3D生物打印技術在腦膠質瘤研究中的應用

黃 慶，康慧斌，張洪兵

（首都醫科大學附屬北京潞河醫院神經外科，北京101149）

3D生物打印技術在腦膠質瘤研究中的應用

黃 慶，康慧斌，張洪兵

（首都醫科大學附屬北京潞河醫院神經外科，北京101149）

3D生物打印技術是近期在國內外興起的一項新的研究技術，已經運用到多個醫學相關領域.腦膠質瘤是最常見的顱內腫瘤之一，該病具有易復發、預后差的特點，目前仍有許多研究的瓶頸問題和關鍵點難以克服.3D生物打印技術在腦膠質瘤研究中的應用還處于初期探索階段，主要集中在腫瘤模型制作并檢測腫瘤細胞對各種抗腫瘤藥物敏感性和耐藥性等方面.本文就近期3D生物打印技術在腦膠質瘤研究領域的應用情況做了初步回顧，并就其發展前景進行了展望.

3D生物打印；腦膠質瘤；應用

1 腦膠質瘤的流行病學與研究難點

腦膠質瘤是最常見的顱內腫瘤之一，據四川大學華西醫院王翔等［1］統計，2008～2013年在我國四川省各大醫院收治的中樞神經系統腫瘤中，神經上皮來源的腫瘤是第一大類腫瘤，占全部中樞神經系統腫瘤的近1／3，其中，膠質母細胞瘤占第一位（38.14%），其次分別為彌漫性星形細胞瘤（15.21%），間變性星形細胞瘤（8.83%），以及毛細胞型星形細胞瘤（6.57%）等.另據美國腦腫瘤注冊中心（CBTRUS）統計顯示［2］，2009～2013年美國40歲以上人群中，中樞神經系統腫瘤年發病率為40.10人／每10萬人，年死亡率為8.89人／每10萬人，其中，最常見的顱內惡性腫瘤為膠質母細胞瘤（46.6%），而在19歲以下腦腫瘤患者中，其發生率可高達47.4%.該病發病率、死亡率高，治愈率低，具有高度異質性，常為浸潤性生長，邊界不清，治療后常常復發，術后生存期較短，膠質母細胞瘤5年存活率僅為5.5%，接受標準化治療的患者中位生存期僅為14.6個月，低級別膠質瘤雖然生長緩慢，但有易復發和向高級別進展的可能，患者生存期3～5年不等.該病易復發、預后差的難題仍未完全攻克，這主要是由于膠質瘤呈浸潤式生長，難以全部切除，而血腦屏障阻礙了大部分藥物進入腫瘤局部發揮作用的結果.因此，深入分析膠質瘤的生物學特性，精準地給予腫瘤定位及相應治療是當前腦膠質瘤研究的熱點和難點.

2 腦膠質瘤研究的新技術

近十年來，膠質瘤的診斷和治療技術得到很大的發展，產生了包括納米技術［3］、免疫治療技術［4］、3D打印技術［5］、靶向治療技術［6］等在內的許多新技術，其中，3D打印技術越來越受到國內外學者的重視.

3D打印技術是目前國際上發展最迅猛的幾項新興技術之一，被認為是引領“第四次工業革命”的最強推動力［7－8］.近年來，該技術在醫學領域的應用越來越深入，在生物組織打印、器官模型制作等方面發展迅速，已有神經外科、心臟外科、骨科、肝膽外科、泌尿外科等開始研究制作器官三維立體模型輔助診斷與治療，比如：美國國家醫療中心專家應用該技術成功構建了先天性心臟病患者的心臟模型，外科醫生利用此模型在術前對患者復雜的心臟結構進行深入的模擬分析，美國密歇根大學醫學院研究人員利用該技術3D打印了支氣管支架，并獲得了美國食品藥物管理局（FDA）批準，成功為1名先天性支氣管軟化癥患兒移植了3D打印支氣管支架，近期還有成功打印椎間盤、主動脈瘤、腦動脈瘤等組織器官3D模型的報道［9－12］.在腦膠質瘤研究領域，王振等［13］報道了應用3D打印技術治療包括膠質瘤在內的3例腦干腫瘤的臨床研究報告，他們在術前對患者行頭部CTA和MRI檢查，然后把數據導入Mimics軟件中進行3D模型重建，圍繞術區構建患者腫瘤組織、顱骨、臨近區域的血管，并以此為基礎設計手術入路，為術者提供了立體直觀的術前評估手段，增加了手術的安全性.

而3D生物打印技術則是在常規3D打印模型的基礎上應用3D生物打印機制作出含有細胞成分并具有生物學活性的產品，該技術的核心是生物磚，即一種新型的、精準的、具有仿生功能的干細胞培養體系，它是以種子細胞（干細胞、已分化細胞等）、生長因子和營養成分等多組份組成的“生物墨汁”，再結合其他材料層層打印出的產品，經打印后培育處理，形成具有生理功能的組織結構［5，13－15］.提出細胞和器官3D打印的“概念之父”是美國克萊姆森大學托馬斯·波蘭教授，他指導自己的博士生、清華大學的徐弢教授通過3D打印技術利用心肌細胞和特定的生物材料成功打印出一顆能夠有節奏地跳動的心臟；美國韋克福雷斯特大學團隊近期利用3D生物打印技術復制出人造耳朵、骨骼、肌肉等組織器官，成功移植到動物體內并保持了生物活性；四川大學華西醫院康裕建教授團隊采用動物自體的脂肪源性間充質干細胞制備出個體化的3D生物打印墨汁，在自主研發的3D生物血管打印機上成功復制出具有生物活性的恒河猴自體血管，將該血管通過手術移植到動物體內，實現了血管的再生.

目前，3D生物打印技術在腦膠質瘤研究中的應用還處于初期探索階段，主要集中在腫瘤模型制作并檢測腫瘤細胞對各種抗腫瘤藥物敏感性和耐藥性等方面［16］.腦膠質瘤模型的制作對于探討該病發生、發展的機制，建立新的治療手段，促進臨床研究的深入發展都極為重要.理想的膠質瘤模型應該具備以下幾個生物學特性和化學特性［17］，即腫瘤的形態學特征具有高度一致性，各代的移植瘤與初代接種的腫瘤細胞在形態學、核分裂相、腫瘤間質和血管等結構上高度近似；腫瘤的遺傳學特征具有高度一致性，傳代移植的腫瘤細胞染色體與初代接種的腫瘤細胞染色體要高度近似；腫瘤細胞的增殖動力學特征具有高度一致性，各代移植瘤細胞在細胞周期、時相比例、分裂指數和倍增時間等方面要高度近似；腫瘤的標記物具有高度一致性，移植瘤與初代接種的腫瘤細胞應在一些膠質瘤特有生化指標的定性或定量方面保持高度近似；駐瘤模型應具有高度穩定性，腫瘤細胞經過多次連續培養傳代后，細胞存活率與移植成功率高，無自然消退等現象.

近年來，國內外學者采用多種方式制作了不同的腦膠質瘤模型，其中包括：大鼠／小鼠腦膠質瘤（C6、9L、T9和F98等細胞株）模型、裸鼠腦膠質瘤原位（U87R細胞株）模型、斑馬魚原位膠質瘤（U87R細胞株）模型、低級別腦膠質瘤組織塊法原代培養（IDH 1／2突變型膠質瘤細胞株）等［18－20］，但上述模型仍不能很好地模擬膠質瘤的生物學特性，其中很重要的一個因素即目前絕大多數的研究層面為二維空間，對于腫瘤細胞的空間分布及其相互作用不能完整體現，不能很好地在體或體外構建膠質瘤生物模型，因此，3D生物打印技術被引入腦膠質瘤模型研究之中.

3 3D生物打印技術在腦膠質瘤研究中的初步應用

通過基于細胞和組織的3D生物打印技術目前主要采用攜帶細胞的水凝膠3D沉積技術，直接攜帶細胞打印這種技術相比于以往在已成型的支架中種植細胞，可以獲得更高的細胞存活率和細胞密度.Dai等［16］近期采用3D生物打印方式成功將膠質母細胞瘤干細胞培養放置在明膠／海藻酸／纖維蛋白原水凝膠的基質構建的模型中，發現3D生物打印細胞培養模式下的膠質瘤干細胞存活率為86.92%，這些腫瘤細胞保留了原有的遺傳學特點，還能夠表達出細胞特異性的分子標記，如血管生成因子VEGF，同時具有較高的細胞增殖活性，3D生物打印培養模式的膠質瘤干細胞較2D培養模式具有更強的耐藥性.Loess?ner等［21］也成功運用水凝膠材料做為細胞外基質，在體外將腫瘤細胞構建成三維模式.不過，由于膠質瘤生物模型中存在細胞?細胞間、細胞?基質間、時間與空間、代謝梯度、機械阻力等多種因素的相互作用，應用3D生物打印技術復制腦膠質瘤模型仍有許多亟待解決的問題，包括：具有多噴頭的3D生物打印機的研發、作為3D打印基質的新一代成型材料的探索、腫瘤打印核心區域細胞存活率的保持、細胞生物孵化器的改進等.

4 3D生物打印技術的制約因素與發展展望

3D生物打印機是進行3D細胞生物打印的基礎，目前國內外已經成型的該類打印機包括：瑞士RegenHU BIOFACTORY細胞生物打印機、Regenvov公司的3D生物打印工作站、新加坡Bio3D Technolo?gies公司的Bio3D Life?Printer細胞生物打印機、邁普MP?BIOPRINT3.0細胞生物打印機、Organovo公司的NovoGen MMXTM細胞生物打印機、藍光英諾的3D生物血管打印機等［5，12，22］.這些打印機主要采用基于噴墨技術的生物打印工藝，具備可任意定制并自動切換的多噴頭系統、多軸運動平臺、多區段溫度控制與壓力調控等，將細胞懸液或生物材料作為生物磚（生物墨汁），通過加熱或壓電的方式將打印材料滴出成形，提供細胞生長所需的微環境，在一定程度上提高了3D打印細胞更高的存活率和結構與功能的穩定性，但這些設備在生物打印細胞過程中的可操控性和機械穩定性仍有待進一步提升.

作為細胞外基質的生物材料是影響3D腫瘤生物打印的關鍵因素之一［23］，細胞外基質形成三維多孔支架空間，提供力學支撐，使腫瘤細胞增殖、分化、遷移和粘連，促進細胞長入、基因表達.理想的生物材料應該具備良好的生物相容性、生物響應性、降解性能和力學特性等，能夠滿足腫瘤細胞的3D成型支撐，保證模型表面或核心的細胞具有很高的存活率，目前最常用的明膠／海藻酸／纖維蛋白原水凝膠基質可以初步滿足3D細胞生物打印要求，但打印在基質中的細胞與細胞之間的聯系受到一定的影響，天壇醫院張東團隊與我們近期共同進行的研究初步發現將干細胞打印種植于海藻酸鹽基質表面較種植于該基質中具有更高的細胞存活率，提示目前常用的3D打印基質仍有很大的缺陷，尤其是該基質在模型后期的支撐性及其對鈣離子的依賴性對于細胞活性的影響仍有待進一步解決，因此，尋找新的3D成型支撐材料是該模型研究的關鍵點之一.

腫瘤模型打印后，需要置入細胞生物孵化器中進一步培育，這種生物孵化器應高度近似于腫瘤體內生長微環境，含有各種理化成份與生長因子，由此孕育出的腫瘤模型才能夠更接近體內腫瘤.美國NASA發明了一種旋轉細胞培養系統，通過模擬微重力，將細胞維持在一個動態的懸液環境，獲得低剪切力的培養環境，這是一種全新的體外三維細胞培養模式，該系統較靜態培養和其他動態培養方式更容易使細胞分化和維持三維立體結構，有利于目標細胞聚集生長為類似體內的組織結構.而目前國內還沒有產生自主知識產權的細胞生物孵化器，完全依賴于國外的同類產品.

因此，3D生物打印技術應用于腦膠質瘤的研究仍任重而道遠，生物材料學的進步、細胞生物孵化器的改進、3D生物打印機的發展是其中幾個制約發展的關鍵因素，在今后的研究中，如果能與包括納米技術、人工智能技術、醫學仿生工程技術等在內的其他新興技術相結合，該技術將會有更廣闊的發展空間.

［1］王 翔，周 橋，劉艷輝，等.2008～2013年四川省中樞神經系統腫瘤病理確診病例統計報告［J］.中華神經外科雜志，2015，31（12）：1195－1200.

［2］Ostrom QT，Gittleman H，Fulop J，et al.CBTRUS statistical report：primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2008－2012［J］.Neuro Oncol，2015，17 Suppl 4：iv1－iv62.

［3］涂艷陽，祁 婧，張永生，等.膠質瘤納米治療技術的研究現狀與發展前景［J］.轉化醫學電子雜志，2016，3（9）：1－4.

［4］張 倩，曹 蓓.膠質瘤的免疫治療研究進展［J］.中華神經醫學雜志，2016，15（8）：856－859.

［5］Ji S，Guvendiren M.Recent advances in bioink design for 3D bioprinting of tissues and organs［J］.Front Bioeng Biotechnol，2017，5：23.

［6］蔣建利，付之光.抗腫瘤小分子靶向藥物及靶點研究進展［J］.轉化醫學電子雜志，2016，3（1）：5－8.

［7］Wang J，Goyanes A，Gaisford S，et al.Stereolithographic（SLA）3D printing of oral modified?release dosage forms［J］.Int J Pharm，2016，503（1－2）：207－212.

［8］Goyanes A，Wang J，Buanz A，et al.3d printing of medicines：engi?neering novel oral devices with unique design and drug release char?acteristics［J］.Mol Pharm，2015，12（11）：4077－4084.

［9］Ayub A，Al?Ayoubi AM，Bhora FY.Stents for airway strictures：selection and results［J］.J Thorac Dis，2017，9（Suppl 2）：S116－S121.

［10］Suchyta M，Mardini S.Innovations and future directions in head and neck microsurgical reconstruction［J］.Clin Plast Surg，2017，44（2）：325－344.

［11］Vukicevic M，Mosadegh B，Min JK，et al.Cardiac 3D printing and its future directions［J］.JACC Cardiovasc Imaging，2017，10（2）：171－184.

［12］Hong N，Yang GH，Lee J，et al.3D bioprinting and its in vivo applications［J］.J Biomed Mater Res B Appl Biomater，2017.

［13］王 振，孫靖馳，李靖遠，等.3D打印技術在腦干腫瘤手術治療中臨床應用［J］.臨床軍醫雜志，2017，45（2）：172－175.

［14］Datta P，Ayan B，Ozbolat IT.Bioprinting for vascular and vascular?ized tissue biofabrication［J］.Acta Biomater，2017，51：1－20.

［15］Patra S，Young V.A review of 3D printing techniques and the future in biofabrication of bioprinted tissue［J］.Cell Biochem Biophys，2016，74（2）：93－98.

［16］Dai X，Ma C，Lan Q，et al.3D bioprinted glioma stem cells for brain tumor model and applications of drug susceptibility［J］.Biofab?rication，2016，8（4）：045005.

［17］Molinaro AM，Wrensch MR，Jenkins RB，et al.Statistical consider?ations on prognostic models for glioma［J］.Neuro Oncol，2016，18（5）：609－623.

［18］Thompson EG，Sontheimer H.A role for ion channels in perivascular glioma invasion［J］.Eur Biophys J，2016，45（7）：635－648.

［19］Chen F，Becker A，LoTurco J.Overview of transgenic glioblastoma and oligoastrocytoma CNS models and their utility in drug discovery［J］.Curr Protoc Pharmacol，2016，72：14.37.1－12.

［20］Katakowski M，Chopp M.Exosomes as tools to suppress primary brain tumor［J］.Cell Mol Neurobiol，2016，36（3）：343－352.

［21］Loessner D，Meinert C，Kaemmerer E，et al.Functionalization，preparation and use of cell?laden gelatin methacryloyl?based hydro?gels as modular tissue culture platforms［J］.Nat Protoc，2016，11（4）：727－746.

［22］Zhang X，Zhang Y.Tissue engineering applications of three?dimen?sional bioprinting［J］.Cell Biochem Biophys，2015，72（3）：777－782.

［23］Zhang YS，Duchamp M，Oklu R，et al.Bioprinting the cancer micro?environment［J］.ACS Biomater Sci Eng，2016，2（10）：1710－1721.

Application of 3D bioprinting technology in the research of glioma

HUANG Qing，KANG Hui?Bin，ZHANG Hong?Bing
Department of Neurosurgery，Beijing Luhe Hospital，Capital Med?ical University，Beijing 101149，China

The technology of 3D bioprinting is a new research technique in recent years，and it has been applied to many medical fields.Glioma is one of the most common intracranial tumor，and it has the characteristics of easy recurrence and poor prognosis.There are still many bottlenecks and key points which cannot be overcomed.The application of 3D bioprinting in the study of glioma is still in the initial stage of exploration.And it mainly focuses on simulating the tumor models and detecting the sensitivity and drug resistance of the tumor cells for antineoplastic drugs.This review preliminarily focuses on the aspect of 3D bioprinting，which has been applied in the study of glioma，and provides the prospect for its development.

3D bioprinting；glioma；application

R739.41

A

2095?6894（2017）07?61?03

2017－05－11；接受日期：2017－05－26

首都臨床特色應用研究與成果推廣項目（Z171100001017044）；北京市通州區科技計劃項目國自然攻堅專項（KJ2017CX039?10）；北京市通州區衛生發展科研專項重點課題（TWKY?2016?ZD?01?10）

黃 慶.博士，主任醫師，副教授.研究方向：神經外科.E?mail：doctor＿huang＠163.com