早竹竹葉蛋白的微波提取工藝優(yōu)化

陳致印++何佳慧++許澤文

摘 要：該文以早竹竹葉為研究對(duì)象，pH7.8的磷酸緩沖溶液為提取劑，采用微波提取法，并用考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，在料液比、提取時(shí)間、提取溫度、微波功率等單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化了微波提取早竹竹葉蛋白的工藝參數(shù)。結(jié)果表明：各因素對(duì)早竹竹葉蛋白質(zhì)的提取率的影響順序依次為：微波時(shí)間>微波溫度>微波功率>料液比。微波提取早竹竹葉蛋白的最佳工藝條件為：料液比為1∶25，微波時(shí)間為8min，微波溫度為54℃，微波功率為500W，在此最佳條件下，提取率為8.07%。

關(guān)鍵詞：早竹竹葉；蛋白質(zhì)；微波

中圖分類(lèi)號(hào) S795 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2016）24-0103-04

Optimization of Microwave Assisted Protein Extraction from Phyllostachys praecox Bamboo Leaves

Chen Zhiyin et al.

（College of Agriculture and Biotechnology，Hunan University of Humanities，Science and Technology，Loudi 417000，China）

Abstract：Taking the leaves of Phyllostachys praecox bamboo as material，phosphate buffer solution as extract solvent，and the protein content was determined by Coomassie Brilliant Blue Staining. On the basis of single factor tests of solid-liquid ratio，microwave time，microwave temperature and microwave power，L9（34）orthogonal experiment was used to optimize the extraction of Phyllostachys praecox bamboo leaves. The results showed that the effect of the investigated factors on the extraction yield of Phyllostachys praecox bamboo leaves protein was in sequence of microwave time，microwave temperature，microwave power，solid-liquid ratio.The optimum conditions of microwave-assisted extraction of Phyllostachys praecox bamboo leaves protein were：solid-liquid was 1∶25，microwave time was 8min，microwave temperature was 54℃，microwave power was 500W. Under these circumstances，the extraction rate of Phyllostachys praecox bamboo leaves protein reached 8.07%.

Key words：Phyllostachys praecox bamboo leaves；Protein；Microwave

早竹（Phyllostachys praecox）為禾本科剛竹屬植物，筍期在3月下旬至4月上旬或更早，故稱(chēng)為早竹。經(jīng)周兆祥研究[1]發(fā)現(xiàn)早竹竹葉中含有機(jī)酸、酚類(lèi)化合物、蛋白質(zhì)、多糖等有機(jī)物，且富含鈣、硅等礦物元素，其豐富的化學(xué)成分使其具有抗氧化、抗衰老、調(diào)節(jié)血脂等[2]生物功能。目前對(duì)早竹竹葉的研究大多數(shù)側(cè)重在糖類(lèi)、葉綠素、黃酮、竹葉的抗氧化活性及天然竹葉飲料[3]等方面，而關(guān)于竹葉蛋白則少有研究，近年竹葉蛋白被發(fā)現(xiàn)有抗菌[4]、防霉、防腐[5-6]等功能，如何提高竹葉蛋白質(zhì)的提取率，成為了近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。本文以早竹竹葉為試材，以料液比、微波時(shí)間、微波溫度和微波功率為考察因素，研究微波提取方法對(duì)早竹竹葉蛋白得率的影響，以期為工業(yè)開(kāi)發(fā)竹葉蛋白提供理論依據(jù)[7]。

1 材料和儀器

1.1 材料 早竹竹葉粉由采摘自?shī)涞兹宋目萍紝W(xué)院毓師園的早竹竹葉晾干制成粉，過(guò)80目篩。蒸餾水、磷酸氫二鈉（分析純）、牛血清白蛋白（生化試劑）、硼酸、溴甲酚綠：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司、磷酸二氫鈉（分析純）：湖南匯虹試劑有限公司、氫氧化鈉：天津市化學(xué)試劑工廠、硫酸鉀：臺(tái)山市粵僑試劑塑料有限公司、硫酸銅：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司、無(wú)水碳酸鈉：西隴化工股份有限公司、鹽酸：衡陽(yáng)市信凱化工試劑、濃硫酸：湖南匯虹試劑有限公司、考馬斯亮藍(lán)G-250：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所、無(wú)水乙醇：湖南匯虹試劑有限公司、溴甲酚綠：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司、甲基紅：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司。

1.2 儀器 101型電熱鼓風(fēng)干燥箱：北京中興偉業(yè)儀器有限公司、XEB-400型高速中藥粉碎機(jī)：吉首市中誠(chéng)制藥機(jī)械廠、UVmini-1240島津紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、KDN系列凱氏定氮儀、Multwave PRO安東帕微波消解儀、SHIMADZU AUW120D十萬(wàn)分之一分析天平、SHZ-DⅢ循環(huán)水真空泵：鄭州英峪予華儀器有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 工藝流程 工藝流程如下：采集新鮮的早竹竹葉→洗凈晾干、在45℃的鼓風(fēng)干燥機(jī)中烘24h→中藥粉碎機(jī)打粉→過(guò)80目篩→早竹竹葉樣品→PBS磷酸緩沖溶液浸泡0.5h[8]→微波提取→過(guò)濾→考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定吸光度→計(jì)算蛋白質(zhì)得率。

2.2 單因素試驗(yàn) 稱(chēng)取早竹竹葉粉1g，以pH 8.4磷酸緩沖液為提取劑，按料液比為1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35添加磷酸緩沖液，溫度分別為46℃、48℃、50℃、52℃、54℃，微波時(shí)間分別為2min、4min、6min、8min、10min，功率分別為200W、300W、400W、500W、600W的情況下，浸泡0.5h，過(guò)濾，得濾液，在595nm下用紫外分光光度計(jì)測(cè)吸光度，測(cè)定蛋白質(zhì)得率。

2.3 正交試驗(yàn) 在單因素的基礎(chǔ)上，采用L9（34）進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步研究料液比、溫度、時(shí)間、功率的變化對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響。

2.4 蛋白質(zhì)的測(cè)定

2.4.1 牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 稱(chēng)取100mg牛血清蛋白，用蒸餾水配置成1 000mg/mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，取6支10mL干凈的具塞試管分別加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，用蒸餾水補(bǔ)充至1mL，分別加入5mL考馬斯亮藍(lán)溶液，搖勻，反應(yīng)2min，用1cm比色皿在595nm下測(cè)定吸光度A，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[9]。

2.4.2 早竹竹葉中蛋白質(zhì)總含量的測(cè)定 采用凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)總含量[9]。

2.4.3 早竹竹葉蛋白提取率的測(cè)定 計(jì)算公式如下：提取率（%）=提取蛋白質(zhì)的質(zhì)量/蛋白質(zhì)的總質(zhì)量×100

3 結(jié)果與分析

3.1 牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 在595nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，以吸光度（A）為縱坐標(biāo)、牛血清蛋白濃度（x）為橫坐標(biāo)，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）及回歸方程：A=0.7646x-0.008，R2=0.999 1。

3.2 蛋白質(zhì)總含量 用凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，測(cè)得早竹竹葉中的蛋白質(zhì)含量為10.757%。毛燕、王學(xué)利[10]等利用凱氏定氮法研究過(guò)9種竹葉中的蛋白質(zhì)的含量，結(jié)果表明這9種竹葉中蛋白質(zhì)平均含量為13.6%，不同品種的竹葉蛋白質(zhì)含量差異也較大，其中白哺雞竹葉的蛋白質(zhì)含量高達(dá)18.25%，石竹的蛋白質(zhì)含量為10.81%，金竹的蛋白質(zhì)含量為10.63%，芽竹的蛋白質(zhì)含量為10.88%。與本試驗(yàn)測(cè)定的10.75%數(shù)值相近。

3.3 單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.3.1 料液比對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響 不同的料液比對(duì)早竹竹葉蛋白的提取效果不同，從圖2可以看出，在1∶15～1∶25蛋白質(zhì)提取率有較大的提升，當(dāng)料液比過(guò)大時(shí)，溶劑太少，浸提不夠充分，可能有部分蛋白質(zhì)沒(méi)有溶解，影響提取率，而隨著溶劑的增加，體系在中的粘度降低，便于蛋白質(zhì)溶解；1∶25時(shí)蛋白質(zhì)的提取率達(dá)到最大，為7.51%；當(dāng)料液比的比值繼續(xù)下降時(shí)候蛋白質(zhì)的提取率反而下降，這可能是因?yàn)槿軇┑牧窟^(guò)大，導(dǎo)致蛋白濃度下降。

3.3.2 提取溫度對(duì)早竹竹葉蛋白質(zhì)的影響 從圖3可以看出，隨著提取溫度的升高早竹竹葉蛋白的提取率逐漸增高，這是因?yàn)殡S著溫度的增加，體系中的熵值增加，蛋白質(zhì)加速溶解和擴(kuò)散，當(dāng)溫度達(dá)到52℃時(shí)，蛋白質(zhì)的提取率達(dá)到最高，為6.76%。隨著溫度的繼續(xù)增加早竹竹葉蛋白的提取率反而下降，可能是溫度過(guò)高導(dǎo)致蛋白質(zhì)水解。因此，提取溫度以52℃左右為宜。

3.3.3 時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響 由圖4可知，從2～4min，早竹竹葉蛋白的提取率迅速上升，在4min時(shí)達(dá)到提取率的峰值，為7%；隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)的提取率緩慢下降。這說(shuō)明在第4min時(shí)，蛋白質(zhì)的提取基本完成，繼續(xù)微波會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)水解、變質(zhì)，且長(zhǎng)時(shí)間的微波會(huì)使水分過(guò)分蒸發(fā)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的溶出減少，反而使得率緩慢下降，故選取4min、6min和8min進(jìn)行正交試驗(yàn)。

3.3.4 提取功率對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響 由圖5可知，從200W開(kāi)始隨著功率的增加早竹竹葉蛋白質(zhì)的提取率緩慢上升，到400W時(shí)，蛋白質(zhì)的提取率達(dá)到最大為6.946%，而后隨著提取功率的增加，蛋白質(zhì)的提取率逐漸下降，這可能是因?yàn)槲⒉ㄌ幚砑夹g(shù)是將微波電磁能轉(zhuǎn)化成熱能，利用微波整體受熱的特點(diǎn)，促使細(xì)胞膜破裂，加速蛋白質(zhì)的滲透及溶解。當(dāng)功率過(guò)高時(shí)，受熱過(guò)快，易導(dǎo)致蛋白質(zhì)的分解，且受熱過(guò)快，易導(dǎo)致暴沸，使得提取物粘連在管壁上，影響到蛋白質(zhì)溶解在溶液中，故提取功率為400W。

3.4 正交實(shí)驗(yàn) 根據(jù)單因素的試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)（L9（34））正交表，詳見(jiàn)表1（表2）。由表2可知，根據(jù)極差的數(shù)值大小，可知微波法提取早竹竹葉蛋白質(zhì)中，各因素對(duì)早竹竹葉蛋白質(zhì)的影響大小順序?yàn)槲⒉〞r(shí)間>微波溫度>微波功率>料液比，微波時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)的影響最大，在提取時(shí)間8min時(shí)，蛋白質(zhì)的得率最高。這可能是因?yàn)槲⒉▽?duì)細(xì)胞壁有穿透作用，且微波附帶著的熱量能使蛋白質(zhì)溶解在溶劑中，隨著微波時(shí)間的增加，物質(zhì)吸收的波能越多，固液傳質(zhì)的速度越快，即更多的蛋白質(zhì)溶解在提取介質(zhì)中。綜合各因素的作用，微波法提取早竹竹葉蛋白的最佳條件是A1B3C3D3，即在料液比為1∶20，微波溫度為54℃，微波功率為500W的條件下微波8min，蛋白質(zhì)的提取率為8.07%。

3.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 為驗(yàn)證所選工藝的穩(wěn)定性和可重復(fù)性，精確稱(chēng)取1.00g早竹竹葉粉末，在最佳提取工藝參數(shù)下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，得出蛋白質(zhì)的平均提取率為8.03%，RSD值為0.56%。表明該工藝穩(wěn)定可行。

4 結(jié)論與討論

通過(guò)本試驗(yàn)確定了微波法提取早竹竹葉蛋白的最佳工藝參數(shù)，通過(guò)單因素試驗(yàn)法確定了料液比、溫度、時(shí)間和功率4個(gè)因素的取值范圍，并得出影響蛋白質(zhì)提取率的因素大小為微波時(shí)間>微波溫度>微波功率>料液比，正交試驗(yàn)得出最佳工藝參數(shù)組合：料液比為1∶20，溫度為54℃，功率為500W，微波時(shí)間為8min，早竹竹葉蛋白質(zhì)的提取率為8.07%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果低于陳學(xué)仕等[11]利用微波法提取茶葉蛋白質(zhì)的提取率11.26%以及扶慶全等[12]利用微波輔助提取紅豆蛋白的提取率93.56%，這可能是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)材料不同，也可能是因?yàn)樵诜鋈珣c等進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)將pH作為單因素，而本試驗(yàn)沒(méi)有將pH的影響考慮在內(nèi)。

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