性樣品無法確證,不適用于日常批量檢測。QuEChERS(快速、簡單、便宜、高效、可靠和安全)方法由Anastassiades等[4]于2003年提出。該方法具有快速、簡單、便宜、高效、可靠和安全等特點,廣泛應用于農藥和獸藥殘留檢測中樣品的凈化[5]。本研究采取改良的QuEChERS前處理方法,應用高效液相色譜-串聯質譜同時檢測6種生物胺含量。方法具有無需衍生、凈化步驟簡單、快速高效、靈敏度高等特點,為水產品質量安全監控提供了新的檢測技術選擇。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

尸胺鹽酸鹽(Cadaverine dihydrochloride,C5H14N2·2HCl)標準品、組胺鹽酸鹽(Histamine dihydrochloride,C5H9N3·2HCl)標準品、腐胺鹽酸鹽(Putrescine dihydrochloride,C4H12N2·2HCl)標準品、酪胺鹽酸鹽(Tyramine hydrochloride,C8H11NO·HCl)標準品、2-苯乙胺(2-Phenylethylamine,C8H11N)標準品 均購于Dr公司(純度均>97.5%);色胺(Tryptamine,C10H12N2)標準品 購于TRC公司(純度>95.0%);甲醇、乙腈(色譜純) TEDIA公司;甲酸(色譜純) MREDA公司；其他試劑 均為分析純;實驗用水 為一級水。

API-4000QTRAP質譜儀 美國AB公司;Agilent 1200液相色譜儀 美國安捷倫公司;320R離心機 德國Hettich公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準儲備液的配制 6種生物胺標準儲備液:分別稱取6種生物胺標準品適量(精確到0.1 mg)于10 mL棕色容量瓶中,用適量水溶解并定容,得1 mg/mL標準儲備液,于4 ℃避光保存,可使用6個月。

1.2.2 樣品前處理 提取:稱取2 g水產品樣品(精確到0.001 g),置于離心管中,加入20.00 mL提取液(乙腈+甲醇(9+1)),渦旋混勻,加入無水硫酸鈉5 g,渦旋混勻,4 ℃下以11000 r/min離心5 min,移取2 mL上清液供凈化。

凈化:移取2 mL上清液于加有100 mg PSA吸附劑和100 mg C18吸附劑的玻璃試管中,渦旋混勻1 min,4 ℃下以4000 r/min離心5 min,上清液過0.22 μm微孔濾膜,供液相色譜-串聯質譜儀分析。

1.2.3 儀器條件 色譜條件:Waters HILIC柱50 mm×2.1 mm,1.7 μm;流動相:乙腈-1%甲酸水溶液,梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫條件

質譜條件:掃描方式:電噴霧正離子(ESI+)掃描;檢測方式:多反應監測(MRM);輔助加熱氣:N2。氣簾氣壓力(CUR):30.00 psi(N2);碰撞氣壓力(CAD):5.0 psi(N2);電噴霧電壓(IS):5500 V;離子源溫度(TEM):600 ℃;霧化氣壓力:55.00 psi(N2);輔助氣壓力:55.00 psi(N2);6種生物胺的定性離子對、定量離子等具體參數見表2。

表2 多反應監測掃描模式的質譜參數

注:*為定量離子。

1.3 數據處理

用乙腈/甲醇(9/1)溶液將標準儲備液稀釋得到不同濃度的混合標準工作溶液,按1.2.3所述方法測定。采用Analyst@1.5.3軟件進行數據處理,以質量濃度為橫坐標,定量離子對的峰面積為縱坐標建立標準曲線,外標法定量。

2 結果與分析

2.1 質譜條件的確立

墨西哥竹子的利用可追溯到數千年前，其資源豐富且易于收獲。在墨西哥溫暖潮濕的氣候條件下，竹屋或竹制庇護所方便建造且能夠提供良好的居住環境，在整體特性上優于木屋(圖7)。然而，在15世紀隨著西班牙人的到來，新的建筑施工技術隨之而來，殖民地建筑不僅在墨西哥而且在所有美洲國家大量使用。盡管竹子已經使用了數千年，但歐洲征服者認為竹材是次要材料或窮人的材料，而是采用其他建筑材料建設殖民地的基礎設施。但是，土著居民仍然保持著利用竹子的傳統。墨西哥竹利用發展的停滯與過去500年來歐洲人對土著居民的社會壓制直接相關。

圖1 幾種生物胺的二級質譜圖Fig.1 Two stage mass spectrometry of biogenic amines

在電噴霧正離子方式下對幾種生物胺進行一級質譜分析(Q1掃描),得到分子離子,即母離子;對被測物的分子離子碰撞后,進行二級質譜分析,得到子離子質譜圖,優化了碰撞能量。此外,還對離子源溫度、脫溶劑氣溫度、脫溶劑氣流量、錐孔反吹氣流量等參數進行了優化。圖1為幾種生物胺的二級質譜圖。圖2為幾種生物胺標準品多反應監測(MRM)色譜圖。

圖2 幾種生物胺的標準品多反應監測(MRM)色譜圖(10 ng/mL)Fig.2 Chromatograms of biogenic amines standard in MRM mode(10 ng/mL)

液相色譜-串聯質譜分析結果表明,MRM模式中6種生物胺標準品的保留時間在4.49～7.33 min之間,溶劑峰干擾小,15 min內可完成對單個樣品6種生物胺的定性和定量分析,適用于生物胺的日常檢測。

2.2 提取溶劑的選擇

有研究者認為生物胺檢測分析中存在兩個瓶頸:一是樣品基質的復雜性,二是樣品中生物胺實際濃度較低[6]。提取溶劑的選擇會直接影響分析方法的回收率。崔曉美等[7]利用乙腈-乙酸胺溶液提取,親水作用色譜法-串聯質譜法測定鰹魚中5種生物胺含量,在5～200 μg/mL范圍內線性關系良好。孫亞軍等[8]選取1%三氯乙酸(TCA)提取,HPLC-MS/MS測定蝦仁中8種生物胺,該方法沒有樣品的凈化過程,在大批量日常分析時可能會導致質譜中污染物殘留而使質譜響應降低。

本實驗分別使用乙腈、甲醇、水、1%甲酸乙腈、1%甲酸甲醇、乙腈+甲醇和乙腈+甲醇+甲酸進行提取。提取后的上清液經QuEChERS凈化后通過RPLC-TMS檢測。結果表明:采用純乙腈進行提取,腐胺、尸胺等小分子二元胺,在PSA上有明顯吸附,回收率過低;使用純甲醇或含水溶劑提取,由于其強氫鍵作用,生物胺不會在PSA上吸附,但是許多雜質也不能在PSA上吸附,達不到凈化效果;最終選取乙腈+甲醇為提取溶劑,不僅能夠去除樣品中的大部分雜質,還能獲得較高的回收率。

進一步優化提取時乙腈/甲醇的比例,分別使用不同比例的乙腈+甲醇(95/5、9/1、1/1、1/9、5/95)溶劑進行實驗。結果表明,隨著提取溶劑中甲醇組分的提高,腐胺和尸胺的回收率迅速升高;但甲醇含量過高時,雜質含量也上升,樣品的基質效應不斷增強,影響分析的準確性。在甲醇含量為5%時,腐胺的回收率約為50%,尸胺回收率約為70%,其余生物胺回收率均大于80%;在甲醇含量為10%時,各生物胺回收率均可達到分析要求;在甲醇含量達到20%時,色胺開始出現明顯的基質效應。綜合以上實驗結果,最終選擇乙腈/甲醇(9/1)為提取溶劑。

2.3 凈化條件的優化

Calbiani等[9]在軟奶酪樣品中生物胺的HPLC-MS/MS測定方法中,使用C18和腈基(CN)吸附劑,分別采用固相萃取小柱(SPE)和基質固相分散(MSPD)兩種凈化方法。結果發現MSPD凈化法回收率更高。本研究嘗試了強陽離子交換柱(MCX)、C18固相萃取柱、腈基基質固相分散萃取等凈化方法。結果發現陰性基質中的樣品加標的回收率過低，達不到分析要求。

QuEChERS方法將適量的凈化劑直接作用于提取液中,盡可能多的吸附雜質的同時保留目標物,和普通的SPE相比少了淋洗、洗脫等步驟,相對普通SPE方法更為快捷和簡便。乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)吸附劑能夠清除許多極性干擾成分,如脂肪酸、親脂性色素和糖類等,但去除甾醇效果一般;C18吸附劑去除膽固醇、甾醇、色素的效果較好[10]。本研究選擇在提取時采用改良的QuEChERS方法,使用無水硫酸鈉除去水分,同時使用PSA和C18混合吸附劑,有效去除乙腈+甲醇提取液中的干擾雜質,具有良好的凈化效果。

2.4 液相色譜柱和流動相的選擇

生物胺屬于小分子量的極性氨基酸,在反相色譜柱中不易保留。本研究嘗試選擇反相C18柱進行分離檢測,實驗發現6種生物胺的峰形較好,但有3種生物胺出峰時間均小于1 min,即使調節流動相組成和使用梯度洗脫保留時間也沒有明顯改善。丁濤等[11]利用C18柱,在流動相中加入0.1%七氟丁酸增大生物胺在反相色譜柱上的保留,結合高分辨質譜法分析葡萄酒中8種生物胺。七氟丁酸是離子對試劑,本研究前期實驗發現流動相中的七氟丁酸組分雖然可以改善C18柱中幾種生物胺的分離效果,但會對色譜柱填料造成不可修復的損傷,且會在質譜中長期吸附,導致其負離子模式響應大幅度降低。

HILIC色譜柱通過采用強極性固定相,并且結合高比例有機相∕低比例水相組成的流動相,能為強極性樣品提供合適的保留時間[12]。吳云輝等[13]利用HILIC色譜柱,以5 mmol/L的乙酸銨溶液和甲醇為流動相對8種生物胺進行液相色譜-串聯質譜分析,8種生物胺的出峰時間均小于1 min,容易有溶劑峰的干擾,影響測定方法的準確度。本實驗選擇HILIC色譜柱進行生物胺的色譜分離。結果表明,優化后的梯度洗脫條件(見表1),可較好地檢測6種生物胺。

圖3 魚肉陰性樣品加標的多反應監測(MRM)色譜圖(10 ng/mL)Fig.3 Chromatograms of biogenic amines spiked in a negative fish sample(10 ng/mL)

在使用HILIC柱進行色譜分離時對流動相進一步優化,用乙腈/0.1%甲酸水(7/3)等度洗脫時,腐胺、尸胺、組胺峰形較好,但酪胺、2-苯乙胺、色胺在色譜柱上基本無保留;用乙腈/水或乙腈/0.1%甲酸水梯度洗脫時腐胺、尸胺、組胺色譜峰過寬,拖尾嚴重。采用乙腈/1%甲酸水梯度洗脫時,6種生物胺的峰形、保留時間和響應值均較好。因此本研究選擇HILIC柱進行分離,使用乙腈/1%甲酸水流動相梯度洗脫,可兼顧幾種生物胺的質譜響應及色譜保留效果。

2.5 方法的線性關系及檢出限

參照標準溶液配制成10～200 ng/mL的標準工作液,以質量濃度為橫坐標,定量離子對的峰面積為縱坐標建立標準曲線,6種化合物在相應的質量濃度范圍內線性關系良好,線性相關系數(r)均大于0.99。

表4 不同基質中生物胺的加標平均回收率與相對標準偏差(n=6)

方法,使用PSA和C18混合吸附劑凈化除去雜質,結合RPLC-TMS分析,可實現水產品中6種生物胺的定量檢測與確證。該方法凈化效果好,準確度、精密度、定量限滿足測定要求。可用于水產品中生物胺的快速篩查和定量分析。

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以10倍信噪比(S/N=10)所對應濃度作為方法定量限(LOQ),6種生物胺的定量限為0.10 mg/kg,線性實驗結果和檢出限見表3。

表3 6種生物胺的線性實驗結果

2.6 方法的準確度和精密度

以魚、蝦、蟹和魷魚為代表基質進行了添加回收實驗,添加水平為0.1 mg/kg,每個濃度設定6個重復實驗。魚肉陰性樣品加標的多反應監測(MRM)色譜圖見圖3。6種生物胺在不同基質中的添加回收率及精密度見表4。幾種生物胺的平均回收率在74.18%～90.15%之間。相對標準偏差(RSD)在2.22%～8.04%之間。

3 結論

采用乙腈+甲醇提取,利用改進的QuEChERS

Determination of biogenic amines in aquatic products by modified QuEChERS method and liquid chromatography-mass spectrometry

JIANG Lin-rong,XU Zhi-wei,ZENG Min,HUANG Jie-ying,XU Li,FU Chuan-jun,PANG Dao-biao,LI Shi-fei

(Hainan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Haikou 570311,China)

A modified QuEChERS method followed by liquid chromatography-tandem mass spectrometric analysis was developed for the determination of biogenic amines in aquatic products. The samples was diluted with acetonitrile/methanol solution(9/1)and cleaned up with primary secondary amine(PSA)and Octadecylsilane(C18)sorbent. The separation of biogenic amines was performed by hydrophilic interaction liquid chromatography(HILIC)column and gradiently eluting with acetonitrile/formic acid-water(1%)without derivatization. Biogenic amines were analyzed by positive electrosprary ionization(ESI+)tandem mass spectrometry under multiple reaction monitoring(MRM)mode. Quantification was achieved using external standard method. The linearities were excellent in the range of 10～200 ng/mL. The limits of quantification(LOQ,S/N=10)were 0.10 mg/kg. The recoveries of biogenic amines spiked in matrices were between 74.18% and 90.15% at the spiked levels of 0.10 mg/kg. The relative standard deviations(RSDs,n=6)were in the range of 2.22%～8.04%. The method(quick,easy,safe)could meet the requirements of the daily work for the determination of biogenic amines in aquatic products.

QuEChERS;RPLC-TMS;biogenic amines;aquatic products;determination

2016-05-27

蔣林蓉(1981-),女,博士,工程師,研究方向:食品中有毒有害物質檢測,E-mail:jhping780524@163.com。

海南省自然科學基金項目(313105);海南省科技興海項目(XH201407)。

TS254.7

A

1002-0306(2016)22-0068-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.22.005