安徽銅陵白姜姜瘟病病原鑒定

胡洪濤++朱志剛++閔勇++楊自文++黃大野++姚經(jīng)武++楊妮娜++龍同++程賢亮

摘 要：通過田間調查發(fā)現(xiàn)，銅陵白姜姜瘟病在銅陵當?shù)乇憩F(xiàn)出木質部黃心和黑心2種癥狀，通過TTC平板分離、致病性測定、16S rDNA以及青枯菌特異性鞭毛基因（fliC）檢測表明，導致2種不同姜瘟病癥狀的病原菌均為青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum），但二者致病性存在明顯差異。

關鍵詞：銅陵；白姜；姜瘟病；青枯雷爾氏菌；病原鑒定

中圖分類號：S632.5 文獻標識碼：A 文章編號：1001-3547（2016）24-0075-04

由青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum，簡稱青枯菌）侵染造成的細菌性青枯病是世界性重要病害之一，該菌可侵染54個科的450多種植物[1]，但以茄科作物，如番茄、馬鈴薯等，受害最為嚴重。生姜青枯病，因其發(fā)病快、死亡率高、無有效防治手段，所以俗稱姜瘟病[2]。安徽銅陵白姜種植歷史悠久，姜塊色白鮮嫩汁多、香味純正、品質優(yōu)良，并具藥用價值，宋朝時被列為朝廷貢品，被譽為銅陵“八寶”之一。銅陵白姜種植面積約為400 hm2，年產(chǎn)量約為4 000 t，年產(chǎn)值近億元，是當?shù)刂匾奶厣r(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)[3]。銅陵市義安區(qū)是銅陵白姜主產(chǎn)區(qū)，近年來該區(qū)姜瘟病的發(fā)生日益嚴重，連作田發(fā)病率50%以上，重病田甚至絕收，已經(jīng)嚴重阻礙了當?shù)厣a(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[3]。盡管對姜瘟病的研究進行多年，然而對銅陵姜瘟病病原的研究甚少。為此，開展了銅陵白姜姜瘟病病原檢測的研究，以期為進一步有效防治該病提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品收集

2016年5～8月，在銅陵市義安區(qū)興化村等主要白姜產(chǎn)區(qū)分別挖取葉部呈現(xiàn)萎蔫狀的生姜姜塊，用清水將其表面泥土沖洗干凈，吸水紙吸干，冰盒保存帶回實驗室。

1.2 病原菌分離

病原菌分離均于采樣后48 h內在超凈工作臺（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司，型號A2）上完成。樣品先用無菌水沖洗3遍，晾干至表面無明顯水滴，在75%的酒精中浸泡2～3 min，再用無菌水沖洗3遍，晾干至表面無明顯水滴，用消毒刀片在姜塊中部表面切一道長2～4 cm、深約2 mm的切口，用消毒鑷子將其掰開，并用消毒牙簽蘸取姜塊中間部位汁液，在TTC平板上劃線分離[4]。將分離平板置

于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～72 h，所得單菌落超低溫

（-80℃）保存于25%甘油管中。

1.3 致病性測定

病原菌制備：將病原分離物，接種于SPA液體培養(yǎng)基[5]，搖床（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司，型號DLHR-Q200）發(fā)酵48 h（28℃，150 r/min）后，將分光光度計（上海光學儀器721型）OD560值調至1.0，測定菌液濃度約為1×108 CFU/mL，備用。

將溫室生長至5～8葉的銅陵白姜植株從營養(yǎng)缽中取出，用清水將根部沖洗干凈，用消毒針在莖基部刺3個深度和間隔均約為1 cm的針孔，而后將根系置入病原菌發(fā)酵液中浸泡20 min。無菌水處理作為對照。每處理5株，重復2次。處理后的植株立即種植于營養(yǎng)缽中，置于人工氣候箱（光周期

12 h/8 h，溫度30℃，濕度85%）內培養(yǎng)7～10 d。

1.4 16S rDNA檢測

純化后的病原分離物直接用PCR擴增，采用16S rDNA通用引物對（F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'），PCR反應體系（50 μL）：2×ES Taq Mix 25μL，正反引物各1 μL，模板1 μL，ddH2O 22 μL。反應條件：95℃ 1 min，95℃ 30 s，58℃ 1 min，72℃ 1.5 min，30個循環(huán)，72℃ 5 min。引物合成和PCR產(chǎn)物測序均由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。

1.5 青枯菌鞭毛基因（fliC）基因檢測

根據(jù)NCBI中青枯菌鞭毛基因（fliC）序列設計引物對（F：5'-GAACGCCAACGGTGCGAACT-3'，R：5'-GGCGGCCTTCAGGGAGGTC-3'）。反應體系和條件同1.4。

1.6 進化樹分析

進化樹分析在MEGA 7.0中完成。首先，采用Clustalw進行DNA序列比對（DNA Weight Matrix：IUB，其他采用默認參數(shù)）。進化樹的構建采用Maxium Likehood方法、Tamura-Nei模式。

2 結果與分析

2.1 姜瘟病田間癥狀

在銅陵義安村田間調查表明，感染植株在患病初期，葉片褪綠，葉尖和葉緣先黃化，逐漸萎縮反卷下垂（圖1A、B），病葉逐步從基部向上發(fā)展，至全株枯死。病株莖基部逐漸變軟，維管束變色褐化、呈水漬狀，擠壓時，有污白色菌膿流出。患病姜塊變軟、維管束變色，根據(jù)維管束顏色，可分為黃色和黑色2種，俗稱為黃心（圖1C-a）和黑心（圖1C-b）。黑心和黃心患病植株的姜塊木質部分別呈現(xiàn)黃色、黑色，而地上部癥狀無明顯差異，但相對于黃心癥狀，黑心癥狀病株萎蔫更快，病程更短。

2.2 致病性測試

致病性測試結果顯示，在接種后12 d后，植株葉片呈現(xiàn)萎蔫狀、卷縮，葉尖和葉緣失綠黃化，與田間病株癥狀完全一致（圖2），表明所分離的病原物為姜瘟病病原。然而，接種黑心癥狀病原的植株萎蔫程度更甚、失綠更為嚴重，提示黑心癥狀病原的致病性可能更強。

2.3 病原形態(tài)鑒定

導致白姜黑心和黃心癥狀的病原分離物在TTC培養(yǎng)基菌落均為近圓形或梭形，中間略微凸起、中間粉紅色至紅色、周圍為白色。病原菌均為單胞、桿狀，大小為（0.5～0.7）μm×（1.5～2.0）μm，革蘭氏染色陰性，而結晶紫染色顯示兩極著色深，與前人報道一致[6，7]。

2.4 16S rDNA測序

采用16S rDNA通用引物對擴增和測序，結果表明，2種癥狀病原分離物的16S rDNA產(chǎn)物長度均為1 439 bp（NCBI序列號：KX785159.1和KX785160.1）。黃心和黑心癥狀病原的16S rDNA序列與NCBI里保存的青枯雷爾氏菌有高度相似性（>99%）（圖3），而與其他菌如Bukholderia、Bacillus等，親緣關系相對較遠，表明無論是黃心還是黑心癥狀病原菌均為青枯雷爾氏菌。

2.4 青枯菌特異性鞭毛基因（fliC）檢測

為進一步確定銅陵白姜姜瘟病病原，根據(jù)前人研究結果[8]，針對青枯菌特異性鞭毛基因（fliC）在NCBI上設計了1對引物，用于青枯菌特檢測，結果如圖4所示。測序結果顯示，黃心和黑心癥狀的青枯菌fliC基因PCR產(chǎn)物長度分別為368、370 bp。由于5'端20～30 bp和3'端10 bp測序質量較低，因此，將兩端低質量的堿基去掉，所得序列與NCBI中所保存的青枯菌fliC基因序列進行比對。如圖5所示，導致白姜黃心和黑心癥狀的青枯菌fliC基因序列與NCBI保存的青枯菌完全一致。綜上所述，可以確定導致銅陵白姜黃心和黑心癥狀姜瘟病的病原均為青枯菌。

3 討論與結論

銅陵白姜為我國具有地方特色的名特優(yōu)農(nóng)產(chǎn)品，而近年來，日益嚴重的姜瘟病已經(jīng)給當?shù)匕捉a(chǎn)造成嚴重的經(jīng)濟損失，制約了白姜產(chǎn)業(yè)的健康、可持續(xù)發(fā)展。然而長期以來，缺乏對其病原菌的科學鑒定。本研究通過實地調研，發(fā)現(xiàn)姜瘟病病株表現(xiàn)為黃心和黑心2種不同癥狀，而通過TTC平板分離、形態(tài)學、致病性測定和分子生物學等手段，對銅陵白姜姜瘟病病株進行分離和鑒定，明確其病原均為青枯菌，但二者的致病性存在明顯差異。

16S rDNA序列分析是植物病原細菌鑒定和分類的重要手段和依據(jù) [9]。經(jīng)序列比較和系統(tǒng)進化樹分析證明銅陵白姜姜瘟病2種癥狀的病原與已知青枯菌在同一分支。然而，盡管2種癥狀病原遺傳距離相當近，但仍然存在微小差距。盡管青枯菌特異性鞭毛基因擴增結果表明，黃心和黑心癥狀病原的序列與已知青枯菌完全一致，但由于致病性和16S rDNA序列存在差異，提示導致黃心和黑心癥狀青枯菌可能為不同的株系或者分化型[8]。前人研究表明，不同地區(qū)或寄主的青枯菌表現(xiàn)出明顯生理分化或菌系多樣性[10]，而在地理位置和寄主相同的情況下，發(fā)現(xiàn)毒力差異性的青枯菌的相關報道尚不多見。青枯菌的致病性受多種基因調控[11]，如果能從基因組學角度，深入研究其在DNA和轉錄組水平方面的差異，將有助于揭示青枯菌致病性的調控機制[12]。

參考文獻

[1] Hayward A C. Biology and epidemiology of bacterial wilt caused by Pseudomonas solanacearum[J]. Annual Review of Phytopathology， 1991（29）： 65-87.

[2] 劉銘，張敏，戢俊臣，等.中國姜瘟病的研究進展[J].中國農(nóng)學通報，2005（6）：337-340.

[3] 趙友前，趙德明，汪濤，等.銅陵縣白姜姜瘟病的致病因素及防治技術[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2012（7）：177.

[4] 方中達.植病研究方法[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1998：156-211.

[5] 車建美，劉波，張彥，等.青枯雷爾氏菌致病性生物測定方法的研究[J].福建農(nóng)業(yè)學報，2011，26（5）：804-807.

[6] 陳莉，高智謀，楊自保，等.安徽省姜瘟病病原細菌鑒定及有效藥劑篩選[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2007，35（18）：5 479，

5 516.

[7] 趙志祥，嚴婉榮，陳圓，等.海南生姜青枯病病原菌鑒定[J]. 基因組學與應用生物學，2015，34（4）：763-768.

[8] Sch？觟nfeld J， Heuer H， Van Elsas J D， et al. Specific and sensitive detection of Ralstonia solanacearum in soil on the basis of PCR amplification of fliC fragments [J]. Applied Environmental Microbiology， 2003， 69（12）： 7 248-7 256.

[9] Weisburg W G， Barns S M， Pelletier D A， et al. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study[J]. Journal of Bacteriology， 1991， 173（2）： 697-703.

[10] 徐進，顧鋼，潘哲超，等.福建煙草青枯菌演化型及生化變種鑒定研究[J].中國煙草學報，2010，16（6）：66-71.

[11] 蔡劉體，劉艷霞，石俊雄.青枯菌致病力的主要決定因子研究進展[J].貴州農(nóng)業(yè)科技，2015，43（8）：109-113.

[12] Salanoubat M， Genin S， Artiguenave F， et al. Genome sequence of the plant pathogen Ralstonia solanacearum [J]. Nature， 2002， 415（6 871）： 497-502.