腹瀉樹鼩腸道阿米巴原蟲攜帶情況調查

宋慶凱, 苗雨潤, 尹博文, 陳玲霞, 代解杰, 孫曉梅

(中國醫(yī)學科學院/北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)學生物學研究所樹鼩種質資源中心,

云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點實驗室, 昆明650118)

腹瀉樹鼩腸道阿米巴原蟲攜帶情況調查

宋慶凱, 苗雨潤, 尹博文, 陳玲霞, 代解杰, 孫曉梅

(中國醫(yī)學科學院/北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)學生物學研究所樹鼩種質資源中心,

云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點實驗室, 昆明650118)

目的 調查腹瀉樹鼩腸道中阿米巴原蟲攜帶情況，查找可能導致樹鼩腹瀉的寄生蟲類病原，為實驗樹鼩的寄生蟲質量控制提供依據(jù)。方法 采集78只腹瀉樹鼩新鮮糞便和全血，分離血清，其中野生來源樣本45份，人工繁育樣本33份。分別采用生理鹽水涂片法、碘液染色法進行阿米巴原蟲形態(tài)學檢測，采用ELISA方法進行糞便中阿米巴抗原和血清中IgG抗體檢測。結果 形態(tài)學鏡檢結果顯示，野生來源和人工繁育腹瀉樹鼩腸道中阿米巴原蟲攜帶率分別為42.22%(19/45)、33.33%(11/33); 經ELISA檢測糞便中阿米巴抗原，阿米巴原蟲攜帶率分別為64.44%(29/45)、42.42%(14/33)。采用ELISA糞便抗原檢出率高于形態(tài)學鏡檢法。經ELISA檢測血清IgG抗體陽性率分別為66.67%(30/45)、63.63%(21/33)。結論 腹瀉樹鼩對阿米巴原蟲的攜帶率較高，該原蟲可能是導致樹鼩腹瀉的病原之一。日常飼養(yǎng)過程中應加強阿米巴病的監(jiān)測和防治，防止腸道寄生蟲病的傳播。

樹鼩; 阿米巴原蟲; 形態(tài)學檢測; ELISA檢測

樹鼩(Tupaia belangeri)作為與靈長類動物親緣關系最近的新型模式動物，在人類疾病模型尤其是感染性疾病模型研究中發(fā)揮著不可或缺的作用，已逐步成為生物醫(yī)學研究的熱點[1]。然而迄今為止，有關樹鼩寄生蟲的感染種類、感染程度、致病性以及防治等方面的研究報道比較有限，這極大的阻礙了樹鼩成為標準化實驗動物的進程，也使研究結果的可靠性和可重復性受到影響，限制了樹鼩在疾病機理研究和藥物研發(fā)中的更深層次的應用[2,3]。因此對樹鼩攜帶的寄生蟲進行更加全面和深入的研究迫在眉睫。前期研究表明，樹鼩對原蟲具有較高的感染率，陳玲霞[4]等曾報道樹鼩攜帶有大量的鞭毛蟲，在日常飼養(yǎng)中作者也見到樹鼩經常出現(xiàn)腹瀉的情況, 并在糞便顯微鏡檢查中經常觀察到類似于阿米巴形態(tài)的原蟲。為進一步證實這一事實而開展本次研究。

腸阿米巴病(intestinal amebiasis)主要是由溶組織內阿米巴寄生在結腸內，引起阿米巴痢疾或阿米巴結腸炎的一種人獸共患寄生蟲病[5-7]。該病分布范圍廣，易感動物較多，呈世界性流行傳播，其病死率在原蟲寄生蟲病感染中僅次于瘧疾[8]。當動物機體感染致病性阿米巴原蟲后,可出現(xiàn)侵襲性的癥狀，也可處于一種無癥狀的帶蟲狀態(tài)。樹鼩作為實驗動物，那些受感染的個體有可能成為潛在的阿米巴病的傳染源,影響其他動物甚至人類的健康。因此,有必要對樹鼩進行阿米巴原蟲的流行病學調查，為探明腹瀉病原、制定樹鼩質量標準和質量監(jiān)測提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

野生來源成年樹鼩45只，在普通級環(huán)境設施中僅飼養(yǎng)了3個月，體質量120～150 g, 人工繁育的樹鼩33只, 年齡為3～4月齡, 體質量90～110 g,為剛離乳的幼樹鼩，實驗樹鼩均由醫(yī)學生物學研究所樹鼩種質資源中心提供[SCXK(滇)K2013-0001]。樹鼩在日常觀察中常伴有腹瀉癥狀，少數(shù)出現(xiàn)醬色樣糞便。實驗操作在醫(yī)學生物學研究所樹鼩種質資源中心實驗設施進行[SYXK(滇) K2013-0001]。

1.2 儀器及試劑

Eclipse 80i Nikon 顯微鏡，SMZ1500 Nikon 體視鏡(日本)，Power WaveXS2酶標儀(美國)，F(xiàn)orma恒溫培養(yǎng)箱(美國)，CT15RE 低溫離心機(日本)。人阿米巴IgG抗體(Amebiasis IgG)、人阿米巴抗原(Amebiasis Ag)酶聯(lián)免疫分析試劑盒(購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集 糞便標本: 抓取并保定樹鼩，多數(shù)樹鼩在抓取過程中因緊張而主動排出糞便，對無糞便者可輕輕按摩其腹部使其排便。每只采取豌豆粒大小新鮮糞便標本。

血液標本: 抓取并保定樹鼩, 尾靜脈采集0.2 mL血液置于1.5 mL無菌離心管中, 然后放在37 ℃孵箱中30 min, 4 ℃冷藏4 h, 3 500 r/min離心10 min，小心分離最上層血清于干凈無菌離心管。

1.3.2 光學顯微鏡檢查 直接涂片法: 加1～2滴生理鹽水于潔凈的載玻片中央，挑取標本，在生理鹽水中涂抹成糞便膜，厚度以透過糞便薄膜能看清字為宜，加蓋玻片后顯微鏡下觀察。

碘液染色法: 可疑樣本用碘液染色, 制片方法同直接涂片法, 檢測是否存在阿米巴原蟲包囊或滋養(yǎng)體。

1.3.3 ELISA糞便抗原檢測法 應用雙抗體夾心法測定標本中人阿米巴抗原(Amebiasis Ag)表達情況。在1.5 mL離心管中加入200 μL樣品稀釋液，取固態(tài)糞便約50 mg置入稀釋液中混勻(若液體糞便則取100 μL)，靜置數(shù)分鐘后，取上清液直接用于檢測。操作程序和結果判斷按試劑盒說明書進行。

1.3.4 ELISA血清抗體檢測法 應用雙抗原夾心法測定標本中人阿米巴IgG抗體(Amebiasis IgG)的表達，用酶標儀在450 nm 波長下測定吸光度(A 值)，操作程序和結果判斷按試劑盒說明書進行。

2 結果

2.1 形態(tài)學檢測結果

形態(tài)學觀察多見包囊，呈圓球形，直徑為5～20 μm，細胞質呈泡沫狀，多數(shù)囊內含核1～4個。圖1A所示為樹鼩糞便中典型4核包囊形態(tài)，內還有大小不等兩端鈍圓的棒狀擬染色體，經碘染后包囊呈淡黃綠色。少數(shù)樣本中能觀察到滋養(yǎng)體，大小30～50 μm，內外質分界明顯，外質較透明，內質呈顆粒狀，一般含有1核。偽足呈寬指狀，運動活躍，內含吞噬的紅血球。圖1B為碘染的滋養(yǎng)體形態(tài)。通過顯微鏡觀察野生來源和人工繁育腹瀉樹鼩糞便45份、33份，阿米巴原蟲攜帶率分別為42.22%(19/45)、33.33%(11/33)。

圖1 碘液染色法Figure 1 Iodine-stain smear

2.2 ELISA糞便抗原檢測結果

阿米巴原蟲攜帶結果見表1。

2.3 ELISA血清IgG抗體檢測結果

阿米巴原蟲抗體陽性率結果見表1。

表1 2種抗原檢測方法及IgG抗體檢測結果Table 1 The results of two kinds of antigen and IgG antibody detection

3 討論

寄生于機體消化道內的阿米巴原蟲種類很多,有溶組織內阿米巴(Entamoeba histolytica，E.h)、迪斯帕內阿米巴(Entamoeba dispar)、結腸內阿米巴(Entamoeba coli)、哈門氏內阿米巴(Entamoeba hartmanni)、微小內蜒阿米巴(Entamoeba nana)和齒齦內阿米巴(Entamoeba gingivalis)等, 但是只有E.h具有致病性，在宿主免疫力低下時，可引起急性暴發(fā)性阿米巴腸病，并可侵犯肝、肺、腦等其他器官，引起腸外阿米巴病[9]。調查結果顯示，腹瀉樹鼩腸道中多有阿米巴原蟲的存在，且攜帶率較高，說明阿米巴原蟲尤其是其中的溶組織內阿米巴可能是引起樹鼩腹瀉的病原，這與它的棲息環(huán)境和食性密切相關[10]，因為野生來源樹鼩主要生活在村落附近灌木叢林，喜食昆蟲，很有可能因食用含有成熟包囊的糞便污染食物、飲水而感染。因此，對腹瀉樹鼩開展阿米巴原蟲攜帶情況調查和檢測方法研究，對指導阿米巴原蟲監(jiān)測與防治提供依據(jù)是非常必要。

本文采用直接涂片和碘液涂片法作為檢測腸道阿米巴原蟲的首選方法，這也是臨床上該病原檢測的金標準。雖然該法簡單易操作, 但存在兩方面的不足：其一是僅從形態(tài)學上不易區(qū)分致病性的阿米巴與非致病性阿米巴[11,12]，其二是檢出率低。針對不同阿米巴原蟲包囊形態(tài)容易混淆的問題，今后將進一步開展對阿米巴原蟲的PCR檢測[13]，可根據(jù)阿米巴原蟲的SSU-rRNA 序列設計引物，進行巢式PCR擴增，對PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，并對陽性產物進行測序最后進行序列比對分析，從分子生物學的角度進一步驗證。針對鏡檢率低的問題，聯(lián)合采用ELISA試劑盒進行糞便中抗原檢測，并檢測了血清中IgG抗體以進一步獲得可靠的數(shù)據(jù)。兩種抗原檢測結果對比顯示，ELISA法檢測糞便中的抗原陽性檢出率大于鏡檢結果，說明鏡檢容易漏檢。雖然鏡檢方法操作簡單、經濟實惠，但檢測過程耗費時間較長且需要檢測人員具備一定的篩查經驗，不適合進行大規(guī)模的篩查活動，相比而言ELISA糞便抗原檢測法檢出率更高且方便快捷，更適合對樹鼩種群進行大規(guī)模的溶組織阿米巴的篩查。此外，ELISA法檢測血清阿米巴抗體可作為檢測阿米巴病的輔助診斷方法，IgG抗體在阿米巴感染一段時間后仍持續(xù)存在，故而檢出率相對抗原檢測方法更高。

結合三種方法的檢測結果分析，樹鼩阿米巴原蟲的攜帶率較高。究其原因是由于阿米巴原蟲的傳播性較強，野生來源樹鼩在野外就已經感染，并且一旦感染, 在不借助藥物治療的情況下難以根除。野外樹鼩引入實驗室后人工繁育的子代仍然存在較高的攜帶率，一方面由于仔樹鼩免疫系統(tǒng)尚未完善，而且阿米巴病為條件致病，在自身免疫力低下的情況下更易感，另一方面與受感染的母親共同生活在同一環(huán)境增加了被感染幾率。

本研究結果提示，為了更好降低阿米巴原蟲的攜帶率，減少由致病性阿米巴原蟲導致的腹瀉疾病發(fā)生，在樹鼩飼養(yǎng)過程中可根據(jù)實際情況定期添加抗原蟲藥物來進行防治; 同時應加強樹鼩生活環(huán)境的清潔消毒工作，按時清洗樹鼩飲用水盒料盒，阻斷傳播途徑; 同時，定期通過多種方法綜合監(jiān)測，以降低阿米巴病原對實驗樹鼩的危害。

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Survey on Intestinal Amoeba in Diarrhea Tree Shrews

SONG Qing-kai, MIAO Yu-run, YIN Bo-wen, CHEN Ling-xia, DAI Jie-jie, SUN Xiao-mei
(Center of Tree Shrews Germplasm Resources, Institute of Medical Biology, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Yunnan Key Laboratory of Vaccine Research & Development on Severe Infection Diseases, Kunming 650118, China)

Objective To investigate the infection status of intestinal Amoeba in diarrhea tree shrews from the center of germplasm resources, to find out the cause of diarrhea, and to provide useful reference and support for prevention and treatment of parasitic infection in tree shrews. MethodsTotally 78 samples were collected from the fecal and blood of diarrhea tree shrews, and then were detected by the normal saline direct smear method and iodine solution staining, meanwhile stool antigen and IgG antibody in serum were detected by ELISA of Amoeba.ResultsThe results showed that the positive infection rate were 42.22%(19/45) of wild tree shrews, 33.33%(11/33) of breeding of tree shrews by direct smear and iodine staining method. The infectious rates of E. histolytica were 64.44%(29/45) and 42.42%(14/33) respectively when detected the stool antigen by ELISA. The positive rate of Amoeba IgG were 66.67% (30/45) and 63.63%(21/33) by ELISA detection.ConclusionsAmoeba infection rate is rather high in tree shrews, and it may be one of the pathogens of diarrhea tree shrews. In routine breeding should be strengthened in the process of testing control the spread of the parasite.

Tree shrews; Amoeba; Morphological detection; ELISA detection

R33 Q95-33

A

1674-5817(2016)06-0415-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.06.002

2016-07-16

國家科技支撐計劃(2014BAI01B01), 云南省聯(lián)合支持國家計劃項目(2015GA009)

宋慶凱(1991-), 男, 碩士, 研究方向: 實驗動物病原學研究。 E-mail: 869188548@qq.com

孫曉梅(1963-), 女, 主任技師。E-mail: sxm@imbcams.com.cn