高速逆流色譜法分離純化新疆圓柏枝葉中的黃酮類成分

李 倩,李晨陽,買吾拉江·阿不都熱衣木,徐 芳,趙 軍,*

(1.新疆大學生命科學與技術學院,新疆烏魯木齊 830046;2.新疆藥物研究所維吾爾藥重點實驗室,新疆烏魯木齊 830004)

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高速逆流色譜法分離純化新疆圓柏枝葉中的黃酮類成分

李 倩1,李晨陽2,買吾拉江·阿不都熱衣木1,徐 芳2,趙 軍2,*

(1.新疆大學生命科學與技術學院,新疆烏魯木齊 830046;2.新疆藥物研究所維吾爾藥重點實驗室,新疆烏魯木齊 830004)

目的:建立高速逆流色譜分離純化新疆圓柏枝葉中的黃酮類成分的方法。方法:以氯仿∶甲醇∶正丁醇∶水(4∶3∶0.5∶2)為溶劑系統,上相為固定相,下相為流動相,在流速2.0 mL/min、轉速850 r/min、檢測波長254 nm的條件下,對新疆圓柏中的黃酮類成分進行分離純化。結果:從新疆圓柏提取物中分離純化得到3個化合物:異槲皮苷(a,91.89%)、槲皮苷(b,98.45%)、槲皮素-3-O-(6″-O-乙酰基)-β-D-吡喃葡萄糖苷(c,95.35%),其中c為首次從圓柏屬植物中分離得到的化合物。結論:該法快速簡便,能夠高效分離新疆圓柏中的黃酮類成分。

高速逆流色譜,新疆圓柏,黃酮,分離

新疆圓柏(JuniperussabinaL.),又名叉子圓柏、砂地柏和臭柏等,為柏科圓柏屬常綠匍匐灌木,廣泛分布于我國新疆、甘肅、內蒙和陜北的干旱荒山和沙地之中[1]。新疆圓柏枝葉在我國民間常用于風濕性關節炎、類風濕性關節炎等疾病的治療,被收載于《維吾爾藥志》、《新疆中草藥手冊》和《中國沙漠藥用植物》等醫藥文獻中。該植物包含黃酮、木脂素和萜類等多種類型的化學成分,其中黃酮類化合物是其主要化合物之一[2-5]。

高速逆流色譜(high-speed counter-current chromatography,HSCCC)是近10年迅速發展起來的新型液-液分配色譜技術。與其他分離手段相比,HSCCC不用固相載體作固定相,并具有分離純度高、樣品回收率高、適用范圍廣、能夠同時純化出多個單體化合物等優點,在醫藥[6]、天然產物化學[7]、食品[8]等領域有廣泛的應用。因此,本實驗運用HSCCC從新疆圓柏枝葉中分離黃酮類成分,以期得到分離黃酮的快速簡便方法,為進一步藥理藥效研究和新藥的研制提供物質基礎和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

新疆圓柏 于2014年9月采自烏魯木齊后峽地區,由新疆藥物研究所何江副研究員鑒定;對照品異槲皮苷(批號MUST-15070211)、槲皮苷(批號MUST-13022112) 成都曼思特生物科技有限公司(純度均大于98%);D101大孔吸附樹脂 天津興南允能高分子技術有限公司;100～200目柱層層析硅膠 青島海洋化工廠分廠;60～90目柱層析聚酰胺 中國醫藥集團上海化學試劑公司;甲醇與乙腈 為色譜純,美國Fisher公司;水 為純凈水;其余試劑為 國產分析純。

AL204電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;TBE-300A高速逆流色譜儀 上海同田生化技術有限公司;N2000色譜工作站 浙江大學智達信息工程有限公司;LC-10ATvp高效液相色譜儀、UV-2501PC紫外可見分光光度計、SPD-10Avp紫外可見檢測器 日本島津有限公司;AS系列超聲波清洗機 天津奧特賽恩斯儀器有限公司;INOVA-400型超導核磁共振儀 美國VARIAN公司;RT-3型熔點測定儀 天津新天光分析儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 新疆圓柏總黃酮的制備 取新疆圓柏枝葉樣品1 kg,以料液比1∶7(g/mL)加入50%乙醇,回流提取3次,每次提取1.5 h,過濾,合并濾液,減壓濃縮至膏狀。然后以適量硅膠拌樣后上硅膠柱,分別用石油醚∶乙酸乙酯(1∶1)、石油醚∶乙酸乙酯(2∶8)、60%乙醇洗脫。收集60%乙醇洗脫液,減壓濃縮至無乙醇味后,再用蒸餾水溶解制成樣品溶液。然后上D101大孔樹脂柱,收集50%乙醇洗脫液,減壓濃縮至干[9]。接著上聚酰胺柱,分別用水、30%乙醇、40%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇梯度洗脫,收集50%乙醇洗脫液,50 ℃下減壓濃縮至干,用于高速逆流色譜分離。

1.2.2 溶劑體系的選擇 選擇兩相溶劑系統是通過目標化合物的分配系數K來確定的。K值通過HPLC檢測確定,步驟如下:取大約5 mg樣品放入試管中,加入已平衡的兩相溶劑系統,上、下相溶劑各5.0 mL,充分振搖溶解后靜置分層,分別取上、下相4 mL旋蒸干,用甲醇溶解定容至10 mL,用HPLC檢測,上相和下相的峰面積分別為A1和A2,分配系數K=A1/A2。

1.2.3 HSCCC分離過程 溶劑系統:將氯仿∶甲醇∶正丁醇∶水(1200 mL∶900 mL∶150 mL∶600 mL,即4∶3∶0.5∶2)加入分液漏斗中,充分振搖后靜置過夜。實驗前將分配平衡的兩相溶劑系統按上相和下相分開放入瓶中,超聲脫氣20 min,以備使用。操作步驟:首先將兩相溶劑系統中已超聲脫氣后的上相(固定相)以10 mL/min泵入HSCCC螺旋管中,待螺旋管充滿后,緩慢調節主機轉數至850 r/min,順時針旋轉,同時將下相(流動相)以2.0 mL/min泵入其中,待兩相平衡后,取樣品200 mg溶于5 mL上相和5 mL下相溶液,由進樣閥注入到螺旋管中,同時開始采集數據,通過紫外檢測器(254 nm)檢測流出物,按照色譜圖手動收集各成分。保留率計算公式如下：

保留率(%)=(V總-V出)/(V總-V環)×100

式中V總為管路總體積;V出為流動相推出固定相體積;V環為進樣環體積(20 mL)。

1.2.4 高效液相色譜(HPLC)分析 采用HPLC檢測新疆圓柏總黃酮的成分及經HSCCC分離后各色譜峰的純度。HPLC分析條件:Phenomenex Gemini C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動相為乙腈(A):0.2%磷酸水溶液(B);梯度洗脫程序(0 min～2 min～20 min～25 min,19% A～20% A～24% A～19% A);柱溫30 ℃;流速1.0 mL/min;檢測波長254 nm;進樣量10 μL。

2 結果與分析

2.1 HSCCC分離溶劑系統的選擇

溶劑系統是決定HSCCC分離效果的最重要因素,應該滿足以下幾方面的要求:a.不造成樣品的分解與變性;b.足夠高的樣品溶解度;c.樣品在系統中有合適的分配系數值;d.固定相能實現足夠高的保留。結合所分離樣品的極性偏大,選用極性較大的溶劑系統進行研究。本研究采用HPLC測定,共考察了以下幾個溶劑系統,結果見表1。

表1 化合物在不同溶劑系統中的分配系數

K值越大,化合物在固定相中分配越高,導致分離的時間過長,影響分離效率;K值越小,出峰越快,分離效果差。從表1可以看出,溶劑系統K值比較符合條件的是正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水(0.5%乙酸)(0.5∶5∶1∶5)和氯仿∶甲醇∶正丁醇∶水(4∶3∶0.5∶2),但是溶劑系統正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水(0.5%乙酸)(0.5∶5∶1∶5)的b、c化合物的K值比較接近,分離度小,無法將它們分開。因此,選擇溶劑系統為氯仿∶甲醇∶正丁醇∶水(4∶3∶0.5∶2),其固定相保留率為73.3%。

2.2 HSCCC分離純化的結果

根據HSCCC色譜圖手動收集,得到3種化合物,分離情況見圖1。新疆圓柏總黃酮(200 mg)HSCCC分離得a(24.6 mg),b(54.6 mg)和c(26.8 mg)三個主要組分。

圖1 新疆圓柏總黃酮的高速逆流色譜圖Fig.1 HSCCC profiles of total flavonoidsfrom Juniperus sabina L

2.3 結構鑒定

峰a和b通過TLC和HPLC檢測,并和對照品相對照,鑒定為異槲皮苷和槲皮苷。

峰c為淡黃色粉末,熔點:207～209 ℃,10%硫酸-乙醇溶液顯色呈黃色,遇1%三氯化鐵-乙醇溶液顯色呈黃綠色,UV(MeOH):254 nm,361 nm;1HNMR(DMSO-d6,400 MHz)δ:6.19(1H,d,J=1.6 Hz,H-6),6.41(1H,d,J=1.6 Hz,H-8),7.52(1H,s,H-2′),6.82(1H,d,J=8.8 Hz,H-5′),7.53(1H,d,J=6.8 Hz,H-6′),δ5.37(1H,d,J=7.2 Hz,H-1″).13C-NMR(DMSO-d6,100 MHz)δ:156.7(C-2),133.1(C-3),177.5(C-4),161.4(C-5),98.9(C-6),164.4(C-7),93.7(C-7),156.5(C-9),104.0(C-10),121.7(C-l′),115.3(C-2′),145.0(C-3′),148.7(C-4′),116.3(C-5′),121.2(C-6′),101.2(C-1″),74.2(C-2″),76.4(C-3″),69.8(C-4″),74.2(C-5″),63.0(C-5″),170.0(>C=O),20.3(CH3)。以上理化性質和波譜數據與文獻[10]報道一致,故鑒定該化合物為槲皮素-3-O-(6″-O-乙酰基)-β-D-吡喃葡萄糖苷。

2.4 純度檢測

新疆圓柏總黃酮的HPLC色譜圖見圖2。經HSCCC分離所得主要峰通過HPLC檢驗(圖3),用峰面積歸一法計算純度。

圖2 新疆圓柏總黃酮的HPLC色譜圖Fig.2 HPLC profiles of total flavonoidsfrom Juniperus sabina L

圖3 HSCCC中3個組分的HPLC色譜圖Fig.3 HPLC profiles of three components in HSCCC

HPLC檢測結果表明,峰a是異槲皮苷,純度為91.89%;峰b是槲皮苷,純度為98.45%;峰c是槲皮素-3-O-(6″-O-乙酰基)-β-D-吡喃葡萄糖苷,純度為95.35%。從結果可知,HSCCC高效、快速、連續地從新疆圓柏總黃酮中分離得到3種主要的黃酮類化合物。新疆圓柏總黃酮種類多、結果復雜,通過其他方法純化比較復雜,而采用HSCCC方法操作方便、分離時間短、樣品回收率高,同時制備成本較低、重現性好,一步分離得到新疆圓柏總黃酮中3種主要的黃酮類化合物,這為高速逆流色譜技術在藥物工業中的應用奠定了堅實的物質基礎和技術基礎。

3 結論

應用高速逆流色譜分離新疆圓柏總黃酮,得到3種黃酮類化合物,純度均大于90%。經結構表征,分別確定為:異槲皮苷(91.89%)、槲皮苷(98.45%)、槲皮素-3-O-(6″-O-乙酰基)-β-D-吡喃葡萄糖苷(95.35%),其中化合物c為首次從圓柏屬植物中分離得到的成分。由于HSCCC不用固態載體做固定相,避免了載體填充物所形成的不可逆吸附、減少了樣品的損耗、分離時間短、回收率高、分離效率高,能實現更有效的制備性分離和純化,可用于新疆圓柏中黃酮類成分的快速分離。

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Separation and purification of flavonoids fromJuniperussabinaL. by high-speed counter-current chromatography

LI Qian1,LI Chen-yang2,Maiwulajiang ABUDUREYIMU1,XU Fang2,ZHAO Jun2,*

(1.College of Life Sciences&Technology,Xinjiang University,Urumqi 830046,China; 2.Xinjiang Key Laboratory for Uighur Medicines,Xinjiang Institute of Materia Medica,Urumqi 830004,China)

Objective:To study separation and purification of flavonoids from the leaves ofJuniperussabinaL. by high-speed counter-current chromatography(HSCCC). Methods:Solvent system of chloroform∶methanol∶n-butanol∶water(4∶3∶0.5∶2)was employed,the upper phase as stationary phase,the lower phase as mobile phase,a flow-rate of 2.0 mL/min,the rotation speed 850 r/min and detection wavelength 254 nm,flavonoids fromJuniperussabinaL. were isolated and purified under this condition. Results:Three compounds were separated from the leaves ofJuniperussabinaL. as isoquercitrin(a,91.89%),quercitrin(b,98.45%),quercetin-3-O-(6″-O-acetyl)-β-D-glucopyranoside(c,95.35%),of which compound c was separated fromJuniperusgenusfor the first time. Conclusion:This method could conveniently and effectively separate flavonoids fromJuniperussabinaL.

high-speed counter-current chromatography;JuniperussabinaL.;flavonoids;separation

2016-05-20

李倩(1992-)，女，碩士研究生，研究方向：藥食兼用植物的研究與開發，E-mail：yaaitingzheng@163.com。

*通訊作者:趙軍(1973-)，男，博士，研究員，研究方向：中藥與天然藥物化學研究，E-mail:zhaojun21cn@163.com。

新疆維吾爾自治區科技支撐計劃(201433103)。

TS201.2

A

1002-0306(2016)22-0059-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.22.003