明黨參根皮中五種香豆素對H2O2誘導(dǎo)的HUVEC的保護作用研究

王萌

摘要：目的：研究從明黨參根皮超臨界提取物中分得的5個香豆素化合物對體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）氧化應(yīng)激損傷的保護作用，以為其在動脈粥樣硬化疾病上的運用提供理論依據(jù)。方法：以過氧化氫（H2O2）為氧化劑建立HUVEC細胞氧化應(yīng)激損傷（OSI）模型，細胞種板經(jīng)過24h孵育貼壁后，將細胞分為正常對照組、H2O2氧化損傷組、實驗藥物組，其中實驗藥物組給予藥物預(yù)培養(yǎng)24h后，加入500μmol·L-1 H2O2，繼續(xù)培養(yǎng)4h后MTT法檢測細胞存活率。結(jié)果：5種呋喃香豆素均能改善H2O2所致的HUVEC細胞形態(tài)學(xué)損傷，提高細胞存活率，其中歐前胡素效果最好，能使細胞存活率提高22%。結(jié)論：5種呋喃香豆素具有保護血管內(nèi)皮細胞免受過氧化損傷的作用。

Abstract： Objective： To study the protective effects of five coumarins compounds from the supercritical fluid extract of Changium smyrnioides Wolff root bark on oxidative stress injury of cultured human umbilical vein endothelial cells （HUVECs） in vitro， to provide a theoretical basis for its application in atherosclerotic disease. Methods： The oxidative stress injury （OSI） model of HUVEC cells was established by using hydrogen peroxide （H2O2） as oxidant. After 24 hours incubation， the cells were divided into normal control group， H2O2 oxidative injury group， experimental drug group. After 24 h of incubation， 500 μmol·L-1 H2O2 was added to the experimental group. The cell viability was measured by MTT assay after 4 h. Results： All the five furocoumarins could improve the morphological damage of HUVEC cells induced by H2O2， and the cell viability was improved. The effect of imperatorin was the best， and the cell survival rate was increased by 22%. Conclusion： The five furocoumarins have protective effects on endothelial cells from peroxidative injury.

關(guān)鍵詞：明黨參根皮；香豆素；內(nèi)皮細胞；氧化應(yīng)激損傷；保護作用

Key words： Changium smyrnioides Wolff；coumarin；endothelial cell；oxidative stress injury；protective effect

中圖分類號：R284 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1006-4311（2016）36-0132-03

0 引言

明黨參Changium smyrnioides Wolff為傘形科明黨參屬藥用植物，根供藥用，始載于明、清時期，為歷版《中國藥典》的名貴中藥，主產(chǎn)于江蘇、浙江、安徽三省，具有“補氣生津，潤肺化痰，平肝和胃，消腫解毒”的功效[1]。由于人類挖掘和生境的破壞，其分布區(qū)和個體數(shù)量正日益減少，近年來其種群呈現(xiàn)明顯衰退傾向，1984年被列入國家三級瀕危保護植物[2]。目前國內(nèi)外對明黨參根、莖葉、果實的研究已有文獻報道[3-5]，但對其加工廢棄的根皮的研究尚未見報道。前期本課題組從明黨參根皮中分離得到五種呋喃香豆素類成分，分別是珊瑚菜內(nèi)酯、花椒毒酚、歐前胡素、5-羥基-8-甲氧基補骨脂素、異歐前胡素。為了探討這5種化合物的體外活性，本研究以H2O2作為氧化劑，建立HUVEC細胞的OSI模型，觀察不同濃度的呋喃香豆素對此細胞的保護作用。

1 材料、儀器與試劑

1.1 實驗材料

5種呋喃香豆素類成分，分別為珊瑚菜內(nèi)酯、花椒毒酚、歐前胡素、5-羥基-8-甲氧基補骨脂素、異歐前胡素，由本實驗室從明黨參根皮中分離得到，它們的結(jié)構(gòu)通過1H-NMR，13C-NMR和MS確定，并且通過液相色譜分析其純度均大于98%。5種呋喃香豆素用超純水配置成終濃度分別為0.01μmol·L-1、0.1μmol·L-1、1μmol·L-1、5μmol·L-1的一系列溶液（DMSO助溶）。

細胞株：人臍靜脈內(nèi)皮細胞株（HUVEC）為本校基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院保存細胞株。

1.2 主要儀器和試劑

超凈工作臺：SW-CJ-1F，蘇州凈化；

CO2細胞孵育箱：MCO-20AIC，SANYO，Japan；

倒置生物顯微鏡：CKX31SF，Olympus Corporation，Japan；

酶標(biāo)儀：Model680，BIO-RAD，USA；

DMEM培養(yǎng)基：Gibco，USA；

超低溫冰箱：Forma-86CULTFreezer，Thermoelectron corporation，USA；

新生牛血清：NBS，杭州四季青生物工程材料有限公司；

高速冷凍離心機：CP80MX，Hitachi Koki Co. Ltd；

雙抗：青-鏈霉素，Amresco，USA；

平板式離心機：SorvallST16centrifuge，Thermo Fisher Scientific，USA；

胰蛋白酶：Gibco，USA；

熒光顯微鏡：1X70，Olympus Corporation，Japan；

磷酸鹽緩沖液（PBS溶液）：自制；

四甲基偶氮唑（MTT）：Biosharp，USA；

二甲基亞砜（DMSO）：Amresco，USA；

H2O2：30%，AR級，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng)和傳代

常規(guī)方法復(fù)蘇凍存的HUVEC細胞，用含10%新生牛血清（FBS），（鏈霉素100mg·L-1）/青霉素（1×105IU·L- 1）的DMEM培養(yǎng)基在37℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。將生長良好的HUVEC用胰蛋白酶消化2～3min后，輕輕吹打，制成細胞懸液，每周傳代2～3次。待細胞狀態(tài)穩(wěn)定后移至96孔培養(yǎng)板上，分組實驗。

2.2 藥物濃度范圍的選擇

將細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期和80%融合度后，以0.25%胰酶溶液消化，用含10%新生牛血清的相應(yīng)培養(yǎng)液制成單細胞懸液，進行細胞計數(shù)后，將細胞濃度調(diào)整為5×104個/ml。以每孔100μL的體積接種于96孔板，培養(yǎng)24h。實驗組加入不同濃度的藥物，每孔20μL，對照組加入等體積的超純水，培養(yǎng)24h。每孔加入1g·L-1 MTT溶液20μL，37℃繼續(xù)孵育4h，棄去上清液，每孔加入150μL DMSO，用渦旋振蕩器振蕩搖均勻后，用酶標(biāo)儀在490nm波長處測定各孔吸光度值，并計算細胞存活率（%）。

2.3 H2O2濃度的篩選

HUVEC細胞按5×103個/孔接種于96孔板，培養(yǎng)24h貼壁后加入不同濃度的H2O2（100μmol·L-1、300μmol·L-1、500μmol·L-1、700μmol·L-1、900μmol·L-1）造模，并設(shè)置對照組，孵育4h后加入MTT，4h后吸棄上清液，加入150μL二甲基亞砜，振蕩混勻后于酶標(biāo)儀上測定490nm波長的吸光度。

2.4 藥物對氧化應(yīng)激損傷HUVEC細胞的影響

HUVEC細胞按5×103個/孔接種于96孔板，培養(yǎng)24h貼壁后將細胞隨機分為3組：正常對照組、H2O2氧化損傷組、實驗藥物組。其中實驗藥物組給藥保護24h后加入H2O2，作用4h后，去掉培養(yǎng)基，加入MTT，孵育4h后，吸棄上清液，加入150μL二甲基亞砜，振蕩混勻后于酶標(biāo)儀上測定490nm波長的吸光度，并計算細胞活力。

2.5 統(tǒng)計學(xué)處理

各組藥效數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組比較用方差分析法處理數(shù)據(jù)，以P值檢驗顯著性。

3 結(jié)果與討論

3.1 藥物濃度范圍的確定

如圖1所示，5種香豆素類成分在濃度為0.01μmol·L-1、0.1μmol·L-1、1μmol·L-1、5μmol·L-1內(nèi)無明顯細胞毒作用。5種藥物選擇以上濃度范圍可以排除藥物對HUVEC細胞的毒性損傷，不會影響細胞存活率，干擾實驗結(jié)果。因此，以下實驗選擇0.01μmol·L-1、0.1μmol·L-1、1μmol·L-1、5 mol·L-1劑量組進行實驗。

3.2 H2O2濃度的篩選

如圖2所示，正常HUVEC細胞生長狀態(tài)良好，貼壁較牢，細胞呈多角形或短梭形，大小均勻，邊界清楚，細胞間連接緊密，呈單層鋪路石樣鑲嵌排列。與正常細胞比較，H2O2損傷后細胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，表現(xiàn)為細胞排列紊亂，明顯梭形化，細胞邊緣模糊，并有明顯脫落現(xiàn)象。

如圖3所示，采用不同濃度的H2O2損傷后，細胞存活率有不同程度的降低，其中500μmol·L-1 H2O2孵育4h后，可以使HUVEC細胞的存活率降至50.6%，故確定此條件為OSI模型條件。

3.3 藥物對氧化應(yīng)激損傷HUVEC細胞的影響

實驗結(jié)果表明，H2O2可引起人臍靜脈內(nèi)皮活性降低，與正常對照組比較有顯著性差異（P<0.01），各給藥組可不同程度地抑制此損傷，在0.01～5μmol·L-1濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴關(guān)系，即隨著藥物濃度的增加，細胞存活率升高，結(jié)果見表1、圖4。

4 小結(jié)

近幾十年來，HUVEC細胞氧化應(yīng)急損傷是動脈粥樣硬化、高血壓和糖尿病等心血管疾病的重要組成部分，預(yù)防和治療內(nèi)皮OSI具有很重要的臨床意義。抗OSI的研究即將成為人類延緩衰老、預(yù)防疾病的重要課題[6]。本實驗結(jié)果表明，5種呋喃香豆素類成分具有一定的抗內(nèi)皮OSI作用，能夠在一定程度上保護HUVEC細胞結(jié)構(gòu)和功能的完整性，進而保護細胞免受過氧化損傷。這個結(jié)果為我們進一步研究明黨參根皮潛在的防治心腦血管疾病奠定了實驗基礎(chǔ)。

參考文獻：

[1]國家藥典委員會.中國藥典（2010年版一部）[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2011：195.

[2]傅立國.中國植物紅皮書-稀有瀕危植物[M].北京：科學(xué)出版社，1991：532.

[3]任東春，錢士輝，楊念云，等. 明黨參化學(xué)成分研究[J].中藥材，2008，31（1）：47.

[4]陳建偉，李祥，武露凌，等. 中國珍稀植物明黨參嫩莖葉揮發(fā)油化學(xué)成分研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2000，12（3）：48.

[5]顧源遠，陳建偉，李祥，等. 明黨參果實超臨界萃取部位化學(xué)成分研究[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2010，28（1）：75.

[6]Young IS， Woodside JV. Antioxidants in health and disease[J]. J Clin Pathol， 2001， 54（3）：176-186.