大、小鼠綠膿桿菌脈沖場凝膠電泳分型研究

馮 潔, 謝建云, 魏曉鋒, 胡建華, 高 誠

(1. 揚州大學獸醫學院, 揚州 225009;

2. 上海實驗動物研究中心, 上海市實驗動物質量監督檢驗站, 上海 201203)

大、小鼠綠膿桿菌脈沖場凝膠電泳分型研究

馮 潔1,2, 謝建云2, 魏曉鋒2, 胡建華2, 高 誠2

(1. 揚州大學獸醫學院, 揚州 225009;

2. 上海實驗動物研究中心, 上海市實驗動物質量監督檢驗站, 上海 201203)

目的 對近年來上海及江蘇地區部分單位大、小鼠綠膿桿菌進行分離鑒定，采用脈沖場凝膠電泳(PFGE)分子分型技術作基因型分析，以了解綠膿桿菌流行菌株與宿主之間的相關性。方法 無菌采集上海及江蘇地區部分單位實驗大、小鼠回盲部內容物進行綠膿桿菌分離培養，采用形態學觀察、生化試驗對分離菌進行鑒定。提取綠膿桿菌分離株基因組DNA，經Xba I酶切后進行脈沖場凝膠電泳。結果 共分離到67株綠膿桿菌，PFGE圖譜可分為39種不同帶型，14個基因簇(A-N)，優勢簇分別為I、H、B和G，分別占17.9%(12/67)、14.9%(10/67)、13.4%(9/67)和11.9%(8/67)。同一來源地的分離株大多呈現不同的基因簇。 結論 67株細菌具有很大的基因多態性，呈散在分布，未見明顯的流行特征。

綠膿桿菌; 脈沖場凝膠電泳(PFGE); 分子分型

綠膿桿菌是一種革蘭陰性桿菌，能引起人和動物患病的條件性致病菌，首次發現于患者傷口膿液中。廣泛分布于世界各地，尤其偏愛潮濕環境,在空氣、土壤、水、正常人和動物的皮膚、呼吸道、腸道等均可檢出, 當宿主免疫系統受損，常可引起感染、炎癥、敗血癥甚至死亡等[1-5]。我國實驗動物微生物等級及監測標準GB/T 14922.2-2011規定無特定病原體(SPF)實驗大鼠和小鼠必須排除該菌[6]。近年我國實驗動物綠膿桿菌感染時有發生[7-9]，對實驗動物及人類健康造成威脅。本研究對上海及江蘇地區部分單位實驗大鼠和小鼠綠膿桿菌進行分離、鑒定，采用脈沖場凝膠電泳(PFGE)對分離株進行分子分型, 以了解大鼠和小鼠綠膿桿菌的流行情況。

1 材料與方法

1.1 材料

脈沖場電泳儀Bio-Rad CHEF Mapper XA、凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)、比濁儀(法國生物梅里埃公司)、水平低速染、脫色搖床(美國Scilogex公司)、超純水處理裝置(美國Millipore公司); 營養肉湯購自美國BD公司, 細菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司, Tris、EDTA、十二烷基肌氨酸鈉購自美國Sigma公司, 蛋白酶K、限制性內切XbaI購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株處理 將凍存的綠膿桿菌及標準菌株綠膿桿菌ATCC27853、布倫鄧祿普沙門菌H9812 ATCC BAA-664接種至營養肉湯，37 ℃復蘇培養。

1.2.2 PFGE分子分型 按照美國疾病控制預防中

心推薦的腸桿菌科細菌PFGE方法進行[10]。

1.2.3 結果判定 根據Tenover等[11]提出的細菌PFGE分子分型的判斷標準, 相似度≥75%的指紋圖譜為一類PFGE指紋型別, 劃分為同一基因簇(clusters);相似度≥99%的指紋圖譜為相同PFGE分型。圖譜中相似系數在0.85以上的菌株可判為流行病學相關[12]。分辨力用辛普森差異指數(Simpson’s index of diversity, D)表示，計算公式為D=1-{∑ [nj(nj-1)]}/ [N (N-1)], 其中nj為屬于第j個型別的菌株數, N為特定群體中的總菌株數。D值介于0～1, 越趨于1表示該方法分辨力越好。

2 結果

2.1 菌株分離

共分離67株綠膿桿菌，溴化十六烷基三甲銨萘啶酸培養基(NAC)平皿上生成2～ 3 mm、濕潤有光澤的菌落，其中56株產生色素，11株不產生色素。油鏡下觀察可見革蘭小陰性桿菌，兩端鈍圓，排列不規則，未見莢膜和芽孢。生化鑒定結果顯示均為綠膿桿菌。

人文主義精神是一種普遍的人類自我關懷，表現為對人的尊嚴、價值、命運的維護、追求和關切[4]。受市場經濟等因素影響，我國醫療衛生事業中部分醫務人員道德素質下降，醫患關系日益緊張，對醫學生自身發展和病人健康造成沖擊，醫學的人性光芒日趨黯淡，醫學的人文主義精神衰落，同樣也對整個社會的倫理道德產生嚴重沖擊。為此，加強醫學生人文主義教育成為高等醫學院校思想政治教育的主要任務，具體內容及實施路徑見圖1。

2.2 PFGE分型

細菌經酶切后電泳, 利用BioNumerics軟件進行聚類分析顯示(圖1), 67株綠膿桿菌均能被Xba I內切酶切開。根據相似度100%的為同一PFGE型別的原則，67株細菌共分為14個基因簇(A-N), 39種不同帶型。每種帶型包含菌株數為1～5株不等，其中24種帶型(61.54%)分別只包含1株菌, 其它15種帶型包含菌株數大于1株。分型的D值為0.9778。

2.3 菌株的分布

67 株細菌共分為14個基因簇，其中優勢簇分別為I、H、B和G, 分別占17.9%(12/67)、14.9% (10/67)、13.4%(9/67)和11.9%(8/67)。

結合菌株分型信息、動物來源地和品系作進一步分析，表明同一來源地的分離株大多呈現不同的基因簇，表明綠膿桿菌的感染源不同，例如來自P20的8只C57BL/6小鼠分別為G1、G2、G3、G4、G5、F3、I7型。但有少數同一地點的同一品系動物，也可呈現相同基因簇，例如P6的4只ICR均為A1型; P18，5只BALB/c小鼠均為F1型；此外，如P9共分離5株細菌，其中ICR為H5型，C56BL/6為C1型，而3只裸小鼠則均為D1型。上述現象提示，同一來源地的動物品系與菌株之間存在一定的關聯性。

綜上PFGE分型信息表明， 67株細菌具有很大的基因多態性，呈散在分布，未見明顯的流行特征，結果存在來源地和品系上的聚類。

3 討論

細菌分型主要有表型分型、基因分型等方法。傳統的細菌分型方法是基于細菌的表型特征，如菌體形態特征、血清型、噬菌體型等進行分類，在細菌鑒定過程中起重要作用，但也存在缺陷，如不能提供菌株間足夠的相關聯系信息，標準血清的制備、分型率和分辨率不理想，不能滿足應對緊急情況時的要求等。

隨著分子生物學技術的不斷發展，以基因型為基礎的細菌分型方法在微生物分子流行病學調查研究中應用日益廣泛。與血清分型方法相比，分子分型方法是從核酸水平對菌株間的差異進行區分，可將幾乎所有菌株進行分型，能避免交叉反應。其中PFGE因可重復性高、分辨力強，已成為細菌分子流行病學調查的“金標準”[13,14]。本文利用PFGE技術對大、小鼠綠膿桿菌分離株進行分子分型，整體結果顯示，67株細菌具有很大的基因多態性，呈散在分布，未見明顯的流行特征，大多數設施內可分離到不同的基因型。但同一來源地相同品系動物可出現相同的基因型，說明來源地和動物品系存在聚類，這與文獻報道一致[15]。作者分析其原因可能與實驗動物特殊的飼養和管理方式有關，故應加強對該菌的重視，應定期監測，以減少對動物群體和工作人員的相互傳染，在動物的引進和日常飼養管理中應加以重視和規避。

綠膿桿菌作為一種條件致病菌，影響人類與動物的健康和動物試驗結果。本研究對上海、江蘇地區部分單位大、小鼠綠膿桿菌分離株進行PFGE分子分型，進一步豐富了我國實驗動物綠膿桿菌分子流行病學資料，可為今后實驗動物綠膿桿菌的防控和質量管理提供一定的參考依據。

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圖1 67株綠膿桿菌分離株PFGE聚類分析結果Figure 1 PFGE profile of Pseudomonas aeruginosa

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Molecular Subtyping Study on Pseudomonas aeruginosa in Rats and Mice with Pulsed Field Gel Electrophoresis

FENG Jie1,2, XIE Jian-yun2, WEI Xiao-feng2, HU Jian-hua2, GAO Cheng2
(1. College of Veterinary Medicine, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China; 2. Shanghai Laboratory Animal Research Center, Shanghai Quality Monitoring Center of Laboratory Animals, Shanghai 201203, China)

Objective To investigate the correlation between Pseudomonas aeruginosa epidemic strains and host in recent years, Pseudomonas aeruginosa in rat and mice from several faciliies of Shanghai and Jiangsu province were isolated and detected by pulsed field gel electrophoresis (PFGE).MethodsThe bacteria were isolated from the contents of ileocecal junction under aseptic conditions. The isolated strains were identified by morphological observation and physicochemical test. Extracted genomic DNA of Pseudomonas aeruginosa isolates were detected by PFGE after digested by Xba I restriction enzyme.ResultsA total of 67 strains were isolated from rats and mice. The genotype of 67 strains was divided into 39 patterns and 14 clusters (A-N). The dominant cluster is I, H, B and G, the rate of these cluster were 17.9%(12/67), 14.9%(10/67), 13.4%(9/67) and 11.9%(8/67) respectively. The isolates from the same source mostly present different gene cluster.ConclusionA great deal of gene polymorphism could be found in all the 67 strains which are diffusively distributed. Obvious prevalent feature could not be found.

Pseudomonas aeruginosa; Pulsed field gel electrophoresis (PFGE); Molecular subtyping

Q95-33

A

1674-5817(2016)06-0419-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.06.003

2016-07-22

上海市科技創新行動計劃(14140900600、12140900500), 上海市科委研發平臺專項(15DZ2292400)

馮 潔(1981-), 女, 副研究員。E-mail: moyifj@163.com

高 誠(1961-), 男, 研究員。E-mail: gaocheng@slarc.org.cn